UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA MARINHA






Variabilidades temporal e espacial na produo de defesa qumica em
Laurencia filiformis (Rhodophyta) e suas implicaes na suscetibilidade
herbivoria



CAMILLA FERREIRA SOUZA


Dissertao de Mestrado apresentada ao
Programa de Ps-Graduao em Biologia
Marinha do Instituto de Biologia,
Departamento de Biologia Marinha da
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para a obteno do Grau
de Mestre em Biologia Marinha.

Orientador
Dr. Renato Crespo Pereira

Niteri, fevereiro de 2009
2
CAMILLA FERREIRA SOUZA
Aluna do Curso de Ps Graduao em Biologia Marinha da UFF
Matrcula M025.107.002






Variabilidades temporal e espacial na produo de defesa qumica em Laurencia
filiformis (Rhodophyta) e suas implicaes na suscetibilidade herbivoria






Dissertao de Mestrado apresentada ao
Programa de Ps-Graduao em Biologia
Marinha do Instituto de Biologia,
Departamento de Biologia Marinha da
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para a obteno do Grau
de Mestre em Biologia Marinha.




Orientador: Dr. Renato Crespo Pereira
Universidade Federal Fluminense - UFF

Niteri, fevereiro de 2009
3

Variabilidades temporal e espacial na produo de defesa qumica em Laurencia
filiformis (Rhodophyta) e suas implicaes na suscetibilidade herbivoria


Elaborado por Camilla Ferreira Souza
Aluna do Programa de Ps Graduao em Biologia Marinha da UFF

Analisada e aprovada com
grau: __________________



____________________________________
Dr. Renato Crespo Pereira
Instituto de Biologia Universidade Federal Fluminense

____________________________________
Dra. Angelica Ribeiro Soares
NUPEM Universidade Federal do Rio de Janeiro

____________________________________
Dr. Ricardo Coutinho
IEAPM Marinha do Brasil

____________________________________
Dr. Bernardo Antonio Perez da Gama (suplente)
Instituto de Biologia Universidade Federal Fluminense



Niteri, fevereiro de 2009




4
Ficha Catalogrfica

SOUZA, Camilla Ferreira

Variabilidades temporal e espacial na produo de defesa qumica em Laurencia
filiformis (Rhodophyta) e suas implicaes na suscetibilidade herbivoria. Niteri,
Universidade Federal Fluminense, Mestrado em Biologia Marinha, 2009. 72p


Dissertao: Mestre em Biologia Marinha.

1. Elatol
2. Herbvoros generalistas e especialistas
3. Defesa qumica

I Universidade Federal Fluminense, Departamento de Biologia Marinha.
II Ttulo.

















5






























toda minha famlia, especialmente
ao meu pai e minha me.


6




























Sonhos so gratuitos.
Transform-los em realidade tem um
preo
E. J. Gibs
7
Agradecimentos

Agradeo a Deus, por ser a minha segurana e minha fortaleza. Por te guiado
meus caminhos e derramado muitas bnos em minha vida, no de acordo com a
minha vontade, mas ao seu tempo. Hoje, eu percebo que tudo ocorrer no tempo certo!
Aos meus pais queridos, Romildo e Geruza, por serem meu porto seguro e por
sempre me apoiarem nas minhas decises, por estarem sempre ao meu lado, tanto nos
bons quantos nos maus momentos! Obrigada pelo total e irrestrito amor que vocs tm
por mim, e por proporcionarem, com muito esforo, o que julgamos ser as maiores
heranas, o estudo e o conhecimento! Agradeo tambm ao meu irmo, Bruno, pelo
carinho e amizade. Eu amo muito vocs!
minha famlia, que enorme, minhas avs e av, minha tia-bizav, meus
tios(as), meus primos(as), agregados, ao meu cachorro, o Nick, e ao Ferdinando, o meu
passarinho.
Ao meu namorado, Bernard, por estar ao meu lado por todos esses anos, em
todos os momentos, sem exceo (nem que seja para chorar e depois rir das lgrimas
derramadas sem ter real fundamento, n, amor?!)! Essa etapa da minha vida seria muito
mais difcil de ser concluda sem ter voc comigo! Obrigada por acreditar mais em mim
do que eu mesma, por toda a pacincia e amor que sempre demonstra por mim! Te amo
muito, B! Obrigada tambm sua famlia pelo apoio, carinho e ateno.
Ao meu orientador, Renato, por ter novamente me orientado, por ter confiado a
mim esse trabalho, por todos os inmeros ensinamentos e pelas muitas conversas
divertidas com os alunos na sala de computadores. Pode ter certeza que aprendi muito
com voc!
Dani, pela imensa ajuda na elaborao e realizao deste trabalho. Obrigada
pela pacincia (eu sei que dei trabalho! Hehehhehe) e por sempre estar disposta a me
ajudar e socorrer em todas as horas, principalmente, nos muitos momentos de
problemas com o CG! Enfim, obrigada por tudo!
Dra. Silvana Vianna Rodrigues, por ter cedido o espao de seu laboratrio
para a realizao das anlises e, alm disso, por sempre estar disposta a me auxiliar e
orientar nos momentos de dvidas e problemas com o CG. Obrigada por me ouvir nas
horas de desespero!
Ao Dr. Bernardo Antonio Perez da Gama, pelos toques e idias para a realizao
deste trabalho e pelas horas de descontrao durante o mestrado!
8
Ao Ph.D. Luiz Ricardo L. Simone, e ao doutorando Carlos Magenta da Cunha,
do Museu de Zoologia da USP pela identificao das lebres-do-mar.
Aos meus grandes amigos que sempre esto comigo e que so muito especiais na
minha vida. querida chuchu Glaucia, companheira de conversas, risadas e profunda
amizade. Ao Rogers que, com seu tom de voz caracterstico, sempre tem algo engraado
para dizer. Ao Dudu, por toda amizade, desde a graduao. Meire, por todo seu
carinho. Claudinha, por toda a ajuda (muitos vials lavados e etiquetados, e dias de
trabalho no CG) sempre com um sorriso no rosto e um forrozinho para amenizar a luta
diria. Ao Wilton, pela sua dedicao e amizade. E s amigas de sempre, Lvia e
Juliana, que esto do meu lado em todos os momentos da minha vida.
A todos os meus amigos do laboratrio e companheiros integrantes da SUAPA:
Aline, Andressa, Bernardo, Brito, Claudinha, Dani, Diana, Dudu, Erwan, verson,
Freddy, Glaucia, Gabi, Leo, Louisi, Magui, Meire, Natlia, Priscila, Renato, Rodrigo,
Rogers, Suzi, Valria e Wilton, que proporcionaram momentos maravilhosos de
trabalho e de descontrao durante as cervejas de sexta-feira no lab e histricos
churrascos Wiltons Play I, II, III e etc.
Aos amigos do laboratrio da Silvana: Juliana, Adriana, Carol, Lvia, Walter,
Gilmar, Iana, Eline, Karina, Nayara, Karinssima, Glauber e Rasa, por me acolherem e
por todos os momentos de felicidade que passei com vocs. Obrigada, em especial
Adriana, ao Gilmar e Lvia por me auxiliarem nas Aventuras de uma Biloga
Marinha num Laboratrio de Qumica Analtica.
Aos amigos, Ana, Claudinha, Dudu, Ecidine, Glucia, Leo e Rogers, que foram
ao campo e me ajudaram muito nas coletas de 24 h e dos ourios, e tornaram o trabalho
menos cansativo e muito mais divertido! Aline que coletou as lesmas-do-mar. Ao
amigo verson, que gentilmente desenhou a estrutura do elatol para mim.
Aos amigos Gerlinde, Tati, Roberta, Diego, Super, Juliana, Sheila, Natlia,
Brunno, Lcio, Priscila e Clia que tanto me incentivaram e proporcionaram momentos
to importantes na minha vida tanto profissional quanto pessoal.
A todos os professores, alunos, em especial os da minha turma, e funcionrios
do Programa de Ps-Graduao em Biologia Marinha da UFF.
Aos membros da banca Dra. Anglica Ribeiro Soares, Dr. Ricardo Coutinho e
Dr. Bernardo Antonio Perez da Gama que aceitaram o meu convite.
Enfim, agradeo a todos que fizeram e fazem parte da minha vida!
9
Resumo

O sesquiterpeno elatol o metablito secundrio majoritrio em espcimes brasileiros
de Laurencia filiformis, atuando como defesa qumica frente a herbvoros, mas
supostamente sua concentrao de ocorrncia no constante. A variao na
concentrao de elatol foi avaliada nos contextos de ciclo dirio, regime de mars e
profundidade, em espcimes de L. filiformis. As variaes dirias de elatol foram
avaliadas como defesa frente a herbvoro generalista, o ourio Lytechinus variegatus e
especialista, a lebre-do-mar Aplysia juliana. Foram selecionados 10 indivduos de L.
filiformis, dos quais foram obtidas sub-amostras (pequenos ramos) a cada 3 h para
avaliao da variao nos teores de elatol por 24 h e em funo da mar; para avaliao
do efeito da profundidade, foram coletados outros 10 indivduos localizados em duas
diferentes profundidades. As amostras obtidas destes indivduos foram submetidas
extrao em hexano, e o elatol quantificado atravs de CG-DCE. Foi observada
variao diria na produo do elatol, sendo o maior teor encontrado s 05:30 h, e o
menor durante tarde, s 17:30 h. Foi encontrada menor concentrao nos perodos de
mar alta e baixa, e maior produo de elatol durante a mar intermediria, enquanto
indivduos desta macroalga coletados em profundidades distintas no possuam teores
diferentes deste metablito. As baixas concentraes durante mars altas e baixas
sugerem que o ciclo de mars no o fator mais importante na determinao da
concentrao de elatol. A maior produo de elatol durante o perodo noturno pode ser
atribuda alocao de recursos entre o metabolismo primrio e secundrio, presena
de um ritmo biolgico circadiano ou diminuio da incidncia de luz. As
concentraes mxima e mnima no inibiram o consumo pela lebre-do-mar A. juliana,
mas impediram o consumo por L. variegatus. O maior teor de elatol no incio da manh
no parece ser em funo de presso de herbivoria, uma vez que ourios comumente
atuam mais durante noite e consumidores especialistas costumam se alimentar de
modo constante.
10
Abstract

The sesquiterpene elatol is the major secondary metabolite produced by Brazilian
specimens of Laurencia filiformis, acting as chemical defense against herbivores, but
probably its concentration is not constant. The variation of concentration of elatol was
evaluated in specimens of L. filiformis in the context of diel cycle, tidal levels and
depths. The diel variations were evaluated as defense against a generalist herbivore, the
sea urchin Lytechinus variegatus and one specialist, the sea hare Aplysia juliana. Ten
individuals of L. filiformis were selected, from which were obtained samples (small
branches) each 3h for evaluation of variation in amount of elatol during 24h and also
according to tidal level; for evaluation of depth effect, it was collected other 10
individuals located at two different depths. The samples obtained from these individuals
were submitted to extraction with hexane, and the elatol quantified by GC-ECD. It was
observed a diel variation in elatol production, encompassing high amount found at
05:30h, while low amount during the evening, at 17:30h. It was found low
concentration of elatol in both periods, during the low and high tides, and higher
production of elatol during intermediate tide, while individuals of this macroalga
collected in different depths not exhibit different amount of this metabolite. The low
concentrations observed during periods of high and low tides suggest that tide cycle is
not the most important factor to determine the concentration of elatol in L. filiformis.
The higher production of elatol during the night can related to allocation of resources
between primary and secondary metabolism, the presence of a circadian biological
rhythm or due to decrease of light incidence. The maximum and minimal concentrations
of elatol did not inhibit the consumption by A. juliana, but inhibited the consumption by
L. variegatus. The higher amount of elatol during early morning probably is not due to
herbivory pressure, since sea urchins usually are more active during the night and
specialists during all the time.


