Anda di halaman 1dari 9

ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN INHIBITOR RNA

HELIKASE VIRUS HEPATITIS C DARI


KAPANG ENDOFIT CgKTm 5 F

1
Ervian Hadi Ramdani

1
Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor, Bogor, Indonesia

Abstrak
Hepatitis C merupakan penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus hepatitis C
(HCV), dan menjadi masalah kesehatan yang belum teratasi karena pengobatan yang
dilakukan memiliki efiseinsi yang rendah dan mahal. Pengobatan penyakit hepatitis C
berdasarkan molekul target banyak dikembangkan akhir-akhir ini, diantaranya mengarah
pada target RNA helikase virus hepatitis C. RNA helikase berfungsi dalam replikasi HCV,
sehingga penghambatannya dapat memutus siklus hidup virus ini. Penghambatan terhadap
RNA helikase dapat dilakukan oleh protein dari kapang endofit CgKTm 5 F. Untuk itu perlu
dilakukan isolasi dan pemurnian protein inhibitor dari kapang endofit CgKTm 5 F yang
mempunyai aktivitas inhibisi terhadap RNA helikase HCV. Isolasi dilakukan dengan
pengendapan amonium sulfat 90% dan pemurnian dilakukan dengan kromatografi gel filtrasi
Sephadex G-50 dengan pelarut metanol 40%. Uji ATPase digunakan untuk menghitung
aktivitas inhibisi RNA helikase HCV. Fraksi ke- 8 hasil kromatografi gel filtrasi memiliki
aktivitas tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV. Analisis SDS-PAGE terhadap
fraksi tersebut menunjukkan bahwa terdapat empat pita protein dan semuanya memiliki bobot
molekul > 17 kDa.

Kata Kunci : Hepatitis C, Kapang endofit, RNA Helikase, Protein Inhibitor

1.1 Latar Belakang

Hepatitis C merupakan penyakit yang disebabkan oleh virus hepatitis C (Hepatitis C
Virus atau HCV). Virus hepatitis C memiliki satu untai positif RNA, berpelindung, dan
berbentuk bola dengan diameter 50-60 nm (Borowski et al. 2008). Virus ini memiliki
tingkat virulensi yang tinggi. Sebanyak 180 juta jiwa penderita di seluruh dunia mengidap
penyakit ini dan bertambah setiap tahunnya.
Saat ini pengobatan yang diberikan kepada penderita penyakit hepatitis C yaitu terapi
interferon-alfa, ribavirin, dan kombinasi keduanya. Namun, pengobatan ini memiliki
beberapa kelemahan yaitu mahal dan memiliki efek samping.
Enzim RNA helikase HCV memiliki peranan penting dalam tahapan replikasi virus
ini yaitu membuka ikatan dupleks RNA virus agar dapat ditranslasikan (Borowski et al.
2008). RNA helikase memiliki tiga macam aktivitas, yaitu aktivitas pengikatan RNA,
pengikatan adenosine triphosphate (ATP), dan pembukaan rantai RNA (unwinding).
Apabila proses pembukaan ikatan dupleks RNA virus sebagai pustaka genetik tidak dapat
dilakukan, maka proses translasi informasi genetik tidak dapat berjalan sehingga siklus
hidup HCV terhenti. Oleh karena itu, enzim ini dapat dijadikan target obat yang potensial
untuk pengembangan dan penemuan obat anti HCV yang baru (Utama et al. 2000).
Protein metabolit sekunder dari isolat endofit CgKTm 5 F yang diisolasi dari tanaman
temu putih gombyok memiliki kemampuan menghambat RNA helikase HCV, sehingga
dapat dimanfaatkan sebagai obat bagi pasien yang terkena penyakit hepatitis C. Namun,
perlu dilakukan isolasi dan pemurnian terhadap protein inhibitor ini sehingga memiliki
efektifitas yang maksimal dalam menghambat kinerja RNA helikase.

