Quim. Nova, Vol. 37, No.

6, 996-999, 2014
A
r
t
i
g
o
http://dx.doi.org/10.5935/0100-4042.20140153
*e-mail: csbona@smail.ufsm.br
DESENVOLVIMENTO DE UM MTODO PARA A DETERMINAO DE TIOCONAZOL ASSOCIADO A
NANOCPSULAS POLIMRICAS POR CROMATOGRAFIA LQUIDA
Andria P. G. Hrter, Mariana H. Motta, Jlia G. de Barros, Roseane F. Ribeiro, Andra I. H. Adams, Scheila R.
Schaffazick e Cristiane de B. da Silva*
Departamento de Farmcia Industrial, Centro de Cincias da Sade, Universidade Federal de Santa Maria, Av. Roraima, 1000,
97105-900 Santa Maria RS, Brasil
Recebido em 03/10/2013; aceito em 24/02/2014; publicado na web em 11/06/2014
DEVELOPMENT OF A METHOD FOR DETERMINATION OF TIOCONAZOLE ASSOCIATED WITH POLYMERIC
NANOCAPSULES BY LIQUID CHROMATOGRAPHY. The aim of this work was to develop and validate an analytical method
for the quantication of tioconazole in polymeric nanocapsule suspensions by high performance liquid chromatography with UV
detection. The analysis was performed with a mobile phase composed of methanol:water (80:20) and 0.18% ammonium hydroxide;
RP-18 column and UV detection at 219 nm. The method proved to be linear in the concentration range of 5-50 g mL
-1
(r = 0.9999),
specic, precise (repeatability RSD = 1.42%, intermediate precision RSD = 1.17%), accurate (98 - 102%) and robust (RSD < 2.0%).
In conclusion, a simple and rapid method was validated proving suitable for quantication of tioconazole in polymeric nanocapsules.
Keywords: polymeric nanocapsules; tioconazole; validation.
INTRODUO
Os derivados imidazlicos so agentes antifngicos caracteriza-
dos pela presena de um anel azlico com dois tomos de nitrognio,
o qual se liga a outros anis aromticos que conferem a esses frmacos
diferentes propriedades fsico-qumicas e biolgicas.
1
O tioconazol
(Figura 1) um imidazol, caracterizado como um p cristalino branco
ou quase branco, muito pouco solvel em gua, muito solvel em
clorofrmio e facilmente solvel em etanol.
2
Sua frmula molecular
C
16
H
13
Cl
3
N
2
OS; apresenta massa molecular de 387,71 g mol
-1
,
3
pKa
de 6,5
4
e LogP de 4,29.
5
Esse frmaco possui amplo espectro de ao, sendo utilizado
para o tratamento tpico de dermatotoses de pele e unhas, pitirase
versicolor e candidase mucocutnea.
6
Relatos de efeitos indesej-
veis decorrente do uso de tioconazol so encontrados na literatura,
destacando-se como um dos derivados imidazlicos com maior
potencial alergnico.
7
Esses inconvenientes na teraputica com tioco-
nazol podem estar diretamente relacionados com a baixa absoro do
frmaco, uma vez que se faz necessria a utilizao de concentraes
elevadas para o efeito desejado.
8
Visando minimizar os problemas enfrentados com o uso deste
antifngico, nanocpsulas polimricas contendo tioconazol foram
desenvolvidas pelo nosso grupo de pesquisa. As nanocpsulas po-
limricas so nanopartculas, compostas por um ncleo geralmente
oleoso, envolto por um no lme de polmero, sendo que o frmaco
pode estar adsorvido na parede, disperso no meio e/ou dissolvido no
ncleo.
9,10
Esses sistemas apresentam tamanho de partculas inferior
a 1 m e atuam como carreadores de frmacos, promovendo uma
liberao controlada das substncias em locais especcos. Alm
disso, promovem uma melhora na resposta teraputica, permitem a
reduo da quantidade administrada de frmaco e minimizam efeitos
colaterais indesejveis.
11,12
A caracterizao dos sistemas nanoestruturados realizada por
diferentes mtodos, sendo fundamental a determinao do teor de
frmaco incorporado a eles. Na literatura cientca encontram-se alguns
mtodos por cromatograa lquida de alta ecincia (CLAE) para a
quanticao do tioconazol em formas farmacuticas; entretanto, ne-
nhum especco para as nanoestruturas propostas neste trabalho. Alm
disso, so mtodos bastante trabalhosos, que utilizam solventes de custo
elevado e, ainda, a grande maioria faz uso de solues tampo.
4,13-15
A Farmacopeia Americana
3
descreve como fase mvel a utilizao
de acetonitrila:metanol:gua (44:40:28) alcalinizada com hidrxido
de amnio, tendo como desvantagem o uso de acetonitrila, solvente
de alto custo. Outro fator desvantajoso o comprimento da coluna
(25 cm), que acarreta em longo tempo de eluio, retardando o tempo
de reteno do pico do tioconazol (entre 12 e 17 minutos). Por outro
lado, a Farmacopeia Britnica
2
descreve mtodos para a quanticao
do tioconazol em forma farmacutica creme. O mtodo utiliza como
fase mvel uma mistura de tetrabutilamnio diidrognio ortofosfato
0,005 g mol
-1
(pH ajustado para 7,4 com hidrxido de amnio 2 g mol
-
1
) e metanol (1:4), fator esse desvantajoso em se tratando do uso de
tampo, por ser prejudicial para o tempo de vida til da coluna e por
requerer cuidados em relao ao equipamento.
Frente ao exposto, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e
a validao de um mtodo analtico simples e eciente, capaz de quan-
ticar o tioconazol aps a sua associao nanocpsulas polimricas.
PARTE EXPERIMENTAL
Material e reagentes
A matria-prima de tioconazol (99,22%, m/m) foi obtida da
Pharma Nostra (So Paulo, Brasil); metanol grau cromatogrco foi
Figura 1. Estrutura qumica do tioconazol
Desenvolvimento de um mtodo para a determinao de tioconazol associado a nanocpsulas polimricas 997 Vol. 37, No. 6
adquirido da Tedia (Rio de Janeiro, Brasil); o hidrxido de amnia
da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a gua ultrapura foi puricada
atravs do aparelho MegaPurity Mega RO (Rio de Janeiro, Brasil).
Para a preparao das nanopartculas foram utilizados monoestearato
de sorbitano (Span