11
Sumrio
Pginas

1 Introduo............................................................................................................... 16
1.1 Defesas Qumicas e a Diviso Rhodophyta.................................................... 16
1.2 Gnero Laurencia J. V. Lamouroux (1813) e o Sesquiterpeno Elatol ........... 17
1.3 Variaes na Produo de Metablitos Secundrios...................................... 21
1.3.1 Fatores Abiticos.................................................................................... 21
1.3.2 Fatores Biticos ...................................................................................... 23
1.4 Importncia da Quantificao......................................................................... 24
1.5 Herbivoria....................................................................................................... 25
1.5.1 Herbvoros Generalistas ......................................................................... 27
1.5.2 Herbvoros Especialistas......................................................................... 28

2 Objetivos.................................................................................................................. 31
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 31
2.2 Objetivos Especficos ..................................................................................... 31

3 Hipteses.................................................................................................................. 31
4 Material e Mtodos................................................................................................. 32
4.1 rea de Estudo ............................................................................................... 32
4.2 Organismos Utilizados ................................................................................... 34
4.2.1 A Macroalga Laurencia filiformis .......................................................... 34
4.2.2 Ourio-do-mar Lytechinus variegatus.................................................... 35
4.2.3 Lebre-do-mar Aplysia juliana................................................................. 36
4.3 Variao Diria, Regime de Mars e Profundidade ....................................... 37
4.4 Procedimentos para Anlises das Amostras de L. filiformis .......................... 39
4.4.1 Extrao dos Metablitos Intra-talo ....................................................... 39
4.5 Quantificao do Sesquiterpeno Elatol........................................................... 39
4.5.1 Obteno do Padro................................................................................ 39
4.5.2 Quantificao do Elatol .......................................................................... 40
4.6 Variaes na Concentrao de Elatol x Herbivoria........................................ 42
4.6.1 Alimentos Artificiais .............................................................................. 42
4.6.2 Bioensaio com Herbvoro Generalista.................................................... 43
12
4.6.3 Bioensaio com Herbvoro Especialista................................................... 44
4.7 Anlise Estatstica .......................................................................................... 45

5 Resultados ............................................................................................................... 47
5.1 Peso mido x Peso seco.................................................................................. 47
5.2 Parmetros Ambientais................................................................................... 47
5.3 Cromatogramas............................................................................................... 48
5.4 Variao Diria............................................................................................... 50
5.5 Variao de Regime de Mars........................................................................ 51
5.6 Variao de Profundidade .............................................................................. 53
5.7 Bioensaios de Hebivoria................................................................................. 53
5.7.1 Herbvoro Generalista............................................................................. 53
5.7.2 Herbvoro Especialista............................................................................ 53

6 Discusso ................................................................................................................. 55
7 Concluses ............................................................................................................... 65
8 Perspectivas de Prximos Estudos ........................................................................ 65
9 Referncias Bibliogrficas ..................................................................................... 66
9.1 Artigos, Captulos de Livros e Livros ............................................................ 66
9.2 Mapa e sites .................................................................................................... 71
13
Lista de Figuras
Pginas
Figura 1 Molcula do elatol, metablito secundrio majoritrio de espcimes brasileiras
de Laurencia. .................................................................................................................. 19
Figura 2 Mapa indicando a localizao da praia da Azeda no municpio de Armao
dos Bzios ...................................................................................................................... 32
Figura 3 Costo esquerda na Praia da Azeda, Armao dos Bzios, RJ- Brasil. ....... 33
Figura 4 Um indivduo de Laurencia filiformis coletada na Praia da Azeda. ............... 35
Figura 5 O ourio-do-mar L. variegatus em seu habitat natural (Instituto de Biocincias
da USP, 2006)................................................................................................................. 35
Figura 6 Um exemplar do gnero Aplysia (CEBIMar -USP, 2008).............................. 36
Figura 7 Exemplar de um indivduo marcado para a realizao dos experimentos. ..... 37
Figura 8 Exemplo de uma curva analtica utilizada para a quantificao do elatol.
Concentraes utilizadas nesta curva: 0,75 ppm; 1,5 ppm; 3,0 ppm; 4,2 ppm e 6,0 ppm.
........................................................................................................................................ 42
Figura 9 A: Molde dos alimentos artificiais. B: Alimentos artificiais prontos para
oferecidos aos herbvoros. .............................................................................................. 43
Figura 10 Fotos do bioensaio com o ourio-do-mar L. variegatus ............................... 44
Figura 11 A: Exemplo de uma rplica do bioensaio de herbivoria com as aplisias. B:
Um indivduo consumindo o alimento artificial oferecido no bioensaio. ...................... 46
Figura 12 A:Variao da salinidade ao longo do perodo de amostragem. B: Variao
da temperatura ao longo do perodo de amostragem...................................................... 48
Figura 13 Cromatograma do padro de elatol de 6,0 ppm. ........................................... 49
Figura 14 Cromatograma de uma corrida em hexano, solvente de diluio das amostras.
........................................................................................................................................ 49
Figura 15 Cromatograma de uma corrida de hexano com diclorometano, adicionado
para facilitar a solubilizao do elatol. ........................................................................... 50
Figura 16 Cromatograma de uma amostra quantificada, com pico de elatol em 24,07
min. ................................................................................................................................. 50
Figura 17 Mdia do perfil dirio da produo do metablito secundrio elatol,
encontrado em cada indivduo. As barras representam + ou - o desvio-padro. ............ 51
14
Figura 18 Variao da produo do elatol de acordo com o regime de mars. Mar
Baixa- 0,1 a 0,5 metros; Mar Intermediria 0,7 metros; Mar Alta 0,8 a 1,2 metros.
As barras representam o desvio-padro.......................................................................... 52
Figura 19 Variao diria observada em L. filiformes e representao da variao de
mar durante o experimento. .......................................................................................... 52
Figura 20 Variao na produo de elatol de acordo com a profundidade das
macroalgas. Raso: 1m e Profundo: 3m. As barras representam o desvio-padro. ......... 53
Figura 21 Consumo por A. juliana das duas concentraes testadas. O consumo foi de
0,036 g para a concentrao menor e de 0,016 g para a concentrao maior. As barras
representam o desvio-padro. ......................................................................................... 54

15
Lista de Tabelas
Pginas
Tabela 1. Altura da mar no momento de cada amostragem......................................... 38















16
Introduo
1.1 Defesas Qumicas e a Diviso Rhodophyta
Como defesas qumicas, pode-se reunir um grande nmero de metablitos
secundrios, classificados de acordo com a via biossinttica da qual so derivados,
como, terpenos, substncias aromticas, acetogeninas, substncias derivadas de cidos
aminados e polifenis (Blunt et al., 2008 e revises prvias dessa srie). Embora muitas
destas substncias sejam conhecidas pela funo de defesa frente a herbvoros (Hay &
Fenical, 1988), tambm podem atuar inibindo organismos incrustantes e patgenos,
dentre diversas outras funes (Duffy & Hay, 1990).
Mais de 3.000 produtos naturais j foram isolados de macroalgas marinhas,
representando, aproximadamente, 20% de todos os metablitos secundrios encontrados
no ambiente marinho (Maschek & Baker, 2008, Blunt et al., 2008), compreendendo
uma enorme variedade de molculas produzidas pelas macroalgas marinhas verdes,
pardas e vermelhas.
Grande parte da diviso Rhodophyta (algas vermelhas) marinha e ocorre,
predominantemente, ao longo da plataforma continental e em reas costeiras de regies
tropicais, temperadas e de guas frias (Pereira & da Gama, 2008). So as mais ricas em
termos de abundncia e diversidade de produtos naturais dentre as divises de
macroalgas, uma vez que delas j foram isolados mais de 1.500 molculas. Com a
exceo dos florotaninos, todas as principais classes de produtos naturais esto
representadas nas algas vermelhas (Maschek & Baker, 2008). Mas, o que realmente
distingue as macroalgas vermelhas das outras divises o fato delas serem grandes
produtoras de metablitos halogenados, com mais de 90% destes produtos contendo
17
bromo ou cloro, enquanto as verdes apresentam 7% e as pardas possuem menos de 1%
(Harper et al., 2001).
1.2 Gnero Laurencia J. V. Lamouroux (1813) e o Sesquiterpeno Elatol

O gnero Laurencia (Ceramiales, Rhodophyta) foi criado para agrupar as algas
de colorao vermelho-prpura, pouco gelatinosas, com cistocarpos globosos presentes
nas extremidades dos ramos e rmulos. Desde a proposio deste gnero, muitas
espcies foram includas por diferentes autores e outras tantas, transferidas para
distintos gneros. Atualmente conhecido pela denominao de complexo Laurencia,
sendo neste includos trs gneros: Osmundea Stackhouse (1809), Chondrophycus (J.
Tokida & Y. Saito) Garbary & J.T. Harper 1998 e Laurencia (Fujii & Sentes, 2005).
O complexo Laurencia engloba uma grande variedade de espcies com grande
distribuio pelo mundo e com taxonomia bastante confusa. Amplamente distribudas
em mares temperados-quentes e tropicais, as espcies do gnero Laurencia sensu lato,
compreendem mais de 130 tipos estruturais morfologicamente complexos, cujos limites
de separao tm sido bastante confusos (Pereira & Teixeira, 1999; Fujii & Sentes,
2005). Evidncias morfolgicas e moleculares (anlises fitogenticas) esto sendo
utilizadas em estudos de taxonomia, corroborando a incluso dos trs gneros no
complexo Laurencia e auxiliando na taxonomia das espcies (Garbary & Harper, 1998;
Fujii et al., 2006; Diaz-Larrea et al., 2007).
Mais da metade (57%) dos metablitos secundrios conhecidos em macroalgas
da diviso Rhodophyta so produzidos por espcies da famlia Rhodomelaceae e a vasta
maioria (85%) destas substncias so encontradas no gnero Laurencia (Maschek &
Baker, 2008), sendo um dos mais prolficos na produo de metablitos secundrios,
compreendendo mais de 500 tipos moleculares distintos (Pereira & Teixeira, 1999;
Blunt et al., 2008 e revises prvias dessa srie). As algas deste gnero produzem uma
18
grande variedade de sesquiterpenos (C
15
) halogenados, ou no, acetogeninas (C
15
) e
alguns terpenos complexos (com C
20
ou mais). Os sesquiterpenos de Laurencia so
tipicamente cclicos, e, freqentemente, policclicos, com os anis conectados por
apenas um tomo (Maschek & Baker, 2008).
Diversos destes metablitos de espcies Laurencia so conhecidos por exibirem
muitas atividades biolgicas (Pereira & Teixeira, 1999) como antibacteriana (Vairappan
et al., 2008), antifngica (Knig & Wright, 1997), dentre outras. Por outro lado,
algumas substncias tambm atuam como mediadores qumicos em diversas interaes
ecolgicas, como defesa qumica contra herbvoros marinhos como peixes recifais (Hay
et al., 1987b; 1988c; Paul & Van Alstyne, 1988), os ourios-do-mar Diadema
antillarum (Hay et al., 1987b) e Lytechinus variegatus (Pereira et al., 2003), o
caranguejo Panchygrapsus transversus (Pereira et al., 2003) e os gastrpodes Littorina
strata e Osilinus atratus (Granado & Caballero, 1995), alm de inibir organismos
incrustantes (Pereira et al., 2003; Cassano et al., 2008).
Dentre os diversos sesquiterpenos produzidos por espcies de Laurencia, o elatol
destaca-se como de ampla distribuio em diversas espcies (Pereira, 1995). Elatol
possui dois elementos da famlia dos halognios: cloro e bromo (Figura 1), e ocorre
como leo transparente. Apresenta ponto de ebulio de 180 C (Capon et al., 1988;
Knig & Wright, 1997; Sudatti et al., 2008) representando aproximadamente 0,45% do
peso seco da alga em Laurencia obtusa do Brasil (Sudatti et al., 2008), com odor
bastante caracterstico. A anlise de Espectrometria de Massas de Alta Resoluo
fornece a frmula qumica C
15
H
22
BrClO com massa molecular de 332,0542 ( C, 53,99;
H, 6,65; Br, 23,95; Cl, 10,62; O, 4,79) (Sims, et al., 1974).
19

Figura 1 Molcula do elatol, metablito secundrio majoritrio de espcimes brasileiras de Laurencia.

