Anda di halaman 1dari 13

2014/4/16

1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 1
ELEKTROFORESIS
ZONA
ELEKTROFORESIS
ZONA
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 2
LO Bahan Kajian
Mahasiswa mampu menjelaskan dan
menerapkan pemisahan dengan elektroforesis
zona beserta instrumentasi utamanya.
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 3
Elektroforesis Zona
Definisi dan Sejarah
1
Perkembangan Teknik
Elektroforesis
2
Instrumentasi Utama
3
Faktor yang memengaruhi
pemisahan
4
Elektroforesis Kertas
5
Elektroforesis Selulosa
Asetat
6
Elektroforesis gel alami 7
Elektroforesis gel buatan
8
Aplikasi 9
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 4
Buku Acuan
Meloan CE. 1999. Chemical Separations:
Principles, Techniques and Experiments.
Canada, John Wiley & Sons

2014/4/16
2
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 5
Definisi dan Sejarah
Arne Tiselius
Swedia 1902-1971
Father of Electrophoresis
The Nobel Prize in Chemistry 1948
For his research on electrophoresis and adsorption analysis,
especially for his discoveries concerning the complex nature of the
serum proteins.
Serum kuda pada Pipa U dipisahkan dengan elektroforesis
menghasilkan 4 pita yang terpisah dengan baik yang terdiri
atas albumin dan 3 globulin yang diberi nama o, |, dan
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 6
Definisi dan Sejarah
Pemisahan ion dalam larutan berdasarkan perbedaan
ukuran dan muatan ketika tegangan tinggi diberikan pada
larutan
Muatan positif akan bergerak ke kutub negatif dan
sebaliknya
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
+
3
+
3
+
2
+
2
+
2
+
+
+
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 7
Definisi dan Sejarah
Keadaan struktur ionik dipengaruhi oleh
Jumlah dan keadaan gugus yang dapat diionkan
pH lingkungan
Keberadaan ion lainnya

Perbedaan dengan metode lain
Asosiasi dengan ion lawan Kromatografi penukar ion
prinsip?
Pergerakan pada medan elektrik elektroforesis prinsip
Pengendapan pada elektroda elektrodeposisi / elektrolisis
prinsip
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 8
Definisi dan sejarah
Sistem fase tunggal mobilitas relatif ion
~kondisi elektrik
GAYA DORONG:
F (dlm elektroforesis)
Teknik dua fase
- Adsorpsi
- Solubilitas
- Pengikatan ligan
- Interaksi ion
Teknik satu fase
- Friksi molekular
- Elektrostatis
GAYA TAHAN
f(koefisien
friksi).v(kecepatan
partikel)
2014/4/16
3
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 9
Definisi dan Sejarah
F>=f.v
F=Q.E
Q.E = f.v saat E
konstan v = Q/f =
Berdasarkan Hk Stoke:
f = 6tqr molekul bulat
F =Q.E= 6trqv
U = v/E =Q/6tqr
Q : muatan partikel;
E: kekuatan medan
: mobilitas per unit
medan listrik
r : jari-jari partikel (cm)
q: viskositas medium
(poises)
v: kecepatan
elektroforetik (cm/dt)
U: mobilitas partikel (cm
2

volt
-1
dt
-1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 10
Contoh Soal
Tentukan mobilitas ion Ba
2+
dalam larutan BaCl
2
0.0625M,
jejari Ba
2+
dalam larutan sebesar 2.78A dan viskositas
larutan 10.31 mili poises.
Jawab
Q = 2x4.8x10
-10
esu (electrostatic unit of charge)
bagaimana cara menentukan hal ini?
r= 2.78 x 10
-8
cm
q= 1.03 x
-2
poises
300 volt = 1.000692145 esu
U=
24.810
10
63.142.7810
8
1.0310
2
300
= 5.9x10
-4
cm
-2
.vol-1dt
-1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 11
Definisi dan sejarah
Untuk memperhitungkan
efek ion Cl
-
yang ada
dalam larutan diperlukan
koreksi dengan
persamaan Debye-
Huckel

