Rev. T<:. lng. Univ. Zulla. Vol 15. No. 3. 201 - 207.

1992
Produccin de cido ctrico
por fermentacin
Zulay Mrmol Prez , Gisela Pez R.
Fac. de Ingeniera Universidad del Zulia
Resumen
El presente trabajo tiene por objelo estudiar la produc Ion de cido Uico por fermentacin
sumergida on Aspergil1us niger 4396. uWizando como fuenle de carbono y energa harina de yuca
(sustrato no convencional) y azcar refinada en procesos disconllnuos y continuos respectivamente. Se
us omo fuenle nitrog nada sulJalo de amonio. La temperatura para ambos procesos St" mantuvo entre
28 y 30 C. Se valuaron I.as siguJenles variables; Biomasa, pH. Azcar residual . Almidn y Acido Ctrico.
Los resultados lndkan que con harlna de yuca no se requiere la adicin de la fu nte de nilrgeno.
su contenido es suficiente para garanUzar la produccin de cido citrico. A pH inidal de 2.0 se produjo
hidrlisis cida con la fonuacin de dextTinas y olros productos no rennenlesdbles. lo que dismlnuy el
rendimiento 112.94% Y16.92%). A pH 5.89 el fue superlor. alcan7..ando un valor de 29.81%.
Se observaron bajas para el cultivo ontinuo debido a la poca concentracin de cido
en el medio aJ iniciar el flujo ontinuo. aproximadamente a las 72 horas.
Palabras claves: Acido Ctrico. Fennenlacin.
Citric acid production by fermentation
Abstract
The foJlowmg research has the purpose to sludy lhe Cllric Acid Production by submerged
fermenlalion wllh A. niger 4396. uslng cassava meal (unconventional substrales) and refined sugar as
carbon and energy SOUTce In batch arJd conUnuous pro esses respecUvely. It was used Arumonia
SuJphale as nilrogenaled source. The lemperalure rol' bolh processes was he\d between 28 and 30 C.
During lhe fermenlation progression were evalualed lhe foUowlngvariable: Blomass. pH. Residual Sugar.
Starch arJd Cllric Acid.
TIle resuJls lndicale lhal wilh cassava meal is nol requiTed lhe addiUon 01 the nltrogen SOllrce.
ber.allse ils nitrogen conlenl is enough lo guararJlee lhe cilric acid productlon. At iniUal pH of 2.0 il
produced hydrolysis acid wllh fonnation of dextrins and olhers uIlfemlentahle producls. iI reduced lhe
yield (betwe n 12.94% and 16.92%). While a pH oC 5. 89 Ule yie1d incTeased lo 29.81%. For continuous
cuJlure il was observed low productivity because of small acldo concentraUon al lhe continuous Oow
b ginnlng. approximately lo 72 hrs.
Key Words; Cilric Acid. Fermenlation.
guienle el cido orgnico ms Importanle en la
Introduccin
Induslrta de procesamiento de alimt>nlos. consu-
Es el cido clrico uno de los cidos orgni-
miendo sla cerca del 60% del cido produci-
os ms llWizados. sle no es lxico. es fcUmen-
do(14
1
: lambin es ampliamente usado en indus-
te asimilable, altamente soluble y por consi -
trias como la farmacuUca. la quimica y otras
Rev. Tc. Ing. Univ. Zulla. Vol. 15. No. 3. 1992
202
Mrmol y Pez
como la industria de los detergentes. en la cual
ha tenido una gran aceptacin debido a su blo-
degradabilidad. sustiluyendo as los poUfosfatos.
En la actualidad se emplean cepas de As-
pergillus niger. las cuales son capaces de con-
vertir con altos rendimientos la fuente de carbo-
no en cido cibico.
En el proceso de fermentacin para la pro-
duccin del cido clJico pueden ser usados sus-
tratos tales como carbohidralos e hidrocarburos.
Los carbohidralos son fuent renovable y se
emplean no solamente en forma pura sino tam-
bin como residuos impuros provenientes del
procesamiento de comestibles.