Dentre diversas interaes ecolgicas onde atua como mediador, o elatol inibe o
estabelecimento do mexilho Perna perna em laboratrio (da Gama et al., 2003), no
campo, com atividade anti-incrustante frente a um amplo espectro de organismos (da
Gama et al., 2002) e inibe tambm o assentamento de larvas da craca Amphibalanus
amphitrite e do briozorio Bugula neritina (De Nys et al., 1996; Sudatti et al., 2008).
Alm disso, atua como defesa contra a herbivoria exercida pelo ourio-do-mar
Lytechinus variegatus e pelo caranguejo Pachygrapsus transversus (Pereira et al.,
2003).
As clulas corticais e, por vezes, tambm as medulares, assim como os
tricoblastos de espcies do gnero Laurencia contm incluses no usuais, chamadas
corpos em cereja. H dcadas, a correlao entre a presena de uma estrutura celular
no usual com a produo de grandes quantidades de metablitos halogenados, aliadas a
presena do halognio bromo nestas estruturas, eram fortes evidncias de que os corpos
em cereja seriam os locais de armazenamento de produtos naturais halogenados em
espcies de Laurencia (Young et al., 1980). Entretanto, somente evidncias recentes
comprovaram esta hiptese. Em Laurencia obtusa, foi constatado que os corpos em
cereja esto restritos s clulas corticais, e estas possuem conexes membranosas
parecidas com canais que conectam os corpos em cereja periferia da clula. Imagens
temporais seqenciais de clulas vivas demonstram a ocorrncia de um transporte de
20
vesculas dos corpos em cereja para a regio da parede celular (Salgado et al., 2008;
Sudatti et al., 2008). Salgado et al., (2008) demonstraram que o evento de morte celular
resultado da degradao dos corpos em cereja. Os autores sugerem que o transporte de
vesculas, ao longo das conexes tubulares e o evento de morte celular esto
relacionados com os mecanismos de exsudao de metablitos halogenados do talo para
a superfcie da macroalga e, consequentemente, com papel defensivo frente a herbvoros
e incrustantes.
As constataes sobre atuao do elatol em interaes ecolgicas so advindas
de bioensaios realizados com a concentrao natural deste sesquiterpeno presente em
todo o talo de Laurencia (e.g. Pereira et al., 2003). No entanto, o teor de elatol na
superfcie de L. obtusa muito inferior quele presente no interior do talo (Sudatti et
al., 2006). Esta concentrao de elatol de superfcie no foi capaz de inibir o
assentamento do mexilho Perna perna, de larvas do balandeo Balanus amphitrite,
bem como inibir o consumo pelo ourio Lytechinus variegatus (Sudatti et al., 2008).
As evidncias de que o elatol, armazenado nos corpos em cereja, pode chegar
superfcie de L. obtusa e de que a concentrao de superfcie pode ser baixa para inibir
incrustantes e herbvoros, ao contrrio das elevadas concentraes, suportam a
suposio de que a concentrao de elatol no uma caracterstica absoluta, mas
resultado de uma dinmica condicionada por aspectos desconhecidos. O presente
trabalho se insere justamente neste contexto, ao buscar uma explicao sobre quais
fatores contribuem para a dinmica da produo de metablitos em macroalgas
marinhas.