80) e o polmero poli(-caprolactona) (PCL, Mn

= 70.000 90.000) obtidos da Sigma-Aldrich (So Paulo, Brasil); o
leo (triglicerdeos de cadeia mdia) adquirido da Delaware (Porto
Alegre, Brasil); polissorbato 80 (Tween

80) e acetona da Vetec (Rio

de Janeiro, Brasil).
Preparao da suspenso de nanocpsulas polimricas
As suspenses de nanocpsulas foram preparadas pelo mtodo de
deposio interfacial do polmero pr-formado descrito em trabalho
prvio.
16
Foram obtidas nanocpsulas polimricas de tioconazol
(NC-TIO), a uma concentrao de 1,0 mg mL
-1
. Para a avaliao
da especicidade do mtodo, nanocpsulas sem o frmaco foram,
tambm, preparadas (NC-B).
Condies cromatogrcas
Um sistema de cromatograa a lquido Shimadzu (Kyoto, Japo)
foi utilizado, equipado com bomba LC-10AD VP, detector UV SPD-
10A VP, central de controle SCL-10A VP e injetor manual Rheodyne
(volume de injeo 20 L). Os dados foram analisados pelo programa
Class-VP (Shimadzu, Kyoto, Japo). Um segundo cromatgrafo
foi utilizado para determinao da pureza do pico cromatogrco
(Shimadzu LC-20A, Kyoto, Japo), equipado com bomba LC-20AT,
detector SPD-M20A PDA e sistema controlador CBM-20A. Como
fase estacionria empregou-se uma coluna Gemini

