Anda di halaman 1dari 12

Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin, 22 September 2014

Mata Kuliah Penyakit Infeksius 1 Pukul : 14.00-17.00 WIB




ISOLASI dan IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM POSITIF

Dosen Penanggung Jawab Praktikum:
drh. Usamah Afiff, M.Sc.


Disusun oleh:

Fitriatus Shaleha B04110051
Banu Ardhiyanto B04110052
Eka Deandra Rahayu B04110054







Bagian Mikrobiologi Medis
Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner
Fakultas Kedokteran Hewan
Institut Pertanian Bogor
2014
PENDAHULUAN
A. LatarBelakang
Bakteri merupakan mikroorganisme yang merugikan, tidak hanya mengakibatkan
kerugian secara fisik, namun juga secara materi. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri
merupakan hal yang harus menjadi perhatian oleh para lapisan masyarakat terutama lapisan yang
berprofesi sebagai dokter hewan. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri dapat menyerang berbagai
jenis hewan termasuk hewan ternak. Penyakitini sangat dikeluhkan para peternak karena dinilai
sangat merugikan dan menurunkan nilai produksi.
Salah satu penyakit yang menyerang ternak dan mengakibatkan kerugiana dalah penyakit
mastitis. Mastitis merupakan suatu peradangan pada kelenjar mamae yang dapat menyerang
hampir semua jenis mamalia termasuk sapi perah. MenurutWeinner (2001), Penyakit ini dapat
disebabkan oleh beberapa jenis bakteri, diantaranya Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,dan
bakteri bentuk coli lainnya. Kedua agen tersebut merupakan bakteri Gram positif yang dapat
mengkontaminasi susu sebagai bagian dari kejadian mastitis.
Pencegahan dan pengobatan pada hewan yang terinfeksi penyakit bacterial merupakan
usaha yang harus dilakukan oleh seorang dokter hewan. Untuk melakukan hal tersebut
dibutuhkan teknik isolasi dan identifikasi untuk mengetahui penyebab penyakit sehingga dapat
dilakukan tindakan pengobatan dan pencegahan terhadap penyakit ini.

B. Tujuan
Melatih mahasiswa untuk melakukan isolasi dan identifikasi bakteri penyebab penyakit
mastitis.








MATERIAL DAN METODELOGI
A. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah cawan petri, ose, lampu spiritus,
korekapi, incubator, tabungeffendorf, tabung lilin, tabung durham, tabung reaksi, rak tabung
reaksi, spidol, gelas obyek,dan mikroskop cahaya.
Bahan yang digunakan dalm praktikum kali ini adalah sampelsusu, media blood agar,
media Mannitol Salt Agar, larutan H
2
O
2
,pewarna Gram (kristal violet, larutan lugol, aseton
alkohol,cairan plasma darah kelinci, larutan BHI, larutan glukosa safranin, dan aquadest), imersi,
dan xylol.

B. Metode
Minggu pertama
Hari pertama.
- Sampel air susu dari sapi yang diduga menderita penyakit mastitis diambil lalu dilakukan
pewarnaan gram:
1. Buat preparat ulas dari sampel air susu, kemudian fiksasi di atas api.
2. Beri larutan kristal violet selama 1 menit.
3. Cuci dengan air
4. Beri larutan lugol selama 1 menit
5. Beri larutan pemucat (aseton alkohol) selama 10-20 detik
6. Cuci dengan air
7. Beri larutan safranin selama 15 detik
8. Cuci dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring
9. Periksa dengan mikroskop pembesaran 100x

- Sampel air susu dibiakkan di media agar:
1. Ose dipanaskan hingga pijar
2. Ambil air susu dengan ose yang sudah aseptis
3. Goreskan ke media agar dengan metode T


Hari kedua
- Koloni bakteri yang terisolasi di media agar dipindahkan ke media agar miring





Minggukedua
- Lakukan pewarnaan gram dari isolat bakteri di media agar miring. Dengan metode yang
sama pada hari pertama.
- Lakukan uji katalase:
1. Teteskan beberapa ose H
2
O
2
pada kaca preparat yang telah dibersihkan
2. Tambahkan isolat bakteri dari media agar miring
3. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya buih-buih pada campuran isolat dan H
2
O
2


- Jika uji katalase negatif, lanjutkan dengan uji berikut:
1. Uji CAMP
o Goreskan biakan Staphylococcus aureus di tengah media MSA secara aseptis
o Goreskan beberapa galur biakan yang akan diuji di samping galur Staphylococcus
aureus.
o Setelah inokulasi dan inkubasi, hasil uji positif ditunjukkan dengan terjadinya zona
hemolisis berbentuk mata anak panah di sebelah daerah goresan Staphylococcus
aureus.