21
1.3 Variaes na Produo de Metablitos Secundrios
Em plantas terrestres, as variaes nos recursos ambientais necessrios ao
crescimento vm sendo invocadas para explicar a variao intra-especfica na
concentrao dos metablitos secundrios (Bryant et al., 1983).
No ambiente marinho, isso parece no ser diferente, uma vez que diversos
fatores do ambiente, tais como concentrao de nutrientes, pH, salinidade,
disponibilidade de luz, tolerncia dissecao e temperatura e movimentao da gua,
tambm so importantes na fisiologia de macroalgas (Lning et al., 1990). Assim, as
possveis variaes ambientais que podem estar relacionadas s alteraes nos teores de
metablitos secundrios em macroalgas incluem fatores abiticos e biticos. Mudanas
ambientais ao longo de 24 h, como alterao da disponibilidade de luz, temperatura,
presso de herbivoria, dentre outras, so comuns e podem influenciar na dinmica de
produo dos metablitos secundrios.
De uma maneira geral, estudos que visam avaliar as variaes na produo de
metablitos secundrios em macroalgas marinhas vm recebendo pouca ateno durante
muitos anos. Esta carncia foi apontada desde 1982, por Phillips & Towers, mas uma
situao que ainda persiste atualmente. Neste trabalho, os autores evidenciaram que
variaes temporais na abundncia de bromofenis de algas vermelhas ainda no
haviam sido estudadas naquela poca.
1.3.1 Fatores Abiticos
Existem poucos trabalhos que avaliam a dinmica de produo de metablitos
em macroalgas marinhas ou estudos que relacionem estas s diferenas existentes com
fatores ambientais. Dentre os fatores abiticos que tm sido considerados na tentativa
de explicar variaes de tipos e quantidades de metablitos secundrios em macroalgas
22
marinhas, podemos citar: exposio a raios UV, depleo de nutrientes, dessecao,
mudanas de temperatura, exposio ao ar, entre outros.
Muitas vezes, as evidncias em relao variabilidade na produo de
metablitos secundrios de macroalgas so indiretas, uma vez que se tratam de
observaes realizadas em amostras coletadas em diferentes locais e no pertencentes a
uma mesma populao (Hay, 1996). No entanto, essas observaes fornecem uma
indicao de que os teores destas substncias no so constantes para uma determinada
espcie.
Segundo Cronin & Hay (1996b), a concentrao de metablitos secundrios em
Dictyota ciliolata diminui quando esta macroalga cresce em locais com alta intensidade
de luz, provavelmente recebendo altos teores de radiao ultravioleta. De forma
contrastante, Puglisi & Paul (1997) observaram uma diminuio na concentrao do
terpenide ochotodeno em Portieria hornemannii durante experimentos feitos em
laboratrio com pouca luz, sugerindo que a intensidade luminosa possa ser um fator de
influncia na biossntese de monoterpenos.
Para algumas espcies de algas, o fator dessecao parece ser importante na
produo de metablitos secundrios. Aps sofrer dessecao, a macroalga parda no
palatvel Padina gymnospora tornou-se mais suscetvel herbivoria. Esse aumento na
suscetibilidade foi atribudo perda de defesas qumicas (Renaud et al., 1990).
Gerwick et al. (1985) encontraram diferenas quantitativas e qualitativas de
metablitos secundrios entre populaes de Stypopodium zonale relacionadas
profundidade e localidade onde essas algas ocorriam.
No presente trabalho, os fatores abiticos foram avaliados de forma direta
durante o experimento de variao de profundidade, no qual foi abordado o fator
intensidade de luz e no experimento de variao no regime de mars, onde a dessecao
23
(exposio ao ar) foi analisada. E, de forma indireta, ao investigar a variao diria
observamos tambm os possveis efeitos da exposio aos raios ultravioleta e da
variao luminosa.
A variao diria tambm extremamente pouco estudada. Em um dos poucos
trabalhos existentes sobre variao diria na produo de metablitos secundrios em
macroalgas (Hay et al., 1988a), foi verificado que os metablitos halimedatrial e
epihalimedatrial so produzidos principalmente ao longo da noite em Halimeda
incrassata. Por outro lado, o halimedatetraacetato foi encontrado em maiores
concentraes durante o incio do dia, reforando a hiptese de que a biosntese do
halimedatetraacetato dependente da fotossntese ou que este seja o periodo de maior
atividade dos diferentes herbvoros.
O ciclo dirio na produo de polifenis j foi observado por Abdala Daz et al.
2006 e Connan et al. (2007). A quantificao dos polifenis no muito precisa, pois o
mtodo colorimtrico apresenta problemas e os polifenis so componentes da parede
celular (Wallace & Fry, 1994), no sendo classificados apenas como metablitos
secundrios. Aliado a isso, este assunto ainda pouco investigado para halogenados e
outros metablitos secundrios.
1.3.2 Fatores Biticos
Os fatores biticos que podem interferir fortemente na dinmica de produo
dos metablitos secundrios em macroalgas marinhas so: a incrustao e a herbivoria.
As macroalgas apresentam uma grande variedade de metablitios com
propriedade anti-incrustante frente a muitos organismos marinhos, como algas
coralinceas crostosas e tufos de macroalgas, tunicados, hidrozorios, poliquetas, cracas
e bactrias (da Gama et al., 2002) Os efeitos da incrustao so menos conhecidos que
os da herbivoria, mas epibiontes podem diminuir a luz e os nutrientes que chegam
24
alga, influenciando indiretamente a abundncia, distribuio, produtividade e
reproduo das macroalgas (Orth & Van Montfrans, 1984). Adicionalmente, os
epibiontes podem atrair consumidores que no se alimentam normalmente da macroalga
hospedeira (Pereira, 2004). A herbivoria ser abordada mais detalhadamente, em um
tpico a parte (ver 1.5), uma vez que foi o fator bitico testado nos experimentos.
Variaes na composio de metablitos secundrios em populaes do gnero
Halimeda foram observadas por Paul & Van Alstyne (1988) onde indivduos que
cresciam em reas com grande presso de herbivoria apresentavam grande concentrao
de halimedatrial, um potente defensivo qumico contra herbvoros. Por sua vez, as
macroalgas que vivem em ambientes de baixa presso de herbivoria apresentaram
baixas concentraes de halimedatrial, o que pode significar a existncia de algum custo
na produo ou estocagem deste metablito.
Espcimes da alga parda Dictyota menstrualis, provenientes de localidades onde
o nmero de um de seus principais consumidores elevado, o anfpoda Ampithoe
longimana, apresentaram maiores concentraes de dictyol em relao aqueles de locais
com menor abundncia deste anfpoda (Cronin & Hay, 1996a). De uma maneira similar,
Van Alstyne (1988) props que a pastagem de Littorina sitkana em Fucus distichus
ocasionou um acrscimo nos teores de polifenis nas algas danificadas.
1.4 Importncia da Quantificao
O conhecimento da quantidade e variao dos metablitos secundrios em
organismos marinhos elemento essencial para estudos em ecologia qumica e para
coloc-los dentro dos contextos ecolgico e evolutivo (De Nys et al., 1995; 1998;
Schmiit et al., 1995; Hay et al., 1998).
Sendo assim, um dos maiores problemas encontrados pelos pesquisadores em
ecologia qumica marinha determinar a concentrao natural dos metablitos
25
secundrios e consequentemente a reproduo de concentraes realsticas que podem
ser aplicadas em bioensaios (Sudatti et al., 2006). Somente investigaes quantitativas
dos metablitos produzidos pelos organismos ou concentraes conhecidamente
realsticas de maneira ecolgica devem ser utilizadas em experimentos (Hay et al.,
1998).
1.5 Herbivoria
A herbivoria conhecida como um processo capaz de exercer um importante
papel sobre a abundncia e a distribuio das macroalgas em diversas comunidades
marinhas (Carpenter, 1986; Hay, 1997). Em recifes de corais, por exemplo, os
herbvoros so abundantes, diversos e afetam diretamente a composio especfica dos
produtores primrios (Hay et al., 1988a), sendo capazes de remover quase a totalidade
de biomassa diria produzida (Carpenter, 1986; Hay, 1996).
As macroalgas marinhas podem ser consumidas por uma diversa variedade de
herbvoros, que inclui os macro-herbvoros, animais de porte grande e com grande
mobilidade como, por exemplo, peixes, ourios-do-mar, gastrpodes e caranguejos, e os
meso-hebvoros, organismos pequenos e com baixa mobilidade relativa, em relao aos
macro-herbvoros, devido extenso percorrida durante um determinado perodo, como
anfpodas, ispodos e poliquetas. Em habitats tropicais, peixes e ourios-do-mar so os
que mais afetam a estrutura das comunidades de macroalgas marinhas, enquanto em
ambientes temperados, os ourios-do-mar e os gastrpodes so os consumidores mais
importantes (Carpenter, 1986).
Devido ao importante papel da herbivoria sobre a abundncia e a distribuio
das macroalgas, esses organismos desenvolveram uma grande variedade de estratgias
para minimizar as suas perdas e evitar que seus bancos sejam completamente
devastados pelo intenso consumo gerado pelos herbvoros (Duffy & Hay, 1990). Muitas
26
macroalgas podem deter os consumidores atravs de defesas qumicas, morfolgicas,
estruturais, por associao com outros organismos defendidos, ou por possurem baixa
qualidade nutricional (Hay & Fenical, 1988).
Os impactos de herbvoros em macroalgas j foram relativamente bem
estudados. Contudo, sabe-se muito pouco sobre como defesas qumicas de macroalgas
funcionam frente a herbvoros, e quais so seus papis exatos na estruturao das
comunidades marinhas (Pereira & da Gama, 2008).
As comunidades marinhas tropicais so conhecidas por possurem um grande
nmero de espcies de macroalgas (ver Lning, 1990; Kerswell, 2006), assim como
uma alta diversidade de herbvoros (Floeter et al., 2005) que exercem uma presso
intensa, constante e sem paralelo nas macroalgas, provavelmente selecionando-as,
durante a escala de tempo evolucionria, pela presena de diversas e eficientes defesas
qumicas (Pereira & da Gama, 2008). Neste cenrio de controle bottom-up, um
grande nmero de contra-adaptaes pode ser encontrado em herbvoros, incluindo
especializao alimentar e sequestro de defesas. Estas representam passos potenciais em
direo ao controle top-down de comunidades de macroalgas. No entanto, a suposio
de que a herbivoria , ou foi, a principal fora evolutiva direcionadora da produo de
metablitos secundrios em macroalgas ainda precisa ser mais claramente demonstrada
(Pereira & da Gama, 2008).
Se a funo do elatol ser um metablito secundrio com papel de proteo das
macroalgas frente herbivoria, esperado que a sua concentrao intratalo deva ser
maior no perodo de maior atividade dos herbvoros, principalmente aqueles que
exercem uma grande influncia na estrutura das comunidades marinhas. Sendo assim, o
presente trabalho tenta fornecer dados para que se possa comear a entender mais
claramente a raison d tre do sesquiterpeno elatol na macroalga Laurencia filiformis, e,
27
consequentemente, fornecer subsdios para o conhecimento da funo de outros
metablitos secundrios.
1.5.1 Herbvoros Generalistas
Em comunidades marinhas, herbvoros como peixes, ourios-do-mar, e alguns
gastrpodes so herbvoros dominantes (Carpenter, 1986) e a maioria dessas espcies
so consumidores extremamente generalistas. Os ourios-do-mar podem ser ainda mais
generalistas (Littler et al., 1983), alimentando-se de plantas marinhas e/ou algas
(Lawrence, 1975).
Para grande parte das espcies de ourios-do-mar, a seleo do alimento ocorre
em funo da preferncia alimentar e da disponibilidade do alimento para o consumo
(Cobb & Lawrence, 2005). Lowe (1975 apud Hay, 1992) depois de relatar que vrias
macroalgas e animais so consumidos pelo ourio-do-mar Lytechinus variegatus, notou
que este tambm come filtros de papel, cortia, borracha e queijo suo, ou seja, um
onvoro. De maneira similar, Hammer et al. (2004) observaram que a mesma espcie
consome uma variedade de organismos, sobretudo macroalgas, invertebrados, detritos e
material fecal. Porm, as macroalgas constituem seu principal alimento (Ruppert et al.,
2005). Cobb & Lawrence (2005) constataram que L. variegatus consome
principalmente grande diversidade de macroflora, exceto nos perodos onde a
abundncia de macrolagas est extremamente limitada, sendo herbvoros generalistas.
As presses de seleo de caractersticas evolutivas que detm os herbvoros
so, portanto, normalmente geradas por uma diversa assemblia de herbvoros
generalistas, com diferentes mobilidades, requerimentos de habitats, modos de
alimentao e fisiologias digestivas. Diante desse tipo de presso de herbivoria difusa, a
seleo deve favorecer defesas de macroalgas que so ativas frente ao grande nmero de
tipos de herbvoros (Hay, 1992). Visto que grupos nicos de herbvoros, como peixes e
28
ourios-do-mar, so capazes de consumir todas as macroalgas em alguns habitats
(Carpenter, 1986), a evoluo de mecanismos que detm herbvoros espcies-
especficos ou at grupos-especficos pode apresentar valor limitado, a no ser que elas
sejam casadas com defesas adicionais que detm outros herbvoros. Desta maneira, as
macroalgas comumente apresentam defesas integradas: defesas estruturais,
morfolgicas e qumicas (Hay & Fenical, 1988; Hay et al., 1988c; Paul & Van Alstyne,
1988).
1.5.2 Herbvoros Especialistas
A maioria dos herbvoros terrestres, particularmente os insetos, apresenta dieta
especialista. J no ambiente marinho, a maioria dos herbvoros parece ser generalista
(Hay, 1992). Uma exceo a este padro geral so os moluscos marinhos
opistobrnquios, conhecidos como lebres-do-mar (famlia Aplysiidae), que
normalmente se alimentam de apenas uma ou poucas espcies de algas (Pennings,
1990). Esta dieta freqentemente rica em algas produtoras de metablitos secundrios
(Pennings, 1990; Paul & Pennings, 1991; Faulkner, 1992). Estes animais adquirem e
sequestram estes metablitos de macroalgas e depois os utilizam como defesa frente a
seus predadores (Pennings, 1990; Paul & Pennings, 1991; Faulkner, 1992; Hay, 1992).
Rogers et al. (1995) afirmam que as lebres-do-mar so organismos teis para a
avaliao de teorias sobre a evoluo de alimentao especialista, pois aparentam ser a
exceo regra de herbvoros marinhos generalistas e porque normalmente vivem,
consomem e seqestram metablitos de algas ricas em produtos naturais. Alguns dos
fatores que afetam a evoluo da especializao alimentar citados por eles so:
1. Abundncia de alimento: Os herbvoros podem se especializar em plantas
abundantes e persistentes no tempo, porque uma fonte alimentar previsvel
29
permite aos herbvoros adaptar-se especificamente para utilizar o alimento
sem se arriscar a escassez da fonte alimentar.
2. Partilha de recurso: A especializao pode resultar da diviso do recurso.
Se a competio interespecfica por recursos resulta na reduo na
amplitude do nicho (especializao), quando as espcies se desenvolvem
para evitar a competio.
3. Qumica defensiva de plantas e coevoluo: Muitas plantas terrestres e
marinhas produzem metablitos secundrios que detm inimigos naturais,
como herbvoros e patgenos. As defesas qumicas em plantas podem
facilitar a especializao se os herbvoros desenvolvem morfologia
especfica ou adaptaes fisiolgicas em relao s defesas qumicas das
plantas hospedeiras, que resultam na reduo da capacidade de usar outras
hospedeiras.
4. Fuga e deteno de predadores: Pode facilitar a especializao de muitas
formas. Por exemplo, especialistas podem escapar da predao vivendo
em plantas txicas que inibem os predadores potenciais ou onvoros.
Alternativamente, especialistas podem diretamente deter predadores ao
incorporar os metablitos secundrios de plantas defendidas em seus
tecidos. Esta hiptese pressupe que especialistas so, de alguma maneira,
melhores ao seqestrar metablitos de uma mesma planta, do que os
generalistas. A especializao pode tambm ser favorecida, se os
especialistas se movem, entre as plantas hospedeiras, menos do que os
generalistas, deste modo, reduzindo o perodo de tempo no qual so
expostos aos predadores.
30
Para herbvoros pequenos e com pouca mobilidade, que so severamente
afetados por predadores, interessante viver em macroalgas que apresentem defesas
qumicas eficientes frente aos grandes herbvoros, uma vez que estas macroalgas se
tornam microhabitats seguros e fonte de alimento (Hay, 1992).
Muitas evidncias indicam que as lebres-do-mar so protegidas da predao pelo
xito do uso da qumica obtida de sua alimentao baseada em macroalgas, pois
representam baixo custo para obt-las. Embora estejam dentro do grupo dos maiores
moluscos marinhos, as lebres-do-mar so pobremente providas com defesas fsicas. Elas
apresentam uma concha vestigial encoberta pelo manto e, portanto, tm pequeno ou
nenhum valor defensivo. Apresentam movimentao lenta, mesmo quando nadam, e
raramente deixam o banco de macroalgas no qual se alimentam (Faulkner, 1992).
A camuflagem no convencionalmente considerada como uma propriedade
qumica, mas existem evidncias de que a gama de pigmentao de algumas lebres-do-
mar seja devido deposio de pigmentos de algas. Para pequenas lebres-do-mar, o uso
de pigmentos das algas para prover camuflagem pode ser um importante mtodo para
evitar a predao, se o predador depende de pistas visuais (Faulkner, 1992).
A secreo da glndula de tinta o mecanismo de defesa mais bvio, mas nem
todas as espcies de lebres-do-mar so capazes de produzi-la. A produo da tinta
depende da presena de algas vermelhas na dieta da lebre-do-mar. A colorao roxa da
tinta devido a um pigmento violeta caracterstico de algas vermelhas, chamado
aplisioviolina. possvel que existam defesas qumicas nas tintas tambm (Faulkner,
1992). Substncias obtidas da alimentao composta por macroalgas armazenadas nas
glndulas digestivas so transportadas para a pele do animal, funcionando como defesas
qumicas (Faulkner, 1992).

31
2 Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a dinmica da produo de metablitos secundrios na macroalga
Laurencia filiformis, em relao s variaes temporal e espacial, atravs de
avaliao quantitativa do sesquiterpeno elatol.
2.2 Objetivos Especficos
Averiguar a existncia de variao diria na produo do elatol, metablito
secundrio majoritrio em L. filiformis;
Avaliar, por mtodo quantitativo, a dinmica de produo de elatol relacionada a
regime de mars e profundidade;
Verificar, quando encontradas, se as variaes de teores de elatol afetam a
suscetibilidade da macroalga em interaes com herbivoria.
3 Hipteses
1. H
1.1
: Existe dinmica diria na produo do elatol.
2. H
1.2
: A dinmica de produo do elatol est relacionada ao regime de mars e
profundidade.
3. H
1.3
: As variaes na produo do elatol afetam a suscetiblidade da macroalga
herbivoria.
32
4 Material e Mtodos
4.1 rea de Estudo
A cidade de Armao dos Bzios est localizada na poro sudeste do Estado do
Rio de Janeiro, na regio das Baixadas Litorneas (conhecida popularmente como
regio dos Lagos), entre as coordenadas 2230 e 23S e 4152 e 4242W (Figura 2).
Ocupa uma rea de 71,7 km
2
(CIDE, 2001) e faz limites com o Municpio de Cabo Frio
e com o Oceano Atlntico.