El presente trabajo Uene por objeto estu-
dJar la produccin de cido ctrico por fermenta-
cin usando cepas de A. nger 4396 en harina de
yuca (sustrato no convencional) y n azcar re-
finada: empleando procesos dJsconttnuos y con-
tinuos respectivamente. con miras a cubrir la
demanda de este producto.
Parte Experimental
Organismo
El organismo usado en esta experiencia fu'
Aspergillus nger4396 obteIdo de la Facultad de
Cien ias de la Universidad de los Andes (Estado
Mrtda). Este se manluvo en Polato O ruosa
Agar (PDA) inclinado almacenado a 4C y reno-
vado cada mes. Se utiliz un medio de prueba (2)
capaz de predecir la hablUdad de distintas cepas
de A. niger. para producir cido citrico.
Medio
El medio empleado fu bsicamente el re-
comendado por Shu y Johnson (121. usando como
sustratos harina de yuca (sustrato no convencio-
nal) y azcar refinada.
A los sustratos utilizados se les determin
Fe. Mn. Cu. Zn y Al. por espectrofotomelria de
absorcin atmica. (Tabla 1) .
El pH inicial del medJo fue 2 .0. no se este-
rlllz y nunca se observ contaminacin.
La composicin del medJo y las condJciones
iniciales estn dadas en Las Tablas 2 y 3.
lnculo
Las esporas cultivadas en tubos contenien-
do POA. se transfieren usando agua estril y bajo
condiciones aspticas a matraces que contengan
un volumen de medio aproximadamente igual al
10% del volumen de medio a fem1entar (volumen
de trabajo) . La concentracin de esporas. apro-
ximadamente 3xl0
8
/mI fue estimada por conteo
microscpico directo usando una cmara de
Neubauer.
Los matraces se incuban durante 48 horas
a una temperatura de 30C en un incubador
rolatorio New Brunswick Scienlfic Modelo G 24.
con control de temperatura y ag'ilacin. La sus-
pensin de "peUels" as fom1Uda se lransfiere
bajo condicione& aspticas al ferm nlador prin-
cipal .
Equipo
Para evaluar el comportanenl o de la epa
A. niger 4396 en harina de yuca se uWizaron
Erlenmeyers (Pyrex) con 500 mJ d c<lpacidad y
un volumen de medio de 150 mi: controlando la
temperatura y velocidad de agitacin.
El proceso de cultivo continuo se llev a
cabo en un f rm nlador Blol1o Model C - 30: on
un volumen de trabajo de 450 mJ.
Tcnicas Analticas
Peso Seco
Las delermimnaciones de biomasa e reali -
7..af'On con la tcnica de peso seco (101 .
Acido Ctrico
El cido citIico en el filtrado se deLermin
por el mtodo colorlmtIico de Marter y Boulel.
r5.81 para la determinacin directa de ste.
Azcar Residual
El azcar residual fue analizado por el m-
todo fenol-cido sulfrico d Dubois y colabora-
dores (4) .
Rev. Tc. lng. Univ. Zulla. Vol. 15. No. 3. 1992
203 Produccindecidocilrico porfermentacin
Tabla l.
Algunosmetalesimportantesenla harinadeyucayazcarrefinadautilizadascomofuenle
decarbonoyenerga.
Metal Harinadeyuca AzcarRefinada Lmitede deteccin
(mg/Rg) (mg/Kg) (mg/L)
Fe 68.09 1.00 0.02
Mn N.D 0.25 0.01
Cu 21.43 N.D 0.03
Zn 31.43 N.D 0.02
Al N.D N.D 0.03
Tabla2.
ComposicindelmedIoy condicionesdeoperacinparala
fennenlacinconharinadeyuca.
Composiciny condiciones
iniciales
Harinadeyu a. giL
Almidn. giL
S04 (NH4h. giL
Cantidadde N2. gi L
pH
Agltadn. rprn
Temperatura. OC
Vol. Trabajo. L
Medio 1
140.00
50.55
0.70
2.00
200.00
30.00
0.15
Medio2 Medio3
140.00 140.00
49.99 52.50
1.24
0.96 0.70
2.00 5.89
200.00 200.00
30.00 30.00
0. 15 0.15
Alntidn
Para las delerminaciones de aJ.mjdn se
utilizelmtodocolortmtricodeCarteryNewt.er
!l3}
Fermentacin por Carga
SustratouUlizado: Harina deyuca.