1.2 Kapang Endofit
Endofit adalah mikroorganisme yang hidup di dalam tanaman tingkat tinggi. Bacon
dan White (2000) menyebutkan bahwa endofit merupakan mikroorganisme yang hidup
berkoloni di dalam jaringan tumbuhan tanpa menyebabkan efek negatif terhada tumbuhan
tersebut. Mikroorganisme yang banyak ditemukan hidup sebagai endofit adalah bakteri
dan kapang.
Isolat CgKTm 5 F merupakan kapang endofit yang diisolasi dari tanaman temu putih
Endofit ini termasuk ke dalam kelompok kapang dengan morfologi bulat (Gambar 1).
Temu putih (Curcuma zedoaria) dapat dijadikan sebagai obat antivirus (Chungsamarnyart
et al. 2007).
Suhu optimal yang dibutuhkan untuk pertumbuhan kapang berkiksar 25-30
o
C. Pada
umumnya kapang dapat tumbuh pada kisaran pH 2-8.5, akan tetapi pertumbuhannya akan
lebih baik pada kondisi pH rendah. Nilai pH optimum untuk pertumbuhan kapang
berkisar antara 6-7 (Fardiaz 1992).

Gambar 1. Kapang endofit CgKTm 5 F

1.3 Virus Hepatitis C
Virus hepatitis C (HCV) ditemukan pertama kali pada tahun 1989 dengan nama virus
hepatitis non-A dan non-B. Virus ini termasuk kedalam genus Hepacivirus dan famili
Flaviviridae. Genom HCV terdiri atas utas tunggal RNA sense positif yang berukuran
sekitar 9.6 kilobasa (kb). Virus ini berbentuk bulat, berpelindung, dan berdiameter sekitar
50-60 nm (Gambar 2) (Tellinghuisen 2007).
Protein struktural dari HCV terletak pada daerah N terminal. Protein nonstruktural
(NS) terdiri dari NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B. Protein nonstruktural
berperan dalam replikasi virus. Protein NS2 mempunyai aktivitas protease. Protein NS3
mempunyai dua aktivitas utama, yaitu serin protease dan NTPase atau helikase. Protein
NS4A berperan sebagai kofaktor serin protease NS3, sedangkan NS4B belum diketahui
fungsinya secara jelas. NS5A merupakan fosfoprotein yang fungsinya belum diketahui
secara jelas. Protein ini bersifat hidrofilik dan sangat sensitif terhadap interferon. NS5B
mempunyai peranan dalam aktivitas RNAdependent RNA polimerase (RdRp)
(Tellinghuisen 2007).

Gambar 2. Struktur virus hepatitis C (Moradpour et al. 2007)



1.4 RNA Helikase
Helikase adalah enzim yang berperan dalam membuka untai ganda nukleotida (DNA
atau RNA) menjadi untai tunggal. RNA helikase merupakan enzim yang membuka ikatan
dupleks RNA sense positif dengan antisense negatifnya menjadi untai tunggal. Enzim ini
pertama kali ditemukan pada Escherichia coli. Enzim ini bekerja secara katalitik dengan
memutus ikatan hidrogen yang terjadi antara kedua untai tersebut (Kadare & Haenni
1997). RNA helikase yang terdapat pada virus hepatitis C (HCV) dikodekan oleh protein
NS3 RNA helikase (Ceng et al. 2007). Enzim ini juga memiliki aktivitas ATPase dan
pengikatan terhadap untai RNA. Mekanisme kerja dari RNA helikase pertama-tama
adalah mengikat untai RNA pada ujung 3. ATP akan terikat pada sisi aktif enzim
tersebut dan dihidrolisis oleh RNA helikase menjadi ADP dan fosfat anorganik. Energi
yang dilepaskan digunakan oleh RNA helikase untuk membuka ikatan hidrogen pada
dupleks RNA. Enzim akan bergerak sepanjang arah 3-5 dalam memisahkan kedua untai
RNA dan berperan dalam proses translasi, pembentukan poliprotein, dan memutus
interaksi RNA dengan protein (Gambar 3) (Utama et al. 2000).
RNA helikase berperan penting dalam replikasi virus dapat dijadikan target dalam
pencarian obat HCV. Target pencarian obat dapat dilakukan dengan menghambat salah
satu aktivitas dari RNA helikase tersebut. Penghambatan dilakukan dengan mencari
inhibitor RNA helikase sehingga proses replikasi virus menjadi terhambat (Megawati
2008). Aktivitas ATPase dari RNA helikase lebih mudah digunakan sebagai target
pencarian obat antivirus. Hal tersebut dikarenakan substrat yang digunakan, yaitu ATP,
bersifat lebih stabil (Tellinghuisen 2007).