Figura 2 Mapa indicando a localizao da praia da Azeda no municpio de Armao dos Bzios
(adaptao do Mapa 05 da Secretaria de Planejamento e Urbanismo de Armao dos Bzios
para o Plano Diretor de Uso do Solo - BZIOS, 2002).

Praia da
Azeda
33
O local de estudo foi o costo esquerdo da Praia da Azeda localizada prxima a
praia dos Ossos (Figura 2), no municpio de Armao dos Bzios (Figura 3). Trata-se
de uma praia com guas, na maior parte do tempo, calmas e claras. Apresenta uma faixa
de areia bastante estreita, durante a mar alta, e possui aproximadamente 200 m de
extenso.

Figura 3 Costo esquerda na Praia da Azeda, Armao dos Bzios, RJ- Brasil.

O costo esquerdo apresenta uma leve inclinao, o que facilitou o acesso
durante o perodo noturno. A escolha deste local baseou-se na ocorrncia, durante os
meses de vero, de indivduos grandes e frondosos de Laurencia filiformis que
produzem elatol como metablito majoritrio, caractersticas estas que viabilizaram a
realizao dos experimentos.
O banco de macroalgas presente no costo esquerdo predominantemente
formado por macroalgas pardas do gnero Sargassum. A distribuio de L. filiformis
no homognea, de modo que no ponto de coleta os indivduos dessa espcie se
apresentam em mais ou menos 60 indivduos espaados, com faixa de ocorrncia de
3,20 m de extenso (regio do infralitoral) e distribudos perpendicularmente ao costo,
resultando em espcimes vivendo em profundidades distintas. Ao longo do costo
rochoso possvel observar alguns indivduos de L. filiformis isolados.
34
Alguns parmetros ambientais, importantes para a fisiologia das macroalgas, que
podem influenciar os nveis de metablitos secundrios, como temperatura do ar e da
gua, salinidade e pH (Lning et al., 1990) foram monitorados. A temperatura da gua
foi medida utilizando um termmetro, a salinidade por meio de um refratmetro, o pH
pela utilizao de um medidor porttil de pH, e a temperatura para o municpio de
Armao dos Bzios obtida pelo site Climatempo.
Os experiementos ocorreram nos dias 21 e 22 de fevereiro de 2008, ou seja,
perodo correspondente ao vero no hemisfrio sul. Porm, nestes dias, o sol no estava
to forte como em dia tpico de vero. No primeiro dia, o tempo estava nublado
ocorrendo perodos de chuva no muito intensa. J no dia 22 no choveu e o sol
apareceu atrs de muitas nuvens.

4.2 Organismos Utilizados
4.2.1 A Macroalga Laurencia filiformis
Laurencia filiformis (Figura 4) (C. Agardh) Montagne possui talo ereto em
densos tufos, resistente, cartilaginoso, com at 30 cm de altura, de colorao marrom-
violcea a esverdeada; fixas ao substrato por meio de uma estrutura formada pela
agregao de apressrios discides; apresenta ramificaes dicotmicas perto da base e
alternadas no pice. Os eixos primrios so numerosos. As ramificaes secundrias
so numerosas ou esparsas, cilndricas, alternadas ou irregulares (Littler & Littler, 2000;
Fujii & Sentes, 2005).
uma espcie comum em substratos duros, na regio entremars, sendo
encontrada desde a zona superior do mesolitoral at a franja do infralitoral, em locais
sujeitos ao das ondas e em locais calmos, porm, com constante repuxo e refluxo de
35
ondas. Apresenta variaes morfolgicas dependendo do ambiente no qual vive (Littler
& Littler, 2000; Fujii & Sentes, 2005).

Figura 4 Um indivduo de Laurencia filiformis coletada na Praia da Azeda.

4.2.2 Ourio-do-mar Lytechinus variegatus
O ourio-do-mar L. variegatus (Figura 5) ocorre em guas rasas, desde a regio
da Carolina do Norte (Estados Unidos) at Santos (Brasil), compreendendo todo Caribe,
o Golfo do Mxico (Hill & Lawrence, 2003) e nas ilhas de Bermuda e Cabo Verde
(Moore et al., 1963). Esta espcie vive em bancos de gramas marinhas, mas tambm
pode ocorrer em costes rochosos, terrenos formados por pedaos de conchas,
substratos arenosos e lodosos e em fundos consolidados (Hill & Lawrence, 2003).

Figura 5 O ourio-do-mar L. variegatus em seu habitat natural (Instituto de Biocincias da USP, 2006).
36

A morfologia externa variada, pois L. variegatus pode apresentar espinhos de
colorao quase branca, verde, roxa ou vermelho-amarronzada e raramente os ps
ambulacrrios podem apresentar uma colorao diferente do resto do corpo (Moore et
al., 1963).
No presente estudo, escolheu-se L. variegatus, por ser esta uma espcie
generalista, com ampla distribuio no litoral brasileiro, com grande relevncia na teia
trfica marinha, com enorme voracidade e um importante componente na interao
macroalga-herbvoro. Alm disso, de fcil manuteno em laboratrio, facilitando a
realizao dos ensaios biolgicos.
4.2.3 Lebre-do-mar Aplysia juliana
Os animais do gnero Aplysia (Figura 6), conhecidos popularmente como lebres-
do-mar, pertencem subclasse Opisthobranchia, e so gastrpodos herbvoros
predominantemente marinhos. Apresentam concha reduzida, que fica imersa no manto
ou completamente perdida (Ruppert et al., 2005).

Figura 6 Um exemplar do gnero Aplysia (CEBIMar -USP, 2008).

Dorsolateralmente o p modifica-se em expanses denominadas parapdios,
amplamente separadas na regio anterior e aproximadas na posterior. Algumas lebres-
37
do-mar nadam usando de ondulaes rtmicas dos parapdios laterais. Algumas so
capazes de deslocamentos por propulso a jatos dgua. Quando perturbadas, muitas
liberam uma tinta defensiva de colorao violcea, derivada de substncias obtidas das
macroalgas das quais se alimentam. Essa tinta fica armazenada na glndula prpura,
localizada logo abaixo da concha (Ruppert et al., 2005).
4.3 Variao Diria, Regime de Mars e Profundidade
Para a verificao da variao diria, 10 indivduos de L. filiformis, encontrados
na regio intermediria (em relao a profundidade) do banco da macroalga, foram
marcados. Essa identificao deu-se aps raspagem, com uma escova de ao, de uma
pequena parte do costo imediatamente prximo a cada indivduo, e posterior fixao de
um pequeno pedao de placa de PVC com um o nmero do indivduo, com resina epoxi
de uso naval da marca Tubolit (Figura 7).

Figura 7 Exemplar de um indivduo marcado para a realizao dos experimentos.

Posteriormente, de cada espcime marcada foi retirado um ramo em intervalos
de trs horas, durante o perodo de 24 horas, totalizando oito amostragens com 10
rplicas. Os horrios de amostragens foram: 11:30 h; 14:30 h; 17:30 h; 20:30 h; 23:30 h;
02:30 h; 05:30 h e 08:30 h.
38
Sudatti et al., (2006) observaram que a concentrao do elatol varia entre
indivduos de uma mesma populao. Sendo assim, optou-se por utilizar os mesmos
indivduos durante as vrias amostragens, objetivando minimizar o efeito da variao
intra-populacional.
Nos dias de experimento o perodo de mar variou de 0,1 a 1,2 m. Deste modo,
as mesmas amostras foram utilizadas para avaliar uma possvel relao da produo de
elatol com o regime de mar. Para isso, foi calculada a altura da mar para cada horrio
de amostragem (Tabela 1). Os dados de mar foram agrupados , de modo que como
mar alta foram classificadas as amostras coletadas quando a mar estava em 0,8 a 1,2
m, mar baixa em 0,1 a 0,5 m e mar intermediria em 0,7 m.

Tabela 1. Altura da mar no momento de cada amostragem.
Horrio de Amostragem (h) Altura da Mar (m)
11:30 0,7
14:30 1,2
17:30 0,8
20:30 0,1
23:30 0,5
02:30 1,1
05:30 0,7
08:30 0,3

Durante a verificao da variao com relao profundidade, s 9:00 h do
segundo dia de experimento foram selecionados dez indivduos na regio superior
(raso), os quais cresciam a um metro da faixa de ocorrncia e dez indivduos na regio
inferior (profundo), que cresciam trs metros. Apenas um ramo de cada espcime foi
retirado para a quantificao do elatol, visando evitar a remoo de muitos indivduos
de uma pequena populao de L. filiformis. Esta estreita variao de profundidade
representa o limite de distribuio vertical desta macroalga na praia da Azeda.
39
4.4 Procedimentos Para Anlises das Amostras de L. filiformis
4.4.1 Extrao dos Metablitos Intra-talo
Os ramos obtidos durante os experimentos foram armazenados e transportados
em frascos de vidro at o laboratrio de Produtos Naturais Marinhos e Ecologia
Qumica Marinha UFF, onde tiveram seus pesos midos aferidos e seus metablitos
totais extrados.
Foram coletados seis ramos de indivduos de L. filiformis e seus pesos midos e
secos foram aferidos, visando determinao da razo entre os dois. Aps determinao
da razo entre peso seco e peso mido, a concentrao de elatol foi expressa em g de
elatol/mg de peso seco da macroalga, pois nas amostras somente foram aferidos os
pesos midos.
Em cada amostra foram realizadas trs extraes, de 15 em 15 dias, com o
solvente orgnico hexano (grau HPLC). O volume de solvente, a cada extrao, foi de
15 ml. Aps cada extrao os resduos foram filtrados e os extratos obtidos levados
secura, totalizando um perodo de 45 dias de extrao.
4.5 Quantificao do Sesquiterpeno Elatol
4.5.1 Obteno do Padro
Frondes de L. filiformis foram coletadas, secas temperatura ambiente e longe
de luz, buscando evitar a fotodegradao. Tais frondes foram reservadas, visando
exclusivamente a obteno do padro para as anlises de quantificao do elatol e para
os experimentos de herbivoria. O extrato bruto destas frondes foi obtido por extrao
em hexano (grau HPLC), seguido por filtrao e evaporao sob temperatura ambiente.
40
Optou-se pela utilizao do hexano, pois foram realizadas extraes dos
metabolitos de superfcie das mesmas amostras utilizadas no presente trabalho, para
estudos posteriores. Segundo De Nys et al. (1996) este solvente no promove o
rompimento das clulas intra-talo, quando colocado em contato com a alga por 40s.
O isolamento do elatol foi feito por Cromatografia em Camada Preparativa, na
qual uma mistura de 60 ml de gua destilada e 25 g de slica gel 60 PF
254
(Merck) foi
aplicada sobre placas de vidro. O rendimento foi de duas placas de 20 x 20 cm. A faixa
de slica (rf) onde se observou o metablito em questo foi removida por raspagem e
filtrada, com papel de filtro, em hexano, para extrao do elatol (Sudatti et al., 2006).
A certificao da presena do elatol e sua pureza foram avaliadas com o auxlio
de duas tcnicas: Cromatografia em Camada Delgada (CCD: Cromatofolhas Merck Al
TLC 20 x 20 cm slica gel 60F
254
) e Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio
(RMN
1
H). Os resultados foram comparados com dados da literatura (Knig & Wright,
1997). O elatol purificado foi utilizado como um padro externo (ver item 4.5.2) para a
quantificao das amostras obtidas nos experimentos, bem como nos bioensaios de
herbivoria.
4.5.2 Quantificao do Elatol
A quantificao do elatol presente nos extratos brutos de cada amostra foi
realizada sob a superviso e no laboratrio da Prof
a
. Dr
a
. Silvana Vianna Rodrigues,
Departamento de Qumica Analtica na Universidade Federal Fluminense. O mtodo
utilizado foi a Cromatografia Gasosa associada ao Detector de Captura de Eltrons
(CG-DCE) atravs de padronizao externa. A metodologia descrita por Sudatti et al.
(2006) foi modificada para adequao mudana no modo de injeo on column para
split. As condies cromatogrficas foram as seguintes:
Gs de arraste: hlio grau analtico, marca AGA ou WHITE MARTINS
41
Gs de make-up e purga: nitrognio grau analtico 5.0 ECD, marca AGA ou
WHITE MARTINS. Vazo de make-up 80 kPa e de purga 3,0 ml/min.
Coluna capilar WCOT, slica fundida, 0,25 m de fase estacionria RTX-5 (5%
de fenil, 95% dimetilpolisilosano), 30 m de comprimento por 0,25 mm de
dimetro, marca Restek.
Programao de temperatura: 40
0
C por 1 min; 10
0
C/min at 300
0
C, 5 min;
25
0
C/min at 40
0
C.
Temperatura do detector: 320
0
C.
Injeo: Automtica do tipo Split (razo de split 10,0) com o injetor na
temperatura de 250C. Volume injetado 1,0 l (seringa Hamilton, capacidade 10
l)
Presso de injeo de 54,1 kPa, Fluxo total de 21,1 ml/min, Fluxo da coluna de
1,64 ml/min.
Velocidade do gs de arraste: 27,9 cm/sec.
Uma frao do elatol purificado foi pesada e, a partir de sua massa, foram
preparadas sete solues sucessivas com concentraes que variaram de 0,75 ppm a 6,0
ppm. soluo estoque, ou seja, a inicial e mais concentrada, foram adicionadas
algumas gotas de diclorometano, visando a melhor solubilizao do material, evitando
assim erros nas concentraes. Foram geradas curvas analticas de cinco pontos, para as
quais cinco destas solues foram injetadas no cromatgrafo (Figura 8), possibilitando a
quantificao do elatol.
Seguindo a certificao do EPA, no incio de cada dia de anlise, pelo menos
dois pontos da curva eram injetados e comparados com a curva anterior. Sempre que os
valores obtidos pelos padres excederam mais de 15% de erro, uma nova curva foi
construda.
42
Curva Analtica
y = 43894x + 12622
R
2
= 0,9971
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentrao (ppm)

