Tratamiento con Endonucleasas de Restriccin

Las endonucleasas de restriccin son enzimas de origen bacteriano cuya actividad comprende el reconocimiento
de regiones de secuencia especfica y el posterior corte del DNA doble cadena.
Se conocen decenas de enzimas de restriccin diferentes, y la gran mayora son comercializadas por las empresas
de Biotecnologa !ibco, "romega, Ne# $ngland, etc%. Algunas son protenas recombinantes, mientras &ue otras son
purificadas de la fuente de origen.
La formulacin de las mismas comprende, en general, un tubo conteniendo la solucin con la enzima en buffer de
almacenamiento apropiado, y otro tubo conteniendo el buffer de reaccin generalmente como stoc' ()*%.
La digestin de un DNA doble cadena dado consiste en generar una mezcla conteniendo al mismo, m+s la cantidad
de enzima adecuada unidades de actividad enzim+tica recomendadas para la concentracin de molde utilizada, para
un tiempo de incubacin dado y para el fin buscado% y el buffer de reaccin en concentracin (*.. Se lleva al
volumen deseado con agua est,ril libre de nucleasas.
Ejemplo de protocolo de digestin:
DNA (cuantificado) - l
Buffer de Reaccin (10X) Vf/()% l
Enzima de Restriccin (X U/l) n l
!0 ()l . -/Vf0()/n% l
"f Vf
La mezcla se incuba a la temperatura de reaccin recomendada, &ue en general es 123.
La unidad enzim+tica para las endonucleasas de restriccin suele definirse como la cantidad de enzima necesaria
para digerir (gr de DNA de fago en un perido de incubacin de ( 4ora. $s posible alargar el tiempo de
incubacin de manera de introducir menor cantidad de unidades enzim+ticas. As, es com5n realizar digestiones
incubando overnight a la temperatura recomendada. "ara DNAs genmicos o de gran tama6o, se recomiendan otras
condiciones de reaccin.
$l grado de digestin del DNA molde depende no slo de la presencia de las regiones de secuencia de
reconocimiento para la enzima en cuestin, sino tambi,n del grado de limpieza o pureza de la muestra. La presencia
de sales o protenas pueden disminuir la eficiencia de la digestin enzim+tica por las endonucleasas de restriccin.
De acuerdo a cuales son los pasos o e-perimentos dise6ados a partir del DNA digerido ligaciones, nuevas
digestiones, tratamientos con otras enzimas% ser+ necesaria la inactivacin de la endonucleasa de restriccin utilizada
y0o la eliminacin del buffer de reaccin. "ara ello, algunas son inactivables por calentamiento a 7).28 3 durante
().(8 minutos. 9tras es necesario e-traerlas con fenol y luego precipitar el DNA. Siempre &ue sea necesario eliminar
el buffer, por&ue despu,s es necesario utilizar otro no compatible, 4abr+ &ue realizar una precipitacin del DNA para
luego poder resuspenderlo en la solucin deseada. :uc4as enzimas presentan actividad total o parcial% en varios
buffers de composiciones ligeramente diferentes. As es posible realizar varias digestiones con endonucleasas de
restricin diferentes al mismo tiempo y con un 5nico buffer de reaccin. "or ello es 5til analizar en los cat+logos la
composicin de las soluciones donde tienen lugar la reacciones, puesto &ue una buena eleccin de esos buffers
permite 4acer un buen dise6o e-perimental &ue puede permitir a4orrar pasos y por ende evitar manipulaciones y
p,rdidas del DNA molde.
Referencias.
(%3at+logo !ibco (;;;%.
<%3at+logo Ne# $ngland (;;;%.
1%3at+logo "romega (;;;%.
=%>Setting ?p Digestions #it4 @estriction $nzimesA. :olecular cloning. Sambroo', Britsc4 y :aniatis.