Gambar 3. Mekanisme kerja RNA helikase (Utama et al. 2000)

Untuk mendapatkan RNA helikase dengan kemurnian yang tinggi, maka perlu dilakukan
proses isolasi dan pemurnian. Berikut adalah diagram alir isolasi dan pemurnian RNA
helikase HCV

Gambar 4. Diagram alir proses isolasi dan pemurnian RNA helikase HCV





1.4.1 Isolasi RNA Helikase
Sebanyak 10 mL kultur E.coli pET BL21(DE3) pLysS yang membawa gen
NS3 RNA helikase HCV diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB cair yang
mengandung ampisilin. Selanjutnya, kultur tersebut diinkubasi di dalam inkubator
berpenggoyang pada suhu 37
o
C dengan kecepatan 200 rpm selama 30 menit. Setelah
30 menit kultur tersebut dihitung OD
600
. Apabila telah mencapai 0.3, maka
ditambahkan 0.3 M IPTG ke dalam kultur tersebut. Kultur E.coli selanjutnya
diinkubasi di dalam inkubator berpenggoyang dengan suhu 37
o
C dengan kecepatan
200 rpm selama 3 jam atau nilai OD
600
mencapai 1, kemudian kultur tersebut
disentrifugasi pada suhu 4
o
C dengan kecepatan 7000 g selama 10 menit. Pelet yang
diperoleh kemudian diresuspensikan kembali menggunakan 5 mL medium LB cair.
Selanjutnya, hasil resuspensi pelet tersebut disentrifugasi kembali pada suhu 4C
dengan kecepatan 7000 g selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan pada proses
sebelumnya diberi perlakuan pengeringbekuan (freeze & thawing) sebanyak 3 kali.
Hasil freeze thawing tersebut kemudian disonikasi (amplitudo 40; siklus 0.5; waktu 3
x 15 detik; interval waktu 1 menit). Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 12000
g, selama 10 menit, pada suhu 4
o
C. Pelet kemudian dibuang sedangkan supernatan
dikoleksi.

1.4.2 Pemurnian RNA Helikase
Supernatan hasil sentrifugasi pada tahap isolasi kemudian dicampur dengan
resin TALON yang telah diseimbangkan dengan buffer B. Resin TALON yang sudah
diseimbangkan kemudian dicampur dengan supernatan menggunakan pemutar selama
3 jam dalam ruang pendingin (4
o
C). Setelah itu, disentrifus selama 10 menit dengan
kecepaatan 5000 g pada suhu 4
o
C. Supernatan dibuang kemudian ditambahkan buffer
B sebanyak 15 ml, dan disentrifus kembali pada kecepatan 5000 g selama 7 menit.
Pelet kemudian ditambahkan bufer elusi dan diinkubasi semalam pada rotator yang
ditempatkan pada suhu 4
o
C. Setelah itu, supernatan diambil dan dipisahkan dari pelet
dengan sentrifugasi dengan kecepatan 5000 g selama 3 menit pada suhu 4
o
C.
Supernatan merupakan enzim RNA helikase yang telah dipurifikasi.
Kromatografi afinitas digunakan dalam tahapan pemurnian RNA helikase
HCV. Teknik ini dapat mengikat enzim RNA helikase HCV secara spesifik yang
terdapat pada supernatan hasil sonikasi. Resin yang digunakan pada tahapan ini yaitu
TALON logam afinitas yang secara spesifik dapat mengikat RNA helikase yang
memiliki penanda 6xHis-Tag. Pengikatan residu His 8 dilakukan oleh logam Co
2+

yang terdapat dalam resin TALON.
Semua tahapan isolasi dan pemurnian enzim RNA helikase di analisis
menggunakan SDS-PAGE untuk menentukan kemurnian dari enzim tersebut. Gambar
5 memperlihatkan enzim RNA helikase yang telah termurnikan memiliki ukuran
sebesar 54 kDA (E). Lajur inner volume (IV) terdapat banyak pita protein, karena
merupakan supernatan hasil sonikasi yang mengandung metabolit intraseluler yang
belum dimurnikan. Lajur washing 1 (W1) dan washing 2 (W2) merupakan bufer hasil
pencucian enzim. Kedua lajur tidak terdapat pita protein.