- Jika uji katalase positif, lanjutkan dengan uji-uji berikut:
1. Uji glukosa mikroaerofilik
o Siapkan media fermentasi maltosa yang dilengkapi dengan tabung Durham
o Secara aseptik masukkan isolat bakteri
o Inkubasi pada suhu 37
o
C
o Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna dan terbentuknya gas yang
dapat dilihat pada tabung Durham
2. Uji koagulase
o Satu mata ose biakan yang diuji diinokulasikan ke dalam media BHI (Brain Heart
Infusion) 300
o Tambahkan plasma kelinci sebanyak 200
o Inkubasi selama 8 jam
o Hasil positif ditunjukkan dengan terjadinya koagulasi pada plasma sedangkan negatif
bila plasma tetap cair
3. Uji pada media MSA (Mannitol Salt Agar)
o Ose dipanaskan hingga pijar
o Ambil isolat dari media agar miring dengan ose yang sudah aseptis
o Goreskan ke media MSA dengan metode T
o S. aureus (patogen): koloni berwarna kuning
S. epidermidis (non patogen): koloni berwarna merah















FLOW CHART









Pewarnaan Gram
Gram Negatif Gram Positif
Uji Katalase
Famili
Micrococcaceae
Uji Glukosa
Mikroaerofilik
Staphylococcus sp
Uji Koagulase
Koagulase Positif
(Staphylococcus
Patogen)
Koagulase Negatif
(Staphylococcus
Nonpatogen)
Uji MSA
Warna Kuning
(Staphylococcus
aureus)
Warna Merah
(Staphylococcus
epidermidis)
Micrococcus sp
Famili
Streptococcaceae
Uji Hemolisis
Uji Hemolisis
positif
Uji Hemolisis
negatif
HASIL
Langkah
Identifikasi
Hasil Gambar
1.Pewarnaan Gram -Gram Positif

2.Penanaman Pada
Agar Miring
-pertumbuhan berbetnuk duri
-koloni berwarna krem
-translusen

3.Penanaman pada
Agar Darah
-permukaan halus
-aspek koloni tidak mengkilap
-translusen
-berwarna kekuningan
-Mampu menghemolisis agar darah