1
1:

u =
1
2

2

u : kekuatan ionik
A: konstanta: 0.2333x10
8

untuk air pada 25oC
r : jari-jari partikel (cm)
c : konsentrasi (mol/L)
Z : valensi ion
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 12
Contoh Soal
Berdasarkan soal sebelumnya, tentukan mobilitas Ba
2+
ketika
dipertimbangkan keberadaan ion lainnya.
Jawab
=
1
2

2
=

1
2
0.06252
2
+ 20.06251
2
= 0.187489
U=

6tvq

1
1:
=
5.9x10
;4

1
1:2.7810
8
0.23310
8
0.187489
=
4.6210
;4
cm
2
volt
-1
dt
-1
2014/4/16
4
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 13
Definisi dan Sejarah
Secara praktis digunakan
persamaan
=


=

.

k=C/R

: jarak pergerakan ion (cm)


: jarak antar elektroda (cm)
V : tegangan (volt)
t : waktu (detik)
E : kekuatan medan (volt/cm)
i : arus (amper)
q : luas penampang lintas sel (cm2)
k : konduktivitas spesifik (ohm
-1
cm
-1
)
R : tahanan larutan dalam sel (ohm)
C : konstanta sel (cm
-1
)
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 14
Contoh Soal
Larutan albumin telur 3% dalam bufer pH 7.2 ditempatkan pada sel
elektroforesis yang memiliki diameter 1.2cm. Digunakan arus sebesar
20mA dan albumin telur memerlukan waktu 208 menit untuk bergerak
5.87cm menuju elektroda (+). Jika konstanta sel sebesar 18.3cm
-1
dan
tahanan sistem sebesar 7690 ohm pada 0
o
C, tentukan mobilitas
albumin telur tsb.
Jawab
Tentukan konduktivitas spesifik:
k = C/R = 18.3/7690 = 0.00238 ohm
-1
cm
-1
Tentukan nilai E: =

.
=
0.020
(3.140.6
2
)(0.00238)
= 7.43 volt/cm
Tentukan nilai U: =

=
;5.87
(20860)(7.43)
= -6.3x10
-3
cm
2
volt
-1
det
-1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 15
Perkembangan teknik
elektroforesis
1930 : Pipa U Tiselus
1937 : Elektroforesis Kertas disarankan oleh P Konig diaktualkan 1948 oleh E
Fisher
1939 : elektroforesis zona dikembangkan
1955 : gel pati (Smithies)
1957 : Selulosa Asetat (J Kohn)
1959: PAGE (polyacrylamide gels) (Raymond & Weintraub)
1961 : IEF (Svensson)
1964 : Disc gel electrophoresis (Ornstein & Davis)
1969 : SDS electrophoresis (Beber & Osborn)
1971 : Gel selulosa asetat (Meera)
1975 : Elektroforesis 2 dimensi
1977: sekuensing gel digunakan
1979 : gel agarosa
1983 : pulsed field electrophoresis
1983 : capillary electrophoresis
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 16
Perkembangan teknik
elektroforesis
Horizontal vertikal
+ -
+
+
Zona sempit
- Spot
- pita
Zona
sempit
2014/4/16
5
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 17
Instrumentasi utama
Elektroda (positif dan negatif)
Sumber tegangan
Medium
Bufer
Pewarna/deteksi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 18
Medium
Perkembangan elektroforesis didasari oleh
perkembangan medium
Kertas kertas selulosa asetat gel
Fungsi:
Reseptor spot/pita dari zat-zat terlarut
Menyediakan jalur migrasi
Medium berbeda: efektivitas pemisahan
berbeda bergantung sifat zat yang dipisahkan
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 19
Bufer
Fungsi:
Membawa arus yang diberikan jembatan konduksi
Menyediakan pH
Menentukan muatan dari zat terlarut
Kekuatan ionik bufer
Kekuatan yang tinggi menghasilkan pita yang tajam
Kekuatan yang tinggi menghasilkan panas lebih tinggi
Bufer yang biasa digunakan
Bufer barbital & Tris-EDTA untuk protein
Tris-asetat-EDTA & tris borat-EDTA
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 20
Deteksi
Dengan pewarnaan:
Prinsip: diberi pereaksi spesifik
Cara: disemprot, diuapi, direndam, dll
Kadang perlu menghilangkan warna
background pada medium dengan
destaining.
Tanpa pewarnaan:
Deteksi dengan UV
Densitometer/scanner
Identifikasi
Mengukur jarak tempuh komponen Rf
Spot dengan Rf/jarak tempuh yang sama dengan standar
dianggap sebagai senyawa yang sama
2014/4/16
6
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 21
Beberapa pereaksi pewarna
Pereaksi Senyawa yang dideteksi
Amido black 10 B Protein
Coomassie blue Protein
Silver nitrat Protein
Etidium bromida DNA dan RNA
Sudan black Lipid dan lipoprotein
Schiff-periodic acid Karbohidrat dan glukoprotein
Ninhydrin Asam amino
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 22
Peralatan Elektroforesis
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 23
Faktor yang memengaruhi
pemisahan
Voltase yang digunakan
Konsentrasi bufer
pH bufer
Efek elektroosmotik
Efek difusi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 24
Voltase yang digunakan
Tegangan yang tinggi akan menyebabkan
Efek termal |
Penguapan bufer |
perubahan mobilitas karena perubahan tegangan dan arus
Menyebabkan efek kapiler pada kertas dan gel karena akan
mengambil bufer dari tempat bufer
Waktu pemisahan pendek
Panas maksimum yang dapat ditoleransi 0.15watt/cm
3
Perhitungan panas:
H=