Se realizaron fermentaciones aerbicas a
nivel defiolas portriplicadocon unvolumende
trabajode 150mi .
Durante el curso de la fermenlacin se
tomaronmuestrasporduplicadodeaproximada-
mente 10 mi a tntervaJos de 48 horas durante
264 horas (11 dias). Determinndose en cada
casopH. cidoctricoy alnlldn.
Sustraloutilizado:Azcarrefinada.
Selleva cabounafennenlacinporcarga
conunvolumendetrabajod 450mJ .
Fermentacin Continua
La fermentacin continua fue iniciada por
tnocuJacin en un medio por carga rrabla 3) .
Adicionalmente el flujo continuocuyacomposi-
ciny condicionessedana laTabla4.comenz
cuandolaproduccindeacidofueobservada(7 2
br).Sefij una tasadedilucin 0.075hr-1 15.6)
)0quesignificunflujodemediofrescode0.563
mJfmin.
Rev.Tc.lng.Univ. Zulla.Vol. 15 . No. 3. 1992
204
Mrmoly Pez
Tabla3.Composicindelmedioy
condicionesdeoperacinparala
fermentacinconazcarrefinada.
ComposicinyCondicionesIniclales.
AzcarRefinada. gIL
(NH4)zS04. giL
KH2P04. gIL
MgS04. 71-hO. gIL
CuS04.5H20x10
3
gIL
FeS04.7H20X10
3
gIL '
ZnS04.7H20x10
3
gIL
pH
Agitacin. rpm
Temperatura.oC
Vol. deTrabajo. L
TasadeDujo
deaire.vvm
140.00
1.24
2.50
0.25
0.06
0.42
0.25
2.00
100.00
28-30
0.45
0.70
Enel medioporcargaparael proceso
continuo3 noseadicionFeS04.7H20.
Enlaelapaporcargaparael pro eso
continuo4 seuWizaron 150rpm.
...
Enel proceso onlinuo3 y 4 seullllza-
Ton 1.1vvm paralaetapaporcarga
Se realizaron cuatro fermentaciones aer-
bicas. delascualessevartla concentracinde
azcaryde nJtrgeno al momento de iniciarel
aUJo continuo.
Enel CursO delafermentacinselomaron
muestrasdeaproximadamente 15 mi a interva-
los de 24horasdurante 120 horas (5 das). En
cada caso se determin biomasa. azcar resi -
dual. pH ycido ctrico. El pH inicial del medio
fue2.0 ynosecontrolenelcursodelafermen-
tacin
Discusin
La tabla5muesLTalosresuJtadosobtenidos
para las fermentaciones con harina de yuca.
Estos indicanque hubo una disminucin de la
fuente decarbonoy energia(almidn). ascomo
delosvaloresdepH:obterunclosevaloresfinales
de pH enLTe 1.63 y 3.04 para valoTes iniciales
enLTe 2.0 y 5.89respectivamente.
Un elevadoValOT del pH inicial (5.89) favo-
recilaproduccindecidoctricotal omopudo
observarseenel medio3. Enlosmedios 1y 2
produjounahidrlisiscidaaladlcionarles cido
clorhdrico paraajustarel pH inicial a unvaJor
de2.0.originndosedurantelamismadextrinas
y oLTos productosindeseablespornoser n n n ~
Tabla4.
ComposiCindelm dioy condiCionesdeoperaCinal
iniciarelflujo continuo.
Composiciny condicionesIniciales 1 2 3 4
Azcarrefinada.gl L
(NH4)2S04.gIL
KHZP04.giL
MgS04.7HzO. gIL
CuS04.5HzOxl0
3
. gIL
FeS04.7H20X 10
3
giL
ZnS04.7H20X10
3
gIL
pH.
