Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Rabu, 3 September 2014

Mikrobiologi Waktu : 11:00 WIB

PJP : M. Arif Mulya, SPi.
Asisten : Ade Setiawan, AMd.
Embun Novita A., AMd.

KUANTITAS MIKROBE, HITUNGAN MIKROSKOPIS
LANGSUNG

Kelompok 2
Aang Febrizal J3L113020















PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGRAM DIPLOMA IPB
2014



A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat
baik untuk bertahan hidup. Jasad renik tersebut dapat hidup hampir di
semua tempat di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan
lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang relatif panas, dari
lingkungan yang asam hingga lingkungan yang relatif panas, serta dari
lingkungan yang asam hingga basa. Mikroba ini tidak dapat dilihat secara
kasat mata. Oleh karena itu, untuk melihat miroorganisme diperlukan alat
bantu berupa mikroskop (Afriyanto 2005).
Kuantitasi mikroba menunjukkan jumlah koloni yang mampu
dibentuk oleh mikroba tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh
manusia akan menyebabkan penyakit. Steril dari bakteri untuk makanan
terutama minuman, sangat perlu diketahui demi menjaga kesehatan. Air
minum dari berbagai tempatmempunyai jenis-jenis bakteri yang tidak
sama. Untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari
bakteri (Fardiaz, 1996).
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting
dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan
makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung
jumlah mikroorganisme. Metode tersebut berupa menghitung jumlah sel,
massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat
macam cara umum untuk memperkirakan besar populasi
mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung,
perhitungan tidak langsung, dan perkiraan tidak langsung (Harmita
2006).
Perhitungan langsung (direct count) digunakan untuk menghitung
jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dengan cara sel dihitung
langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel
elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct
measurement) digunakan untuk menghitung biomassa mikroorganisme
dengan cara massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau
mengukur berat seluruh sel serta biomassa dapat dikorelasikan dengan
jumlah sel dan membandingkannya pada kurva standar. Perhitungan
tidak langsung (indirect count) digunakan untuk menghitung jumlah sel
yang ada pada sampel dengan cara memperkirakan jumlah
mikroorganisme dalam sampel yang telah dikonsentrasikan dan ditanam
pada media yang sesuai, contohnya pembentukan koloni dalam pelat
agar. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) digunakan untuk
biomassa mikroorganisme. Biomassa mikroorganisme
diperkirakan dengan cara mengukur komponen biokimia sel
mikroorganisme yang relatif konstan, seperti protein, adenosin trifosfat
(ATP), lipopolisakarida (LPS), murein, dan klorofil. Biomassa juga dapat
diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan.
Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan
dengan jumlah sel dengan membandingkannya pada kurva standar
(Harmita 2006).



2. Tujuan
Praktikum bertujuan menentukan jumlah sel yeast/Khamir pada
sampel menggunakan teknik hitungan mikroskopis langsung.

B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada praktikum yaitu mikroskop, pipet tetes,
cover glass, Counter dan Haemacytometer. Bahan-bahan yang digunakan
yaitu suspensi yeast/khamir dan alkohol 70%.

C. Prosedur/Cara Kerja
Penentuan kuantitas mikroba, hitungan mikroskopis langsung dilakukan
terlebih dahulu persiapan alat yang akan digunakan. Salah satu alat yang
digunakan yaitu mikroskop cahaya. Sebelum mikroskop cahaya
disambungkan ke aliran listrik atau dinyalakan, terlebih dahulu dipastikan
bahwa lensa objektif yang digunakan adalah lensa yang memiliki perbesaran
paling kecil. Selain perbesaran lensa objektif yang diperhatikan, perbesaran
pencahayaan yang digunakan juga dalam keadaan minimum. Selanjutnya,
meja peparat dipastikan sudah berada pada bagian atas. Setelah itu mikroskop
siap untuk dinyalakan.
Setelah mikroskop nyala dan siap untuk digunakan, Haemocytometer
dan cover glass disiapkan sbagai media sampel dalam perhitungan mikroba.
Haemocytometer dan cover glass dibersihkan dengan secarik kertas lensa atau
tissue. Setelah itu, Haemocytometer diletakkan pada meja preparat dan
dijepit. Kemudian dicari ruang hitung pada Haemocytometer dengan
perbesaran yang paling kecil yaitu 40 kali. Setelah ditemukan kamar
hitungnya, lensa diubah dengan perbesaran 100 kali. Lalu cover glass
diletakan diatas Haemocytometer.
Suspensi Khamir yang telah disiapkan, dikocok dan diambil dengan
menggunakan pipet tetes sebanyak 0,1 sampai 0,5 ml. Kemudian, suspensi
tersebut dialirkan secara cermat ke ruang hitung melalui celah yang terdapat
pada sisi Haemocytometer. Perhitunga jumlah sel dapat dilakukan dengan
menghitung sel pada lima bidang pandang yang telah ditentukan.