r
e
a

(

V
o
t
s
)

Figura 8 Exemplo de uma curva analtica utilizada para a quantificao do elatol. Concentraes
utilizadas nesta curva: 0,75 ppm; 1,5 ppm; 3,0 ppm; 4,2 ppm e 6,0 ppm.

As amostras foram avolumadas 5 ml de hexano e diludas 11, 50, 100 e 200
vezes para que as reas obtidas estivessem dentro do intervalo da curva analtica,
possibilitando a quantificao.
4.6 Variaes na Concentrao de Elatol x Herbivoria
As variaes na concentrao de elatol, verificadas nos experimentos realizados
no campo, foram relacionadas s interaes biolgicas atravs de ensaios com
diferentes herbvoros, um generalista e outro especialista.
4.6.1 Alimentos Artificiais
A maior e a menor concentrao de elatol encontradas no experimento de
variao diria na concentrao deste metablito foram incorporadas em alimentos
artificiais e oferecidas ao ourio-do-mar L. variegatus e lebre-do-mar A. juliana.
Os alimentos artificiais foram preparados segundo adaptaes do mtodo
descrito por Hay et al. (1994). O elatol foi incorporado, aps dissoluo em
diclorometano, a 1g de p de Ulva sp. Aps a evaporao do solvente, foram
43
adicionados ao p 6ml de gua destilada. Em seguida, a mistura composta por gar
(0,45 g) foi aquecida em forno microondas com 10 ml gua destilada e, aps um leve
esfriamento, a ela foi adicionada a mistura de p de Ulva sp e gua. Essa mistura foi
cuidadosamente vertida em um molde que contm, na parte inferior, uma tela plstica
com malha uniforme de 10 x 10 mm, com dez pequenos quadrados. Aps o
resfriamento do gar e a completa adeso da mistura tela, foram cortadas tiras
contendo os alimentos artificiais, cada um deles com 100 quadrados, permitindo a
quantificao do material consumido pelos animais atravs do nmero de quadrados
consumidos (Figura 10). Alimentos com concentrao maior e concentrao menor
foram preparados em uma mesma tela, em posies paralelas para que aps o corte das
tiras, eles ficassem prximos e igualmente acessveis ao consumidor (Figura 9).

A B
Figura 9 A: Molde dos alimentos artificiais. B: Alimentos artificiais prontos para oferecidos aos
herbvoros.

4.6.2 Bioensaio com Herbvoro Generalista
Os espcimes do ourio-do-mar Lytechinus variegatus foram coletados, por
mergulho livre, no infralitoral da enseada de Itaipu, Niteri - RJ. Estes foram mantidos
44
em aqurios com gua do mar, aerao e temperatura controlada, sendo a eles oferecida
a clorofcea Ulva sp. como alimento, por intervalo de tempo de aproximadamente sete
dias. Este perodo se fez necessrio para que houvesse uma aclimatao dos animais
frente s novas condies oferecidas no laboratrio, distintas daquelas presentes em seu
habitat natural, evitando possveis estresses como, por exemplo, a liberao de gametas
que inviabiliza a realizao do bioensaio.
Antes de ser realizado o bioensaio, foram oferecidos os alimentos artificiais
somente com o p de Ulva sp. (sem o elatol) aos ourios-do-mar. Somente os animais
que estavam ativos, ou seja, que consumiram o alimento num perodo inferior a 20 h
foram selecionados para a realizao do bioensaio. Este teve a durao de 20 h e o
consumo foi mensurado atravs da contagem do nmero de quadrados da malha
consumidos em cada rplica. Foram utilizadas 22 rplicas (Figura 10).

Figura 10 Fotos do bioensaio com o ourio-do-mar L. variegatus

4.6.3 Bioensaio com Herbvoro Especialista
As lebres-do-mar juvenis, medindo aproximadamente de 3 a 6 cm, da espcie
Aplysia juliana foram coletadas associadas ramos de L. filiformis na praia do Forno,
Armao dos Bzios RJ. Estes moluscos foram mantidos em potes de plstico com
gua do mar e com aerao constante, por aproximadamente uma semana. Durante o
45
perodo de aclimatao, diferentemente dos ourios-do-mar, a alimentao destes foi
mantida prxima a natural, ou seja, com a prpia macroalga L. filiformis.
Como as lebres-do-mar eram animais pequenos, o efeito do consumo no foi
visvel a ponto de originar pontos da tela sem o alimento, inviabilizando a utilizao o
mtodo de quantificao do consumo atravs do nmero de quadrados consumidos.
Ento, alternativamente, os alimentos artificiais foram pesados antes e depois da
realizao do bioensaio e o consumo foi mensurado para diferena entre os pesos inicial
e final. O bioensaio realizado teve 11 rplicas e durao de 20 h (Figura 11 A e B).
4.7 Anlise Estatstica
As anlises dos dados obtidos foram realizadas no programa Statistica. A
normalidade foi avaliada atravs do teste de Normalidade Shapiro-Wilk e a
homocedasticidade atravs do teste de homogeneidade de varincias de Levene.
Para os experimentos de variao diria e de mar foi realizado o Teste de
Friedman ANOVA com = 0,05. Para o experimento de profundidade o teste
estatstico utilizado foi o teste t para amostras independentes e para os bioensaios de
herbivoria o teste realizado foi o teste t para amostras dependentes, todos com = 0,05.









46

A

B
Figura 11 A: Exemplo de uma rplica do bioensaio de herbivoria com as aplisias. B: Um indivduo
consumindo o alimento artificial oferecido no bioensaio.
47
5 Resultados
5.1 Peso mido x Peso seco
Pela comparao entre as mdias de peso seco (858,8 mg) e de peso mido
(4.328,4 mg) foi possvel calcular a porcentagem de gua presente na macroalga. Sendo
assim, foi verificado que em torno de 80% da macroalga L. filiformis correspondia a
gua.
5.2 Parmetros Ambientais
Durante os experimentos de campo, a salinidade variou de 34 a 36 (Figura 12 A)
e a temperatura da gua oscilou de 22C a 24C (Figura 12 B).
11:30 14:30 17:30 20:30 23:30 02:30 05:30 08:30
32
33
34
35
36
37
S
a
l
i
n
i
d
a
d
e
Horrio (hh:mm)

A
48
11:30 14:30 17:30 20:30 23:30 02:30 05:30 08:30
21
22
23
24
25
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

d
a

g
u
a

(
0
C
)
Horrio (hh:mm)

B
Figura 12 A:Variao da salinidade ao longo do perodo de amostragem. B: Variao da temperatura ao
longo do perodo de amostragem

O pH foi verificado apenas no inicio e no final dos experimentos, uma vez que
no apresenta grande variao em uma escala pequena (um dia) e este se manteve em
6,8. A temperatura do ar da regio variou entre 22C a 28C nos dois dias de
experimento (Climatempo, 2008).
5.3 Cromatogramas
O pico correspondente ao elatol foi bem separado e pde ser facilmente e
precisamente quantificado. Nos cromatogramas obtidos pelos pontos das curvas pode
ser observado que o analito em questo aparece com um tempo de reteno de 24,07
minutos (Figura 13).
49

Figura 13 Cromatograma do padro de elatol de 6,0 ppm.


Artefatos ou metablitos presentes no solvente ou provenientes do mtodo de
extrao, no interferiram nas anlises. Os cromatogramas de corridas com hexano puro
(Figura 14) e com hexano com poucas gotas de diclorometano (Figura 15) no
evidenciaram picos em 24,07 minutos.

Figura 14 Cromatograma de uma corrida em hexano, solvente de diluio das amostras.

Os picos existentes no incio das anlises do padro com tempos de reteno de
2,16 e 2,58 minutos so artefatos das poucas gotas de diclorometano utilizadas para
otimizao da solubilizao do elatol (Figura 15).
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
uV(x10,000)
Chromatogram
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
uV(x10,000)
Chromatogram
2
.
1
6
4
/
1
2
0
7
0
2
5
2
.
5
8
3
/
9
8
5
1
1
2
4
.
0
7
3
/
3
3
7
4
3
50
O elatol, nas amostras, apresentou o mesmo tempo de reteno do elatol no
padro (Figuras 13 e 16), possibilitando as quantificaes.

Figura 15 Cromatograma de uma corrida de hexano com diclorometano, adicionado para facilitar a
solubilizao do elatol.


Figura 16 Cromatograma de uma amostra quantificada, com pico de elatol em 24,07 min.

5.4 Variao Diria
Foi observada variao diria significativa na produo do elatol (Figura 17)
atravs do teste de Friedman ANOVA: p < 0,001 e N = 10. Este teste foi realizado, pois
os dados so dependentes, sendo invivel a realizao da ANOVA.
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
uV(x10,000)
Chromatogram
2
4
.
0
7
2
/
2
6
7
0
5
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
uV(x10,000)
Chromatogram
2
.
1
7
0
/
2
8
7
4
9
5
7
51
11:30 14:30 17:30 20:30 23:30 02:30 05:30 08:30
0
4
8
12
16
20
24
28
C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

e
l
a
t
o
l
(

g
/
m
g

p
e
s
o

s
e
c
o
)
Horrio (hh:mm)

Figura 17 Mdia do perfil dirio da produo do metablito secundrio elatol, encontrado em cada
indivduo. As barras representam o desvio-padro.