: panas yang terbentuk W/cm


3
2014/4/16
7
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 25
Contoh Soal
Tentukan panas yang terbentuk pada albumin
telur di soal sebelumnya

Jawab

H=

2

=
0.02
2
1.13
2
0.00238
= 0.132 W/cm
3
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 26
Voltase yang digunakan
Pada saat panas sangat tinggi dapat
ditemukan bentuk pita yang tersenyum
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 27
Konsentrasi bufer
Mempengaruhi mobilitas partikel (ingat
kembali rumus perhitungan U)
Konsentrasi bufer | viskositas bufer ?
mobilitas ion ? memerlukan konduktivitas ?
pemanasan ? efek yang muncul?


6tq
=
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 28
pH bufer
Muatan zat ampiprotik ditentukan pH lingkungannya




pH asam = kation pH basa = anion

tidak bermuatan
pH = pI
2014/4/16
8
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 29
Efek elektroosmotik
Zat berbeda hantaran berbeda
Contoh:
kertas (medium) dan air (pelarut/bufer) akan
berinteraksi menimbulkan perbedaan muatan
Kertas lebih bermuatan (-) dari selulosa
Air lebih bermuatan (+)
Air ditempatkan pada tabung kapiler yang diberi
elektroda positif dan negatif, air akan bermigrasi
pada elektroda negatif
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 30
Efek difusi
Cairan cenderung mengalir
Kecepatan difusi dipengaruhi oleh
Ukuran partikel: makin kecil ukuran partikel,
makin cepat berdifusi
Perbedaan konsentrasi
Suhu: makin tinggi makin mudah berdifusi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 31
Elektroforesis kertas
Teknik pekerjaan mirip dengan kromatografi kertas
Aplikasi contoh:
Cara kering:
seperti kromatografi kertas
Resolusi spot lebih baik karena lebih kecil
Belum ada jembatan konduksi
Cara basah:
kertas dibasahi dengan bufer lalu contoh ditetesi
Spot lebih lebar
Sudah ada jembatan konduksi
Hanya untuk molekul kecil yang mobilitasnya kecil perlu
potensial tinggi (200volt/cm) panas |
Efek elektroosmotik tinggi
Efek difusi besar membran selulosa asetat
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 32
Selulosa Asetat
transparan
Lebih seragam dan memberikan
pemisahan yang lebih tajam dan
mengurangi efek background
pada pewarnaan.
Waktu pemisahan lebih pendek
Jangan dicelupkan dalam bufer
tapi biarkan bufer masuk dari
bagian dasar selulosa asetat
Faktor difusi masih besar
2014/4/16
9
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 33
Gel alami
Memperbaiki efek difusi lebih kaku
Gel alami pati kentang polimer alami, ukuran pori sesuai
dengan sifat kimia bahan pati kentang/beragam tidak
dapat digunakan untuk penyaringan
Resolusi lebih baik dari kertas
Cara mempersiapkan
Pati kentang + bufer dipanaskan sekitar 90
o
C hingga larut.
Udara dalam campuran dikeluarkan dengan vakum
Letakkan pada cetakan, disiapkan tempat meletakkan contoh dengan
sisir dan didinginkan
Gel yang telah dirunning dapat dipotong dan diwarnai dengan
pewarna yang berbeda
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 34
Gel Buatan
Ukuran pori seragam bergantung konsentrasi