D. Data dan Hasil Pengamatan
Berrikut ini adalah data hasil perhitungan jumlah sel yeast pada lima
bidang pandang yang telah ditentukan:
Tabel 1 Hasil kuantitasi yeast
Bidang Pandang sel
1 54
2 65
3 53
4 37
5 39
Kepadatan (sel/ml) 1,24.10
7




Contoh perhitungan jumlah sel/mL:
248/5 = 49,6 sel/kotak


3


49,6 . 25 . . 10
3


,4
7
sel/mL


E. Pembahasan
Metode hitungan langsung dapat juga digunakan untuk untuk
menghitung jumlah spora kapang atau jumlah sel khamir dlam suatu suspensi
dengan menggunakan Haemocytometer/hemasitometer atau gelas objek
Thoma, Petroff-Hausser, dan neubeur. Hemositometer adalah suatu alat yang
dapat digunakan untuk melakukan perhitungan mikroba secara depat dan
dapat digunakan untuk jumlah sel mikroba yang sedikit. Alat ini terdiri dari
cover glass, dua counting chamber yang terdapat garis-garis mikroskopis,
serta cover glass mounting support. Pada permukaan gelas objek ini terdapat
garis-garis melintang dan membujur sehingga terbentuk kotak. Adapun kotak
terbesar berukuran 1 mm
2
. Kotak seluas 1 mm
2
di bagian tengah dibagi
menjadi menjadi 25 kotak (0,2 mm x 0,2 mm) masing-masing berisi 16 kotak
terkecil (0,05 mm x 0,05 mm). Masing-masing kotak 0,2 mm x 0,2 mm
dibatasi dengan 3 garis. Garis yang tengah merupakan batas. Jika gelas objek
ini ditutup dengan gelas penutup, kedalaman di bawah gelas penutup adalah
0,1 mm, sehingga volume masing-masing kotak adalah 0,05 x 0,05 x
0,1=0,00025 mm
3
. Penghitungan spora kapang atau sel kamir dilakukan pada
kotak-kotak tersebut secara acak misalnya dipilih 5 kotak dari 25 kotak pada
luasan 1 mm
2
(Winiati dan Nurwitri 2012).




Gambar 1 Haemocytometer
Pada percobaan dilakukan sterilisasi sebelum dan sesudah pekerjaan di
laboratorium. Alkohol 70% disemprotkan pada tangan untuk membunuh
mikroorganime yang tidak diinginkan. Haemocytometer dan cover glass juga
dibersihkan dengan alkohol 70% untuk membunuh mikroorganisme yang
tidak diinginkan dan membersihkan kotoran yang menempel pada alat,
karena pada saat diamati di bawah mikroskop alat harus bersih dan steril
sehingga pengamatan terlihat jelas oleh mata dan mempermudah untuk
melakukan perhitungan mikroba. Ketika menggunakan mikroskop untuk
mencari ruang-ruang kamar pada Haemocytometer, intensitas cahaya jangan
terlalu terang, karena garis-garis pada Haemocytometer yang tipis sekali tidak
akan terlihat dikalahkan oleh sinar yang lebih besar dari cahaya mikroskop.
Selain cahaya, faktor perbesaran mikroskop juga berpengaruh. Ruang-ruang
kamar Haemocytometer baik di bagian bawah maupun atas akan terlihat
dalam perbesaran 4x10. Pada pebesaran tersebut, akan terlihat kotak-kotak
berukuran besar sebanyak 25 kotak. Setiap satu kotak besar berukuran 1 mm
2
.
Pada perbesaran 40x10 akan terlihat dengan jelas satu kotak besar yang
menyusun ruang kamar memiliki 16 kotak.









Gambar 2 Ruang Hitung
Sel-sel yeast yang berhamburan pada ruang-ruang kamar
Haemocytometer tidak perlu dihitung semua. Hanya 5 kotak besar dari 25
kotak besar yang dipilih, tetapi harus bersifat representatif. Pemilihan 5
kotak dapat secara diagonal atau pada keempat kotak yang berada di setiap
sudut dengan satu kotak berada di tengah. Dalam percobaan ini 5 bidang
pandang yang digunakan adalah berbentuk diagonal.




Gambar 3 Lima Bidang Pandang Diagonal
Pada percobaan, ketika suspensi yeast diteteskan pada ruang-ruang
kamar, maka sel-sel yeast baik yang hidup dan yang mati tidak dapat
dibedakan. Untuk membedakan sel yang mati dengan sel yang hidup maka
digunakan larutan pewarna yaitu methylene blue. Ketika methylene blue ini
ditambahkan, maka sel yang hidup akan tetap tidak berwarna atau transparan
sedangkan sel yang mati akan berwarna biru, karena sel mati memiliki lapisan
dinding sel yang rusak sehingga pewarna dapat masuk. Konsentrasi
methylene blue ini tidak boleh terlalu tinggi, karena dapat menyebabkan zat
pewarna dapat masuk menembus lapisan dinding sel yang hidup sehingga sel
hidup akan membentuk warna biru. Namun, pada saat percobaan tidak
digunakan metilen blue, sehingga sel yang terhitung terdiri dari sel hidup dan
sel mati.
Setelah diketahui jumlah spora kapang atau sel kamir dalam kotak
tersebut, jumlah spora kapang atau sel kamir dalam suatu volume bahan dapat
dihitung sebagai berikut ini:
Jumlah spora per mm
3
= jumlah spora per mm
2
x faktor pengenceran (FP) x
10
Di mana angka 10 diperoleh dari 1/0,1 mm
Jumlah spora atau sel kamir per ml (cm
3
)=jumlah sel per mm
2
x FP x 10000
(Winiati dan Nurwitri 2012). Dari hasil percobaan diperoleh kepadatan sel
yeast yaitu sebesar 1,24.10
7
sel/mL.




Gambar 4 Sel Yeast Pada Perbesaran 100 kali

F. Simpulan
Dari hasil percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa sel
yeast/khamir yang terdapat dalam sampel memiliki kepadatan sebesar
1,24.10
7
sel/mL.

G. Daftar Pustaka

Afriyanto E. 2005. Pakan Ikan dan Perkembangannya. Jakarta: Kanisius
Fardiaz, S., 1996, Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Radja Grafindo
Persada, Jakarta.
Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayat. Jakarta: Kedokteran EGC. Ed. ke-3
Winiawati P. Rahayu, C. C. Nurwitri. 2012. Mikrobiologi Pangan. Bogor:
IPB Press