Phenomenex
C-18 (150 x 4,6 mm) com tamanho de partcula de 5 m, associada
a uma pr-coluna Phenomenex

C-18 (4,0 x 3,0 mm, 5 m). A fase
mvel foi composta de metanol:gua:NH
4
OH (80:20:0,18, v/v). O
sistema foi operado temperatura ambiente, utilizando vazo de
1,0 mL min
-1
. A deteco foi realizada em 219 nm e o tempo de
reteno foi de, aproximadamente, 7,2 minutos.
Preparao das solues amostra
Para a determinao do tioconazol, 400 L da suspenso de
nanocpsulas polimricas foram adicionados em balo volumtrico
de 20 mL juntamente com metanol. Essa soluo foi submetida
sonicao por 40 minutos, a m de extrair o frmaco presente nas
nanoestruturas. Aps, o volume do balo foi aferido para obteno
da concentrao terica de 20,0 g mL
-1
. As amostras foram ltradas
em ltro quantitativo e em membrana de celulose regenerada (0,45
m; Sartorius

) sendo, ento, analisadas por CLAE-UV.

Preparao das solues da substncia qumica de referncia
Uma soluo estoque de tioconazol em metanol foi preparada,
na concentrao de 1,0 mg mL
-1
. Uma alquota de 400 L da soluo
estoque foi transferida para balo volumtrico de 20 mL, utilizando
metanol como solvente, a m de obter uma soluo de concentrao
de 20 g mL
-1
. Todas as solues foram ltradas em membrana de
celulose regenerada (0,45 m; Sartorius

) antes de serem analisadas

pelo sistema cromatogrco (n = 3).
Validao do mtodo analtico
Os parmetros avaliados na validao do mtodo compreenderam:
especicidade, linearidade, limites de quanticao e deteco, preci-
so (repetibilidade e preciso intermediria), exatido e robustez.
17,18
Especicidade
A especicidade do mtodo foi determinada pela anlise da
pureza do pico do tioconazol e pela utilizao de uma suspenso de
nanocpsulas sem o frmaco, contendo os excipientes utilizados na
sua preparao (amostra placebo). Essa suspenso foi submetida ao
mesmo processo usado para a preparao das amostras que conti-
nham o frmaco. O cromatograma obtido foi analisado para vericar
a possibilidade de interferncia dos componentes da formulao.
Para vericar a presena de possveis produtos de degradao, as
NC-TIO (1,0 mL) foram acondicionadas em cubetas transparentes
(Brand

, 12.5 mm x 45 mm x 12.5 mm) e expostas luz ultravioleta

articial UVC (Phillips TUV UVC long life, 30 W) em cmara
espelhada (1 m x 25 cm x 25 cm). As amostras foram coletadas no
tempo zero e aps 15 horas de exposio, submetidas ao processo
de extrao, e o teor de tioconazol foi determinado por CLAE-UV.
O ensaio foi realizado em triplicata.
Linearidade e limites de deteco e quanticao
Para a construo da curva analtica, alquotas da soluo estoque
(1,0 mg mL
-1
) foram transferidas para bales volumtricos de 20 mL
e o contedo diludo em metanol, a m de se obter concentraes de
5, 10, 20, 30, 40 e 50 g mL
-1
. Trs curvas analticas independentes
foram construdas e a linearidade foi obtida pelo estudo da regresso
linear, pelo mtodo dos mnimos quadrados e analisadas por Anlise
de Varincia (ANOVA). Os limites de deteco (LD) e quanticao
(LQ) foram calculados a partir da curva analtica mdia, considerando
o desvio padro do intercepto e a inclinao.
18
Preciso
A preciso foi determinada em nveis de repetibilidade e preciso
intermediria. A repetibilidade foi realizada a partir da anlise de seis
amostras independentes, na mesma concentrao (20,0 g mL
-1
), no
mesmo dia e nas mesmas condies experimentais. Para a avaliao
da preciso intermediria as amostras (20,0 g mL
-1
) foram analisadas
em trs dias diferentes (n = 3/dia). Os resultados foram expressos
como desvio padro relativo (DPR, %).
Exatido
O ensaio de exatido foi realizado em triplicata, a partir do teste
de recuperao. Uma soluo de tioconazol na concentrao de 10
g mL
-1
foi preparada aps a extrao do frmaco das nanocpsulas
com metanol. A essa soluo foram acrescidas quantidades da solu-
o estoque, a m de obter solues de concentrao de 16, 20 e 24
g mL
-1
(correspondendo a 80, 100 e 120% da concentrao usual
de anlise 20 g mL
-1
). O percentual de recuperao foi calculado
pela diferena entre as reas obtidas das solues acrescidas ou no
da soluo estoque.
19
Robustez
A robustez do mtodo foi avaliada a partir da anlise das amostras
(20 g mL
-1
, n = 3/condio), variando-se o comprimento de onda (216
e 222 nm), a vazo (0,8 e 1,2 mL min
-1
) e a coluna (Nanoseparation