4.Uji Katalase positif
5.uji Fermentasi Positif

6.Uji Koagulase Positif

7.UJi pada media
MSA (Mannitol Salt
Agar)
Positif



PEMBAHASAN
Isolasi dan identifikasi bakteri pada susu berguna untuk mengetahui spesies bakteri yang
dapat menyebabkan mastitis pada kelenjar susu sapi. Langkah-langkah untuk mengidentifikasi
bakteri penyebab mastitis diantaranya, Pewarnaan Gram, Penanaman bakteri pada agar miring
dan agar darah, uji katalase, Uji fermentasi, uji koagulase dan uji pada agar MSA. Metode
pengujian yang dilakukan merupakan salah satu metode yang panjang untuk mengidentifikasi
bakteri, sehingga metode tersebut dianggap sebagai metode konvesional.
Pewarnaan Gram bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri masuk dalam kelompok Gram
positif atau Gram negatif. Hasil yang diperoleh dari pewarnaan bakteri berwarna unggu, bakteri
berbentuk kokus dan berkoloni menyerupai anggur. Bakteri Gram Positif berwarna unggu
disebabkan kompleks zat warna Krista violet yodium dipertahankan meskipun diberi larutan
pemucat(Lay 1994). Bakteri Gram positif memiliki dinding bakteri yang tersusun oleh
pentidoglikan, sedangkan pada bakteri Gram negative tersusun oleh Lipida. Hal tersebut yang
menyebabkan hasil pewarnaan bakteri Gram positif dan Bakteri Gram negatif berbeda.
Penanaman pada agar darah diperoleh koloni yang tumpuh dengan wujud permukaan
halus, aspek koloni tidak mengkilat, translusen, berwarna kekuningan dan mampu
menghemolisis agar darah. Pada agar darah adanya zona transparan pada sekitar bakteri
membuktikan bahwa koloni bakteri ini dapat menhemolisis agar darah. Menurut (Kusuma 2009)
hemolisis dapat disebakan oleh hemolisin atau toksin yang dihasilakan bakteri tersebut.
Uji katalase diperoleh hasil positif. Uji ini dilakukan dengan cara mencampurkan biakan
dari agar miring dengan beberapa tetes H
2
0
2
3% dan katalase positif menunjukkan gelembung-
gelembung gas (Todar 2005). Bakteri pada sampel ini membuktikan dapat menghasilkan enzim
katalase, sehingga mampu memecah H
2
O
2
menjadi gas H
2
dan O
2
. Hasil positif pada uji ini
dapat mengerucutkan identifikasi bakteri ke Famili Micrococcaceae.
Uji fermentasi diperoleh hasil positif. Hal ini dibuktikan dengan adanya perubahan warna
pada larutan gula dari merah menjadi kuning dan terdapat gelembung gas pada tabung Durham.
Bakteri mampu melakukan metabolisme gula dalam keadaan anaerob. Uji fermentasi yang
positif mengarahkan identifikasi ke genus Staphylococcus.
Uji koagulase diperoleh hasil positif, yaitu terjadinya gumpalan pada Agar Brain Heart
Infusion(BHI) yang dicampur dengan plasma kelinci. Pengujian ini untuk membedakan
Staphylococcus yang bersifat patogen dan yang tidak patogen. Uji koagulase positif sangat
penting untuk membedakan Staphylococcus aureus dengan Staphylococcus yang lain (Bonang
1982). Staphylococus auresus mampu menghasilkan protein berupa enzim apabila ditambahkan
dengan oksalat atau sitrat mampu menggumpalkan plasma akibat adanya faktor yang terdapat di
dalam serum. Faktor serum akan bereaksi dengan koagulase untuk membentuk esterase dan
penggumpalan, senta dapat mengaktifkan protrombin menjadi thrombin. Trombin akan
membentuk fibrin yang akan berpengaruh terhadap proses penggumpalan.
Uji Manitolt Salt Agar(MSA) diperoleh hasil positif. Staphylococcus aureus pada MSA
akan terlihat sebagai pertumbuhan koloni berwarna kuning dikelilingi zona kuning keemasan
kaena kemampuan memfermentasi mannitol (Dewi 2013). Jika bakteri tidak mampu
memfermentasi manitol maka MSA tidak akan berubah warna. Warna kuing dari agar
merupakan hhasil dari metabolisme bakteri yng bereaksi pada phenol red pada agar.

KESIMPULAN
Hasil yang diperoleh pada isolasi dan identifikasi bakteri penyebab mastitis meliputi,
bakteri bersifat Gram positif, pada agar miring berbentuk seperti duri ,pada agar darah mampu
menghemolisis agar darah, uji katalase positif, uji fermentasi positif, uji koagulase positif dan uji
MSA positif. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa bakteri penyebab mastitis
adalah Staphylococcung aureus. Staphylococcus aureus dapat menyebabkan mastitis subklinis
dan mastitis klinis.
DAFTAR PUSTAKA
Akoso, T. B. 1996. Kesehatan Sapi. Yogyakarta: Kanisius
Baba, T., F. Takeuchi, M. Kuroda, T. Ito, H. Yuzawa, and K. Hiramatsu. 2003. The genome
of Staphylococcus aureus, p. 66-153. In D. Al'Aladeen and K. Hiramatsu (ed.),
The Staphylococcus aureus: molecular and clinical aspects. Ellis Harwood, London, United
Kingdom
Bannerman, D. D. and R. J. Wall. 2005. A Novel Strategy for the Prevention of Staphylococcus
aureus-Induced Mastitis in Dairy Cows. Information Systems for Biotechnology News Report.
Virginia Tech University. USA. 1 - 4.
Bonang G. 1982. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta(ID): Gramedia

Dewi AK. 2013. Isolasi, identifikasi dan uji sensitivitas Staphylococcus aureus terhadap
amoxicillin dari sampel susu kambing peranakan etawa(PE) penderita mastitis di
wilayah, kulonprogo Yogyakarta. J Sain Vet.(2)

Hurley W.L., D.E. Morin., 2000 - Lactation biology, Ed. ANSCI, 84 110;

Jones, G. M., R. E. Pearson, G. A. Clabaugh, and C. W. Heald. 1984. Relationships between
somatic cell counts and milk production. J. Dairy Sci. 67:1823-1831.