Agitacin. rpm
Temperalura. oc
Vol. deTrabajo. L
Tasadenujo
deaire.vvm
140.00
1.24
2.50
0.25
0 .06
0.42
0.25
2.00
lOO.OO
28-30
0.45
0.70
115.00
0.62
2.50
0 .25
0 .06
0 .42
0.25
2.00
100.00
28-30
0.45
0.70
85.00
2.50
0.25
0.06
0 .25
2.00
100.00
28-30
0 .45
1.1
95.00
0.62
2.50
0 .25
0.06
0.42
0 .25
2.00
100.00
28-30
0 .45
1.1
Rev.Tc. lng. Unlv. Zulla.Vol. 15. No.3. 1992
__ ___

Producdn de addo dtrtco por fermentacin 205

Tabla 5 .
. Resultados de la Fermentadn por carga I.t
realizada con harina de yuca
Medio pH Addo Ctrico AlmJdn Hend.-
(gIL) (gIL) Yp(%)
l.'
1 1.63 2.00 38.59 J6.72
2 1.67 1.94 35.00 ]2.94
3 3.04 4.80 36.40 29.81
u
__ __
o H q n " -
En base al almJdn consumido.
' ....'oftrl.l
tables. Lahidrlisis cida del aJm1dn reduce su
70;.:ll::.UeNI=.::..:...COH:.=.;IW=IOo\ :;.:..:: If.:.::'-- ____.., IO ___
ulilidad como sustrato para la fermentacin c-
la ,...MlIIIMA --=ltAl'-- ________-,
trica.
Ladisminucin de la fuente de carbono por
consumo de cdula indic la viabilidad de la
misma. asochindose la disminucin de pH con la
produccin del cido.
Esto explica los bajos rendimientos obtenl- .
dos (12.94% - 29.81%) en los medios 1 y 2.
Adicionalmente la cantidad de nitrgeno fue su-
perior a la establecida en lrabaJos previos por
t
Bracho y Socarrs(3)'para la cepa A. n;ger 4396:
el vaJor ptimo reportado fue de 1.24 gIL de 0
0 u M _
......0 llor)
sulfato de amonin lo que corresponde a 0.26 gIL
_
-
00
lO
to -
la

& " U M - - -
Y_PO (M
de nitrgeno. El contenido de nitrgeno para los
0.01 ___ .., _ ____
medios 1 y 3 fue de 0.7 g/Ly de 0.96 gIL para el
medio 2.
Los resultados reportados con el medio 3
(pHI =5.89) se asocian al hecho de que la cepa
A. n;ger empleada es capaz de producir un com-
pleJo de sus propias enzimas amyloliticas (alfa
amilasas). las cuales hidroUz.an el almJdn a
monosacridas que son convertidos en aeido
citrlco. Lamxima actividad de la alfa amilasas
est en el rango de pH: 4.5 - 7.8. dependiendo de
la fuente de la enzima. las obtenidas a partir de
hongos del gnero Aspergillus presentan activi-
dad ptima a un pH de 4.6.(1.11).
FJg. l. Cinetlca de produccin de cido
Lafigura 1muestra los resultados obteni -
citrico
dos para la fermentacin por carga con azcar
refinada: estos muestran un aumento en elcon-
Se observ un cambio en la forma de creci-
sumo de la fuente de carbono y energia y en la
miento del microorgan1sm a partir de las 72 hr.
blomasa producida; el pH disminuy a lo largo
coincidiendo esto con lo reportado por Paz (9) y
del proceso.
Bracho (3J . El nitrgeno suministrado en el medio
Rev. Tc. lng. UnIV. Zulla. Vol. 15. No. 3. 1992
206
seagoty elsubsecuenteaumentodelabiomasa
se debi a la acumuJacin de carbono por la
clula. AJ calcuJar los valores de la velocidad
especfica de crecimiento ..t, Tabla 6, antes y
despus de las72 horas seobserv unadismi-
nucin de este parmetro, como consecuencia
del cambio en el mecanismode crecimiento del
hongo.
Tabla6
VaJoresdevelocidadespecficade
creclmienloparalafermentacinporcarga
conazcarrefinada.