Konsentrasi kecil konsentrasi besar
Hati-hati memilih konsentrasi perhatikan
data dari produsen bahan kimia
Contoh PAGE
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 35
PAGE
Lebih fleksibel, kuat, dan mudah ditangani
dibandingkan dengan gel lain
Transparan thd radiasi UV dan Vis
Menghilangkan efek elektroosmosis dan difusi
Pembuatan gel akrilamida memerlukan
Monomer akrilamida
N,N-metilena-bis-akrilamida sebagai cross linker
Ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator
Tetrametilenadiamina (TEMED) sebagai katalisator
Polimerisasi fotokimiawi diaktifkan oleh riboflavin
dengan adanya radikal UV

FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 36
Reaksi pembentukan PAGE
2014/4/16
10
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 37
PAGE
Gel standar:
7.5% ukuran molekul 10.000 1.000.000
3.5% ukuran molekul 1.000.000 5.000.000
Ukuran >5.000.000 agarosa atau campuran gel
Elektroforesis Gel diskontinu
2 konsentrasi gel:
stacking gel /gel atas ukuran pori besar &
separation gel / gel bawah ukuran pori kecil
2 nilai bufer (biasanya berbeda 2 satuan pH)
Bufer gel bawah pH sekitar 8.9
Bufer gel atas pH sekitar 6.7
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 38
SDS PAGE
Sodium dodesil sulfat (SDS): detergen
Bagian hidrofobik bereaksi dengan
protein dengan perbandingan teratur
Protein membawa muatan SDS dg Mr
berbeda sampel memiliki muatan
sama tapi berbeda Mr-nya
U=

6tq
3.
4t
;1/3
=kzMr
-1/3
persamaan logaritmik antara U dan
Mr
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 39
SDS
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 40
Pemisahan protein terikat SDS
2014/4/16
11
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 41
PAGE & SDS PAGE
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 42
Aplikasi
Forensik
Membandingkan
DNA sampel dari
tersangka,
korban, dan data
di lapangan

+
T1
DNA
+
T2 T3 korban
Tersangka Sampel
di
lapangan
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 43
Aplikasi
Penentuan hubungan evolusi DNA organisme

+
DNA
+
1 3 2 4 5
1 2 3 4 5
Kura-kura ular tikus tupai lalat
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 44
Aplikasi
Menentukan bobot molekul protein dengan
SDS PAGE

Carilah literatur mengenai penggunaan
elektroforesis zona
2014/4/16
12
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 45
Aplikasi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 46
Aplikasi

FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 47
Aplikasi

FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 48
Aplikasi

2014/4/16
13
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 49
LATIHAN
Apa yang dimaksud dengan elektroforesis
Jelaskan sejarah perkembangan elektroforesis
Jelaskan instrumentasi utama pada elektroforesis
Jelaskan faktor-faktor yang memengaruhi pemisahan
pada elektroforesis
Apakah persamaan dan perbedaan antara
elektroforesis kertas, selulosa asetat, gel alami dan gel
buatan.
Apakah persamaan dan perbedaan native PAGE dan
SDS-PAGE
Sebutkan contoh penerapan pemisahan dengan
elektroforesis zona
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 50
PENUTUP
PELAJARI ELEKTROFORESIS KAPILER untuk
PERTEMUAN YANG AKAN DATANG