Existe um perodo de pico na produo do elatol em macroalgas da espcie L.
filiformis. Assim, o maior teor de elatol foi encontrado s 05:30 h (19,20 g/mg),
enquanto o perodo de menor produo foi observado durante tarde, s 17:30h (10,00
g/mg).
O valor desvio-padro para o experimento de dia-noite foi elevado, mas essa
representao de variabilidade pode ser devido variao na concentrao de elatol
encontrada nos indivduos na populao, ou seja, uma variao intra-populacional
bastante ampla, observada por Sudatti et al. (2006).
5.5 Variao de Regime de Mars
Com relao ao regime de mars, foi encontrada menor concentrao de elatol,
em L. filiformis, durante os perodos de mar alta e baixa, e maior produo na mar
intermediria (Figura 18) - Teste de Friedman ANOVA: p <0,009; N = 30 mars baixa
e alta e N = 20 mar intermediria.
52
Porm, ao sobrepor os dados obtidos durante o experimento de variao diria e
o ciclo de mar do dia da avaliao (Figura 19), no foi observada coincidncia entre a
concentrao mxima ou mnima de elatol com os perodos de mar.
Mar Baixa
Mar Intermediria
Mar Alta
0 4 8 12 16 20 24 28
Concentrao de elatol
(g/mg peso seco)

Figura 18 Variao da produo do elatol de acordo com o regime de mars. Mar Baixa- 0,1 a 0,5
metros; Mar Intermediria 0,7 metros; Mar Alta 0,8 a 1,2 metros. As barras representam o desvio-
padro.




Figura 19 Variao diria observada em L. filiformes e representao da variao de mar durante o
experimento.

11:30 14:30 17:30 20:30 23:30 02:30 05:30 08:30
0
4
8
12
16
20
24
28
C
o
n
c
e
n
t
r
a

o

d
e

e
l
a
t
o
l
(

g
/
m
g

p
e
s
o

s
e
c
o
)
Horrio (hh:mm)
1,2 m
0,3 m
Variao da
mar
53
5.6 Variao de Profundidade
Os indivduos de L. filiformis coletados no raso (1 m) e no profundo (3 m)
no apresentaram teores significativamente diferentes de elatol (Figura 20) - teste t para
amostras independentes: t = 0,19; p = 0,85 e N = 10.
Raso
Profundo
0 4 8 12 16 20 24 28
Concentrao de elatol
(g/mg peso seco)

Figura 20 Variao na produo de elatol de acordo com a profundidade das macroalgas. Raso: 1m e
Profundo: 3m. As barras representam o desvio-padro.

5.7 Bioensaios de Hebivoria
5.7.1 Herbvoro Generalista
Durante o bioensaio com o ourio-do-mar L. variegatus, aps 20 h de
experimento, nenhum dos alimentos artificiais contendo as duas concentraes testadas
(19,20 e 10,00 g de elatol/mg peso seco da alga) foi consumido. Assim, ficou evidente
que ambas as concentraes, que representam os extremos de variabilidade diria nos
teores de elatol encontrados em L. filiformis, inibem o consumo por L. variegatus.
5.7.2 Herbvoro Especialista
No bioensaio com a A. juliana, foi observado o consumo de ambas as
concentraes (19,20 e 10,00 g de elatol/mg peso seco da alga) aps 20 h. Porm, a
54
menor concentrao foi significantemente mais consumida teste t para amostras
dependentes: t = -5,06095; p = 0,00049 e N = 11 (Figura 21).
Concentrao maior
Concentrao menor
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
Consumo (g)

Figura 21 Consumo por A. juliana das duas concentraes testadas. O consumo foi de 0,036 g para a
concentrao menor e de 0,016 g para a concentrao maior. As barras representam o desvio-padro.