Variabl Valor s Unidades
2
2.7xI0-
l
3
~ 4.7xI0-
1 Valorobtenidoanlesde las72hr.
2 Valorobtenidodespue delas72hT.
Enlatabla7 semuestranlosrendimjentos
obtenidos.Losvaloresparalabiomasay el cido
cibico fueron de 14.31 y 0 . 11 gramos por 100
gramosdeazcarconsumidarespectivamente.
Tabla7. Rendimientoenbiomasay
productoparalafermentacinporcarga
conazcarrefinada.
Parmetro Valores Urdades
14.31 Yo
0.11 %
Losrendimientosestncalculadosen
basesalazcarconsumido.
MrmolyPez
Seproblacapacidadde la cepaempleada
de producircido cibico. para lo cual seapUc
latcnicarecomendadaporBenuzziy Segovia(2)
Los resuJtadosindicaronqueel A. niger 4396es
una cepa productora ya que se form el halo
transparente.caracterisUcodel citralo ~ calcio.
LalabIa8muestralosresultadosobtenidos
parael cultivo continuo operado a una tasa dI"
dilucinde0.075hr-
I
. El procesoseircicomo
un cultivo por carga: trans unido un liempo
aproximado de 72 horas se comenz el nujo
continuode nutrientes. el cual sehacecircular
haslaalcanza r condiciones estacionarias. estas
selogran pasado un lil"mpo usualmenteigual a
tres tiempos de residencia. tr. dado porla rela-
cin ) /DV/Fdonde: D eslalasadedilucin.
Veselvolumeny Flavelocidadd nujovolum-
tricodelmedio.Elvalordel tiempoderesidencia
fuede 13.33horas.
Los valores de productividad al an7.ados
estuvieronentre 1.2x10-
3
Y5.6x10-
3
g/ L - hr. lo
cualse debi a la baja concentracin de cido
dtricoexislenteallnJciar l nujocontinuo.
Conclusiones
- S comprobuliUzandoel mediodeprue-
basugeridoporBenU7.zi y Segovta {2} quelacepa
A. niger 4396es productoradt> <lcido ctrico.
- La adicinde la fuente nitr gt'nada(Sul-
falodeAmonJo) almNlio2 pT'{"paradoconharina
deyuca. sustratonoconven ionaJ. no favoreci
laproduccin de cido cilrlco. El onLenido d
nitrgenoenla harinaessuficienteparagaran-
tizarel crecimientoy laproduccindecido.
Tabla8.
hr
-1
VaJoresenesladoestacionarlodelcultivocontlnuooperandoA D = 0.075 .
Fermentacin pH Biomasa AzcarUtili- AcidoCtrico Productividad
(g / L) 7.ada (g / L) (g / L) (g / L -hr)
1 1.43 3.19 15.0 1.6xl0
2
].2xI0-
3
2 1. 77 4.99 20.0 7.5xIO-
2
5.6xlO-
3
3 1.40 1. 44 12.5 4.1xIO
2
3.1x10-
3
4 1.54 5.85 35.0 4.. l.x1O-
2
3.1x10-
3
Rev.Tec. Ing. Unv. Zulla.Vol. 15.No. 3. 1992
207
Produccin de cido citrico por fermentacin
- Un valor de pH inicial de 2.0 no favoreci
la fermentacin ya que se originaron productos
de h.idrUsis no fermentesclbles. En harina de
yuca Wl pH inicial de 5.89 produjo los mejores
resultados.
- Se encontr que durante la fermentacin
de cido ctrico la cepa de A. niger 4396 fue capaz
de producir sus propias enzimas arnyoUllcas. las
cuajes h1drolIzan el almidn a azcares disponi-
bles.
- Al caJcuJar el vaJor de la velocidad especi-
fica de crecimIento. antes y despues de la 72
horas. se observ una disminucin de este par-
metro. indicando un cambio en el mecanismo de
crecimiento del hongo.
- El flujo conUnu debe iniciarse tilla vez
que en el cultivo por carga se aJcance la mxima
produccin de cido ctrico.
Reconocimiento
Se agradece al CONSEJO DE DESARRO
llO CIENTlFICO y HUMANISTICO (CONDES) de
la Universidad del Zula el financiamiento a esta
invesUgacin.
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