Kusuma SAF. 2003. Staphylococcus aureus. Univ Padjajaran

Lay BW. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. Jakarta(ID): Raja Grafindo Persada

Levinson W, Jawetz E. Medical Microbiology and Immunology. 6ta ed. McGraw-Hill, 2003.
Nelson Philpot, W., S.C. Nickerson, 1991. Mastitis: counter attack, a strategy to combat
mastitis. Babson Bros Co. Naperville, Illinois USA.

Todar K. 2005. Staphylococcus aureus. Todar Online Textbook of Bacteriology[Internet].[di
unduh 2014 Sep 20. Tersedia padahttp://textbookofbacteriology.net/MRSA.html

Weimer PJ. 2001. Applied Dairy Microbiology 2
nd
ed. New York(US): Marcel Dekker, Inc.


















TINJAUAN PUSTAKA


Mastitis adalah peradangan pada jaringan kelenjar ambing yang umumnya terjadi pada
saat laktasi. Penyakit ini sering terjadi pada sapi perah dan menyebabkan kerugian ekonomi yang
sangat besar bagi peternakan sapi perah di seluruh dunia (Bannerman dan Wall 2005). Gejala
klinis dari infeksi mastitis yaitu timbulnya rasa sakit, pembengkakan, kemerahan, dan
peningkatan suhu pada kelenjar ambing. Dampak dari infeksi ini salah satunya menimbulkan
kerugian secara ekonomi karena menyebabkan penurunan produksi susu yang dapat mencapai
70% dari seluruh kerugian yang ditimbulkan oleh mastitis serta bertambahnya biaya pengobatan
dan tenaga kerja yang diperlukan. Kerugian lainnya yang dapat ditimbulkan oleh mastitis adalah
adanya residu antibiotika pada susu, pengafkiran, meningkatnya biaya penggantian sapi perah,
kematian pada sapi, serta adanya penurunan kualitas susu (Hurley dan Morin 2000).
Berdasarkan respon radang yang terjadi, mastitis dapat dibedakan menjadi mastitis
perakut, akut, sub akut, subklinis dan kronis (Hurley dan Morin 2000). Mastitis subklinis
merupakan jenis mastitis yang paling sering terjadi, yaitu sekitar 15-40 kali lebih banyak
dibandingkan dengan mastitis klinis (Hurley dan Morin 2000). Jenis mastitis yang sering terjadi
di Indonesia adalah mastitis subklinis. Penyakit mastitis sendiri dapat disebabkan oleh berbagai
jenis mikroorganisme, salah satunya adalah bakteri. Tingkat keparahan dan intensitas terjadinya
mastitis dipengaruhi oleh faktor mikroorganisme penyebab mastitis itu sendiri. Menurut Akoso
(1996), bakteri yang dapat menyebabkan, antara lain adalah Streptococcus agalactiae,
Streptococcus disgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus zooepidemicus, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Enterobacter aerogenees dan Pseudomonas aeroginosa. Salah satu
penyebab utama mastitis yang umum pada sapi perah adalah Staphylococcus aureus (Jones et al.
1984). Mastitis yang disebabkan oleh S. aureus dapat terjadi secara klinis namun seringkali
terjadi secara subklinis dan menahun (Bannerman dan Wall 2005).
Klasifikasi ilmiah atau taksonomi Staphylococcus aureus menurut Baba et al. (2003)
adalah sebagai berikut:
Kerajaan : Prokariot
Divisi : Monomychota
Class : Schizomycetes
Order : Schizomycetales
Family : Coccaceae
Genus : Staphylococcus
Species : Staphylococcus aureus
Salah satu langkah dalam penanganan kasus mastitis, yaitu dengan mengidentifikasi S.
aureus dengan bakteri gram positif lainnya. Identifikasi dilakukan atas dasar kriteria fenotip
yang tampak, yaitu morfologi pertumbuhan koloni, uji katalase, uji koagulase, serta adanya
fermentasi manitol pada media agar MSA. Faktor patogenitas S. aureus berhubungan dengan
adanya produksi enzim koagulase. Enzim inilah yang membedakan S. aureus dengan bakteri
Staphylococcus lainnya (Levinson dan Jawetz 2003). Bakteri S. aureus juga dapat diisolasi
dengan media selektif MSA maupun dengan media umum. Penggunaan MSA tidak dapat
digunakan secara mutlak untuk membedakan S. aureus dengan bakteri Staphylococcus lainnya,
namun dapat digunakan untuk membedakan S. aureus dengan bakteri Streptococcus.