55
6 Discusso
O monitoramento por 24 h em campo constatou o efeito de dois ciclos naturais
(dia-noite e mars) nas flutuaes significativas de concentraes de elatol em L.
filiformis, corroborando a hiptese 1 e, parcialmente, a hiptese 2.
Foi constatado um ciclo dirio na produo de elatol, compreendendo menor
concentrao observada s 17:30 h e a maior concentrao por volta de 05:30 h,
resultando em uma diferena de 12 h entre o mximo e o mnimo de produo deste
metablito. importante destacar que o aumento na concentrao de elatol no
abrupto, mas ocorre de maneira gradual. A concentrao eleva-se a partir do horrio de
23:30 h, continuando crescente por volta de 02:30 h e apresenta o pico s 05:30 h,
perodo com ausncia de luz solar.
Diversos trabalhos indicam que danos causados nos talos de macroalgas podem
induzir ou ativar a produo de metablitos secundrios (Van Alstyne, 1988; Paul &
Van Alstyne, 1992; Lder & Clayton, 2004). Este aspecto poderia ocorrer com a
produo de elatol depois da retirada dos ramos de L. filiformis para anlise de teores de
elatol, procedimento este de simulao de herbivoria. No entanto, o ciclo dirio de
produo observado no presente trabalho no parece ser resultado da induo de defesas
qumicas propiciada pela manipulao dos exemplares durante o experimento, uma vez
que no foi constatado um aumento crescente na concentrao de elatol ao longo do
tempo de amostragem. Ao contrrio, aps o pico ocorrido por volta de 05:30 h, a
concentrao de elatol diminui a nveis prximos ao inicial por volta de 08:30 h.
Em plantas terrestres, os ciclos dirios de defesas qumicas j foram constatados,
com os metablitos defensivos variando na concentrao ao longo do dia. No estudo
sobre o ciclo de produo da espartena em plantas da espcie Lupinus arcticus, Sharam
56
e Turkington (2005) observaram uma variao diria na produo deste metablito, com
as folhas de L. articus apresentando a concentrao mxima no perodo da noite (entre
00:00 s 04:00 h) e mnima durante a manh e tarde (entre 09:00 e 20:00 h). Segundo os
autores, este comportamento pode representar uma resposta temporal tima aos altos
nveis de herbivoria que ocorrem durante a noite, praticados pela lebre Lepus
americanus.
Em estudo realizado com macroalga, Hay et al. (1988a) avaliaram, dentre outros
fatores, a variao diria na produo de metablitos secundrios em Halimeda
incrassata. Foi observado que os metablitos halimedatrial e epihalimedatrial so
produzidos principalmente durante a noite (de 20:00h s 04:00 h). Por outro lado, o
tetra-acetato foi encontrado em maiores concentraes durante o incio do dia (08:00 h).
Estes autores observaram que a herbivoria, nesta macroalga, comea a diminuir no
perodo tarde/noite, e que perdas de biomassa por herbivoria somente ocorrem durante o
dia. Como o halimedatrial inibe fortemente a herbivoria por peixes (Hay et al., 1988a;
Paul & Van Alstyne, 1988), o trabalho sugere que a alta concentrao noturna do
halimedatrial pode servir como defesa da macroalga frente aos herbvoros que so
ativos durante a noite, como ourios-do-mar ou herbvoros no to vorazes como
anfdodas, caranguejos e pequenos gastrpodes. Uma justificativa para a produo
durante o dia do tetra-acetato pode ser porque a sua biossntese dependente da
fotossntese e que o halimedatrial e epihalimedatrial so seus produtos enzimticos (Hay
et al., 1988a).
Abdala Daz et al. (2006) observaram variao diria significativa, durante o
vero, na macroalga parda Cystoseira tamariscifolia com uma progressiva diminuio
nos nveis de polifenis durante a manh, seguido de uma elevao do meio-dia ao final
57
do dia, sugerindo uma relao entre a fotoregulao da produo de polifenis e a
irradiao acumulada durante a exposio.
Em um experimento de campo, o qual durou 32 h, foi avaliado o contedo de
polifenis em dois ciclos naturais de trs espcies da ordem Fucales. Dependendo da
espcie, a concentrao de polifenol foi afetada pela sucesso dia-noite, ou pela
alternncia de perodos de emerso e submerso ou por ambos os parmetros. Em
Pelvetia canaliculata, macroalga bem adaptada a perodos prolongados de emerso, o
ciclo dia-noite pareceu afetar a pequena variao no nvel de polifenol durante o dia.
Em Ascophyllum nodosum, os talos emersos acumularam mais polifenis que os talos
submersos, sendo a variao de mar o fator importante na concentrao de polifenol.
J os nveis de polifenis em Bifurcaria bifurcata, a qual est submersa na maior parte
do tempo, no so afetados por nenhum dos dois fatores. Para os autores, essa evoluo,
ocorrendo em um escala de tempo muito pequena, pode ser considerada como rpida e
sugere uma ativao de polifenis, ao invs de uma induo de suas biossnteses
(Connan et al., 2007).
Sendo assim, a influncia de ciclos dirios na concentrao de metablitos
secundrios j foi observada em plantas terrestres, algas pardas e em algas verdes.
Porm, at o presente trabalho, a influncia do ciclo dianoite em algas vermelhas
nunca havia sido avaliada, consequentemente, o presente trabalho fornece dados
inditos na literatura.
Experimentos com manipulao, realizados por Pavia & Toth (2000),
constataram que Fucus vesiculosus pode responder com um significativo decrscimo no
contedo de florotaninos quando a intensidade da luz reduzida, assim como o
terpenide ochotodeno em Portieria hornemannii (Puglisi & Paul, 1997). De modo
contrrio, foi observado, no presente estudo, que a concentrao do sesquiterpeno elatol
58
aumenta quando ocorre a diminuio da luz ao longo do dia. Assim sendo, o aumento
da incidncia de luz pode ser um fator abitico que iniba a produo de elatol em L.
filiformis, uma vez que Cronin & Hay (1996b) j observaram que concentrao de
metablitos secundrios em Dictyota ciliolata diminui quando esta macroalga cresce em
locais com alta intensidade de luz, provavelmente recebendo altos teores de radiao
ultravioleta.
O carbono um elemento limitante no ambiente marinho, no sendo uma
limitao por matria-prima, pois o carbono inorgnico (e.g., na forma de HCO
3
-
)
abundante nos oceanos. uma limitao energtica, at certo ponto, pois substncias
orgnicas reduzidas so moeda energtica de sistemas vivos (Cronin, 2001).Alguns
cofatores importantes para a respirao e fotossntese, como ATP e NADPH, tambm
so extremamente relevantes na via de produo de metablitos secundrios. O fato de
o metabolismo secundrio dividir precursores qumicos com o metabolismo primrio
significa que as vias metablicas primrias e secundrias podem competir por substratos
e cofatores, sugerindo fortemente que o balano energtico entre as duas vias ocorre ao
nvel bioqumico (Cronin, 2001).
Foi observado que a maior concentrao de elatol ocorre durante o perodo
noturno, ou seja, com ausncia de luz solar. A luz fator primordial para que ocorra a
fotossntese. Atravs dela, os organismos fotossintetizantes captam a energia solar e
sintetizam ATP e NADPH, que usam como fonte de energia para sintetizar carboidratos
e outros componentes orgnicos a partir de CO
2
e H
2
O, liberando O
2
na atmosfera
(Nelson & Cox, 2002). Logo, a maior produo de elatol durante a noite pode estar
relacionada com a alocao de recursos entre os metabolismos primrio e secundrio.
De modo que, durante o dia, os recursos estariam destinados realizao da fotossntese
59
e, durante a noite existiria maior disponibilidade de substratos e cofatores para a sntese
de elatol em L. filiformis.
As macroalgas Laminaria saccharina e Palmaria palmata crescem mais rpido
durante o dia do que durante a noite (Lning, 1992). De certa forma, se L. filiformis
tambm apresenta uma taxa de crescimento menos rpida durante a noite, a maior
concentrao de elatol durante o mesmo perodo pode estar relacionada a maior
alocao de energia e carbono para o a produo de metablitos secundrios, em relao
a alocao desses recursos para o crescimento.
Os ritmos biolgicos so caracterizados pela recorrncia, em intervalos
regulares, de eventos bioqumicos, fisiolgicos e comportamentais. Os ciclos
circadianos so ritmos com perodos em torno de 24 h (de 20 a 28 h) e que, portanto, se
expressam com freqncia de um ciclo por dia. Sendo assim, sua relao com ciclo
claro-escuro do ambiente direta (Machado-Pinheiro & Mello, 2001).
A existncia de um ciclo circadiano j foi constatada em plantas terrestres. As
espcies de planta do gnero Mimosa, popularmente conhecidas como dormideiras,
apresentam um ritmo de movimentao de suas folhas, que permanecem abertas durante
o dia e fechadas noite (Machado- Pinheiro & Mello, 2001). Gribel & Zeier (2008)
observaram que respostas defensivas de plantas da espcie Arabidopsis thaliana so
reguladas por um ciclo claro-escuro natural, no qual a resposta foi mais acelerada
quando patgenos foram inoculados no perodo de luz (de manh e ao meio-dia) do que
quando inoculados durante tarde e noite. A maior concentrao de elatol observada
durante o perodo noturno pode ser atribuda a caractersticas intrnsecas da macroalga
em questo, sendo a presena de um ritmo biolgico circadiano fortemente influenciado
pela alternncia de claro e escuro.
60
No presente experimento de variao de regime de mar, foi observada menor
produo de elatol nos perodos de mar baixa e alta, sendo a maior concentrao
durante a mar intermediria. Os fatores abiticos ou estresses fsicos que variam
durante um ciclo de mars so provavelmente: o tempo de exposio das macroalgas, a
dessecao e exposio aos raios ultravioleta do sol.
As algas marinhas podem variar dramaticamente na maneira como um nico
estresse afeta suas suscetibilidades aos herbvoros. Para algumas espcies de algas, o
fator dessecao parece ser importante na produo de metablitos secundrios. Aps
sofrer dessecao, a macroalga parda no palatvel Padina gymnospora tornou-se mais
suscetvel herbivoria, sem perda de protenas. Esse aumento na suscetibilidade foi
atribudo perda de defesas qumicas. Para a macroalga Gracilaria tikvahiae, o
aumento da suscetibilidade a herbivoria de ourios aps a dessecao foi relacionado
com a diminuio nos nveis de protenas, e no por uma induo de metablitos
secundrios (Renaud et al., 1990).
Como mencionado anteriormente, Connan et al. (2007) observaram que os talos
emersos de Ascophyllum nodosum possuem maior concentrao de polifenis que
aqueles submersos, sendo a variao de mar o ciclo importante na concentrao de
polifenol. Esta uma alga que vive, no local de estudo, no nvel de mar intermediria,
passando por um perodo de 5 a 7 horas imersa, durante um ciclo de mar de 12 h,
indicando que raios UV podem influenciar na maior produo de polifenis nos talos
emersos.
Pavia & Brock (2000) observaram nveis altos de florotaninos em Ascophyllum
nodosum expostos por 7 semanas radiao UV-B, mas no nas macroalgas expostas
por 2 e 4 semanas. Alm disso, constataram uma menor concentrao de florotaninos
61
em algas expostas variao no nvel dgua (= mar) quando no existia radiao UV-
B, mas no houve variao significativa quando a radiao era incidida nas macroalgas.
Com relao aos resultados, no foi registrada diferena significativa entre mar
baixa e mar alta, uma vez que ambos momentos, os espcimes de L. filiformis
apresentaram concentraes baixas de elatol. Por conseguinte, podemos excluir, pelo
menos a priori, a hiptese da influncia da luz e da dessecao na deteco de maior
concentrao de elatol em L. filiformis, pois os horrios do dia em que existe maior
incidncia solar esto mais concentrados apenas no perodo de mar alta, ou seja, as
macroalgas no esto expostas diretamente ao ar.
Gerwick et al. (1985) encontraram diferenas quantitativas e qualitativas de
metablitos secundrios entre populaes de Stypopodium zonale relacionadas
profundidade. Macroalgas de guas mais profundas (16 a 25 m) apresentaram maior
concentrao do metablito secundrio taondiol do que algas de guas rasas (3 a 8 m).
A determinao da concentrao de metablitos secundrios de indivduos coletados em
diferentes profundidades tambm foi realizada por Cronin & Hay (1996a). Assim como
no presente trabalho, no foram encontradas diferenas na concentrao de pachydictyol
A e acetato de dictiol B, entre as profundidades de 1 e 3 m. Porm, outro metablito, o
dictyodial, foi encontrado em maior concentrao (38%) nas macroalgas que viviam no
raso, indicando que a influncia da luz depende do metablito secundrio em questo.
Os teores de elatol em L. filiformis no foram diferentes em espcimes desta
macroalga coletados em profundidades distintas. No entanto, estes ocorrem em locais
com pouca variao em profundidades (no mais do que 3 m), portanto, compreendendo
locais onde eles so encontrados naturalmente. Acreditamos que os resultados do
presente trabalho servem como uma constatao inicial da ausncia dessas diferenas,
sendo necessrios estudos com transplante das macroalgas em profundidades mais
62
diferenciadas para maiores concluses a cerca do efeito da profundidade na
concentrao de elatol.
Muitos metablitos secundrios que detm o consumo de peixes generalistas e
ourios-do-mar, geralmente falham nesta tarefa e podem ainda estimular o consumo por
outros herbvoros generalistas ou especialistas que sejam pequenos, com pouca
mobilidade, e sujeitos a uma taxa potencialmente alta de predao (Hay et al.,1987a;
1988b). De acordo com os resultados do presente estudo, o elatol parece apresentar essa
caracterstica, pois as duas concentraes foram efetivas ao inibir o consumo pelo
ourio-do-mar L. variegatus (generalista) e no detiveram o consumo pela lebre-do-mar
A. juliana (especialista).
sabido que durante a noite os peixes herbvoros esto inativos (Hay et al.,
1988a), porm, os ourios-do-mar apresentam maior atividade alimentar noturna (Hay
et al., 1987c). O presente trabalho mostra que as diferentes concentraes de elatol,
encontradas (mnima e mxima) durante o ciclo de 24 h, so igualmente ativas como
defesa frente ao ourio-do-mar L. variegatus. Sendo assim, a maior concentrao de
elatol no incio da manh no seria explicada em funo da inibio do consumo por
este ourio ou mesmo uma suposta ao frente a peixes, que so mais ativos por volta
de 11 h (Hay et al., 1988a). Uma vez que ourios comumente atuam mais durante
noite e consumidores especialistas costumam se alimentar de modo constante, a maior
concentrao de elatol por volta de 5:30 h seria por razo outra e no defesa contra a
herbivoria.
Espcies do gnero Laurencia so as macroalgas mais consumidas pelo ourio-
do-mar Arbacia punctulata e no so consumidas pelo L. variegatus (Cobb &
Lawrence, 2005), indicando que as defesas qumicas do gnero Laurencia no so
eficazes frente a todos os herbvoros.
63
Hay (1992) afirma que os herbvoros especialistas provavelmente exercem
pouca presso de seleo sobre os metablitos defensivos, em comparao com a
extrema presso desempenhada pelos generalistas, uma vez que parecem gerar mnimos
efeitos em suas plantas hospedeiras. Porm, muito provvel que as lebres-do-mar
exeram uma grande influencia na abundncia no banco de macroalgas, dos quais se
alimentam e vivem, uma vez que so herbvoros vorazes, mesmo sendo especialistas.
Vrios estudos sobre defesas qumicas de macroalgas em regies tropicais
verificaram que espcies contendo metablitos que detm a alimentao de peixes so
freqentemente consumidos de maneira seletiva por herbvoros pequenos e,
relativamente sedentrios (mesoherbvoros), como anfpodas, poliquetas e gastrpodes
ascoglossos (Hay, 1992). De fato, estes herbvoros pequenos que vivem e consomem
macroalgas defendidas sofrem uma menor presso de predao por consumidores
generalistas do que aqueles que vivem em algas no defendidas (Hay, 1992). Dessa
forma, a variao intrapopulacional quantitativa de metablitos secundrios pode ser um
importante aspecto para consumidores pequenos e mais sedentrios e,
consequentemente, pode exercer impactos significantes na estrutura das comunidades
(Pereira & da Gama, 2008).
As lebres-do-mar utilizadas nos experimentos podem ser consideradas como
mesoherbvoros, pois so juvenis, com pequeno tamanho corporal e apresentam, nesta
fase de vida, baixa mobilidade, em relao aos macroherbvoros, passando a maior parte
do tempo associadas s macroalgas. Uma vez que as concentraes de elatol
encontradas em L. filiformis no inibem o consumo por A. juliana, indivduos deste
molusco podem viver associados a esta macroalga, dela obtendo alimento e,
presumivelmente proteo contra consumidores, como fazem diversos outros meso-
herbvoros (Hay, 1992). Segundo Faulkner (1992) para pequenas lebres-do-mar, o uso
64
de pigmentos das algas para prover a camuflagem pode ser um importante mtodo para
evitar a predao. As lebre-do-mar utilizadas no presente trabalho eram juvenis, e
apresentavam colorao muito similar a da L. filiformis, macroalga na qual foram
coletadas, indicando a presena de uma forte camuflagem, podendo corroborar com a
afirmativa de Faulkner (1992), se os predadores da A. juliana sejam orientados
visualmente.
A relao entre consumidores especialistas e macroalgas selecionadas por
metablitos secundrios com funo defensiva pode produzir efeitos em cascata
adicionais (Pereira & da Gama, 2008). Por exemplo, aproximadamente 60% dos
sesquiterpenos encontrados em moluscos do gnero Aplysia no ocorrem em espcies
de Laurencia (Pereira & Teixeira, 1999), sugerindo que estas espcies de Aplysia so
capazes de modificar quimicamente metablitos precursores obtidos em suas dietas
naturais. Deste modo, pode promover a diversificao dos metablitos, atingindo os
mais altos nveis trficos das cadeias alimentares e produzindo potencialmente efeitos
em cascata na organizao da comunidade (Pereira & da Gama, 2008).




65
7 Concluses
Foi observada a variao diria na produo do elatol em Laurencia filiformis,
de modo que o horrio de maior produo ocorre s 05:30h e o de menor
produo s 17:30h.
O regime de mars pode influenciar na concentrao do elatol em L. filiformis.
A profundidade na qual a L. filiformis vive, no influencia na dinmica de
produo do elatol.
Os teores mximo e mnimo de elatol encontrados na variao diria foram
efetivos na inibio do consumo do herbvoro generalista Lytechinus variegatus.
Os teores mximo e mnimo de elatol encontrados na variao diria no
inibiram o consumo dos herbvoros especialistas, representados neste estudo
pela Aplysia juliana.
O presente trabalho sugere que a razo da variao na concentrao dos
metablitos secundrios pode no ser a funo de proteo contra a herbivoria.
8 Perspectivas de Prximos Estudos
Avaliar a variao diria na produo do elatol em macroalgas cultivadas em
laboratrio e com clones para a certificao da presena de ciclo de 24 h
endgeno de produo do elatol.
Estudos do efeito da profundidade com transplantes.
Experimentos de variao sazonal do ciclo de 24 h.
Avaliao da presena de variao na produo do elatol na superfcie do talo da
macroalga, para entender melhor a dinmica da disponibilizao desse
metablito na superfcie da alga.
66
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