Gambar 5. Eletroforegram SDS-PAGE isolasi dan pemurnian RNA helikase HCV

1.4.3 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase
Pengujian aktivitas RNA helikase dilakukan dengan uji ATPase secara
kolorimetri (Utama et al. 2000). Pengujian ini dimaksudkan untuk mengukur jumlah
fosfat yang dilepaskan dari hidrolisis senyawa ATP menjadi ADP. Sebanyak 50 L
campuran reaksi yang dimasukkan ke dalam satu sumur mengandung 5 L 10 mM
bufer MOPS (pH 6.5), 1 mM ATP, 0.5 L 1 mM MgCl, 38.5 L H2O, dan 5 L RNA
helikase HCV. Campuran reaksi tersebut diinkubasikan di dalam 96-well microplate,
pada suhu ruang selama 45 menit. Setelah itu reaksi tersebut divisualisasikan
menggunakan pewarnaan dengan cara penambahan 100 L larutan pewarna pada
masing-masing sumur. Larutan pewarna yang digunakan merupakan campuran
0.081% hijau malakit, H20, 5.7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2.3%
polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Pewarnaan tersebut diinkubasi selama
5 menit. Setelah masa inkubasi dilakukan penghentian reaksi pewarnaan dengan
menambahkan 25 L natrium sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620
nm dengan referensi 405 nm


1.5 Protein Inhibitor RNA Helikase HCV
1.5.1 Isolasi Protein Inhibitor RNA Helikase
Masa inkubasi yang dibutuhkan oleh isolat kapang CgKTm 5 F untuk
menghasilkan protein inhibitor RNA helikase HCV optimum pada 7 hari. Hal ini
ditentukan berdasarkan perhitungan inhibisi protein tersebut terhadap RNA helikase
HCV setiap hari selama masa inkubasi. Masa inkubasi 7 hari merupakan masa
inkubasi yang paling optimum yang dibutuhkan oleh kapang isolat ini untuk
memproduksi protein tersebut dengan nilai inhibisi sebesar 85.86%.
Pemanenan protein inhibitor RNA helikase HCV yang dihasilkan oleh kapang
CgKTm 5 F dengan teknik sentrifugasi untuk memisahkan protein tersebut dengan sel
kapangnya. Supernatan selanjutnya digunakan untuk proses isolasi protein yang
mempunyai aktivitas inhibisi terhadap RNA helikase HCV.
Tahap isolasi protein dari fraksi supernatan diendapkan menggunakan
amonium sulfat. Pengendapan protein menggunakan amonium sulfat merupakan
teknik yang dapat memenuhi dua tujuan sekaligus yaitu pemurnian dan pengendapan
protein yang spesifik. Penggunaan amonium sulfat umum digunakan dalam proses
pengendapan ini karena memiliki beberapa kelebihan yaitu memiliki kelarutan yang
tinggi, tingkat toksisitas yang rendah untuk sebagian besar protein, murah, dan pada
beberapa kondisi memiliki efek penstabil pada protein. Protein akan terendapkan
karena molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin banyak. Hal ini
menyebabkan terjadinya penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein
sehingga mengakibatkan protein saling berinteraksi dan beragregasi (Scawen &
Melling 1985). Pengendapan protein target yang terdapat pada fraksi supernatan
dilakukan pada konsentrasi amonium sulfat 90% (w/v).
Protein yang terendapkan menggunakan amonium sulfat dilarutkan kembali
menggunakan larutan bufer Tris HCl pH 7.4 (Hairany 2010). Penggunaan bufer fosfat
tidak dapat dilakukan karena dapat mempengaruhi hasil perhitungan aktivitas inhibisi
RNA helikase HCV, karena menggunakan uji ATPase yang menghitung fosfat
anorganik yang bebas.

