Anda di halaman 1dari 5

1.

Sebut dan jelaskan langkah kerja dalam Western Blotting


1. Preparasi sampel yang digunakan
Sampel diberikan perlakuan seperti didinginkan menggunakan TBS dan
disentrifus untuk mengambil bagian protein yang diinginkan kemudian
dicampur dengan buffer kemudian didihkan dan disentrifus.
2. Gel Elektroforesis
Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan
ukurannya dengan adanya arus listrik.. Sampel terlebih dahulu dimasukkan
ke dalam sumur gel. Kemudian lakukan gel pada menit dan volta tertentu
dan voltage ditingkatkan hingga 100-150 V selama 1 jam. Pemisahan protein
menggunakan gel elektroporosis ini bergantung pada ukuran dari protein
yang ingin dianalisa.
3. Transfer Protein dari Gel menuju membran
Protein harus dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya
nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan
kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan
merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-
proteinnya.
Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik
elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein
dari gel ke membran. Dapat dilakukan dengan cara :
1. Meletakkan gel ke transfer buffer selama 10-5 menit
2. Memassang tranfer sandwich agar tidak ada gelembung udara,
pastikan posisi blot di katoda dan gel pada anoda.
3. Letakkan kaset pada tangki transfer dan letakkan pemblok es pada
tangki
4. Lakukan transfer sepanjang malam pada tempat yang dingin dengan
tegangan konstan sebesar 10mA
Setelah itu, barulah membran dengan protein sampel tersebut diinkubasi
dengan antibody dan dibilas serta diwarnai menggunakan Ponceau solution
untuk memeriksa kualitas tranfer, kemudian dibilas kembali menggunakan
TBST sebanyak 3 kali. Kemudian lakukan blok melakukan BSA, dan inkubasi
sepanjang malam dengan antibodi primer pada suhu 4 derajat celcius.
4. Analisis
Pada analisis dapat digunakan metode di bawah ini
a. Colorimetric detection
b. Chemiluminescent
c. Radioactive detection
d. Fluorescent detection
Setelah pengambilan citra gambar kemudian dilakukan analisis dengan
software komputer.

2. Jelaskan istilah di bawah berikut
a. Antibodi monoklonal
Antibodi Monoklonal adalah antibodi sejenis yang diproduksi oleh sel
plasma klon sel-sel positif sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel
hibridoma(hasil fusi 2 sel berbeda; penghasil sel positif Limpa
danselmieloma)yangdikultur.Bertindak sebagai antigen yang
akanmenghasilkan anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain diagnosis
penyakit dan kehamilan.Antibodi monoklonal adalah zatyang diproduksi
oleh sel gabungan tipe tunggal yang memiliki kekhususan tambahan. Ini
adalah komponen penting darisistem kekebalan tubuh. Mereka dapat
mengenali dan mengikat ke antigen yang spesifik. Pada
teknologi antibodimonklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa
henti digabungkan dengan sel mamalia yang memproduksi antibodi.Hasil
penggabungan sel ini adalah hybridoma, yang akan terus memproduksi
antibodi. Antibodi monoklonal mengenalisetiap determinan yang antigen
(bagian dari makromolekul yang dikenali oleh sistem kekepalan tubuh /
epitope). Merekamenyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilah
antara epitope yang sama. Selain sangat spesifik, merekamemberikan
landasan untuk perlindungan melawan patogen. Antibodi monoklonal
sekarang telah digunakan untuk banyakmasalah diagnostik seperti :
mengidentifikasi agen infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan
antibodi auto, mengukurprotein dan level drug pada serum, mengenali
darah dan jaringan, mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam
responkekebalan dan mengidentifikasi serta mengkuantifikasi hormon
b. SDS PAGE
SDS-PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis adalah teknik sederhana yang umum digunakan untuk
menganalisa ukuran protein
c. Indirect assay
indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan
antibody. Pada ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik
(monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal
untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada
sampel yang diuji.
d. Sandwich assay
Pada Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer
spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody
sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA
sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA
sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat
berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody
sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA
sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki
minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein.
Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai
antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali
disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder
seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak
dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent
yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat
kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki
tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat
keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua
antibody.
e. Nitrocellulose membrane
Merupakan suatu media atau berupa kertas yang menyerap
protein pada untuk dianalisa lanjut pada proses western blotting
misalnya.
3. Contoh hasil Western Blotting
A.













A= Hasil Analisa menggunakan SDS page
yang hanya menunjukkan deteksi
potein hingga satuan 100ng
B= Hasil analisa menggunakan western
blotting yang mampu menunjukkan
deteksi protein hingga 1ng
A= Hasil Analisa menggunakan SDS page
yang hanya menunjukkan deteksi
potein hingga satuan 100ng
B= Hasil analisa menggunakan western
blotting yang mampu menunjukkan
deteksi protein hingga 1ng
Protein terdeteksi adanya dua pita protein
pada ukuran berat molekul 75kDa dan
25 kDa

DAFTAR PUSTAKA:
http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2111504-
western-blot/#ixzz1fNk5xeOf
http://www.molecularstation.com/protein/western-blot/#top