1.5.2 Pemurnian Protein Inhibitor RNA Helikase
Pemurnian protein inhibitor RNA helikase HCV dari kapang endofit CgKTm 5
F dilakukan dengan kromatografi gel filtrasi. Kromatografi gel filtrasi merupakan
teknik pemisahan campuran senyawa berdasarkan bobot molekulnya. Ukuran yang
dapat dipisahkan fase diam tergantung pada poros matriksnya. Fase diam yang
digunakan yaitu Sephadex G-50 dengan kemampuan memisahkan molekul protein
sampai 30 kDa. Fase gerak yang digunakan yaitu metanol 40%. Hasil dari pemisahan
protein menggunakan kolom kromatografi gel filtrasi didapatkan fraksi sebanyak 28
fraksi.

1.5.3 Uji Aktivitas Protein Inhibitor RNA Helikase
Semua fraksi yang didapatkan selanjutnya diuji aktivitas inhibisinya dengan
uji ATPase. Uji ATPase merupakan metode yang digunakan untuk menghitung
pelepasan fosfat anorganik yang berasal dari ATP dengan bantuan enzim ATPase.
Penggunaan uji ATPase pada penentuan aktivitas dari enzim RNA helikase HCV
karena enzim ini memiliki aktivitas yang distimulasi oleh ATP. Larutan campuran dan
larutan pewarna digunakan dalam uji ATPase.
Berdasarkan hasil uji ATPase didapatkan bahwa fraksi ke-8 mempunyai
aktivitas inhibisi RNA helikase HCV tertinggi sebesar 64.11% (Gambar 6). Kenaikan
aktivitas inhibisi terhadap RNA helikase HCV terjadi pada fraksi-fraksi awal. Hal ini
menunjukkan bahwa protein yang memiliki bobot molekul tinggi yang memiliki
aktivitas inhibisi terhadap RNA helikase HCV. Protein inhibitor tersebut diperkirakan
menghambat RNA helikase secara alosterik. Inhibitor menempel pada enzim selain di
situs katalitiknya sehingga merubah konfromasi enzim. Perubahan tersebut
menyebabkan interaksi enzim-substrat berkurang sehingga tidak ada produk yang
dihasilkan (Boroswki et al. 2008).

Gambar 6. Grafik aktivitas inhibisi protein inhibitor RNA helikase HCV hasil
kromatografi filtrasi gel

Fraksi terbaik hasil kolom kromatografi ini yaitu fraksi ke- 8 setelah dianalisis
menggunakan teknik SDS-PAGE memilki empat pita protein (Gambar 7). Semua pita
tersebut menunjukkan bahwa molekul protein yang terdapat pada fraksi ke-8 memiliki
bobot diatas 17 kDa. Hal ini dimungkinkan karena pada fraksi-fraksi awal yang
terpisahkan merupakan molekul yang memiliki bobot molekul besar. Bobot molekul
relatif dari keempat pita protein berturut turut yaitu 47.2 kDa, 31.9 kDa, 25.4 kDa,
dan 20.2 kDa untuk pita protein 1, 2, 3, dan 4.

Gambar 7. Elektroforegram protein inhibitor dari kapang CgKTm 5 F dari
fraksi ke-8
1.6 Kesimpulan
RNA helikase HCV yang telah dimurnikan memilki ukuran 54 kDa. Protein inhibitor
yang telah dimurnikan menggunakan kromatografi gel filtrasi dari kapang CgKTm 5 F dapat
menginhibisi RNA helikase dengan aktivitas inhibisi sebesar 64.11%. Protein tersebut
dipanen setelah masa inkubasi 7 dan diisolasi dengan ammonium sulfat 90% w/v. Protein
inhibitor tersebut mempunyai memiliki empat pita, dengan bobot 47.2 kDa, 31.9 kDa, 25.4
kDa, dan 20.2 kDa.