C-18, 150 x 4,6 mm, tamanho de partcula de 5 m).
RESULTADOS E DISCUSSO
O desenvolvimento de um mtodo analtico capaz de quanticar
frmacos incorporados em sistemas nanoestruturados exige cuidados
no sentido de garantir a total separao do frmaco do complexo
sistema ao qual est connado. Neste sentido, a CLAE tem se mos-
trado uma boa alternativa e cada vez mais estudos acerca do uso
desse mtodo para anlise de frmacos nanoestruturados vm sendo
realizados. Como exemplos, mtodos analticos por CLAE-UV foram
Hrter et al. 998 Quim. Nova
desenvolvidos e validados para a quanticao de clobetasol
20
, clotri-
mazol
21
, adapaleno
22
e cido lipoico
23
em suspenses de nanocpsulas.
Neste trabalho, alguns testes para a escolha da fase mvel ideal
foram realizados, sendo o principal objetivo utilizar um sistema eluen-
te menos complexo que os j relatados na literatura.
13,15
Inicialmente,
foram testadas solues de metanol:gua em diferentes propores
(80:20; 85:15; 90:10), sendo o metanol o solvente escolhido por
apresentar um menor custo quando comparado acetonitrila. Todas
as fases mveis testadas proporcionaram valores adequados de assi-
metria e pratos tericos (em torno de 1,2 e 3.000, respectivamente);
entretanto, as propores 85:15 e 90:10, apesar de promoverem uma
reduo no tempo de reteno, levaram diminuio da resoluo. A
proporo 80:20 foi a escolhida por propiciar uma melhor resoluo,
alm de utilizar menor quantidade de solvente orgnico. No entanto,
no decorrer das anlises, variaes signicativas nos parmetros
cromatogrcos (rea, fator de cauda e resoluo dos picos) foram
observadas. Essas variaes foram atribudas a mudanas nos valores
de pH durante o ensaio. Cabe salientar que em meio levemente cido e
neutro, mesmo com pequenas variaes nos valores de pH, a ionizao
do frmaco muda drasticamente, pelo fato de que o tioconazol uma
base fraca. Desta forma, optou-se pela adio de uma base fase
mvel, a m de manter o tioconazol na forma no ionizada, sem ser
necessrio o uso de soluo tampo para o controle do pH. A escolha
de hidrxido de amnio e da concentrao utilizada foi baseada no
mtodo descrito pela Farmacopeia Americana.
3
A fase mvel composta por metanol:gua:NH
4
OH (80:20:0,18,
v/v), mostrou-se adequada, proporcionando picos com boa resoluo
(prximo a 3), simtricos (fator de cauda em torno de 1,2) e com pratos
tericos em torno de 5.000. Aps a denio das condies cromato-
grcas, o mtodo foi validado quanto especicidade, linearidade,
limites de deteco e quanticao, preciso, exatido e robustez.
No que diz respeito especicidade, o mtodo mostrou-se espec-
co para a anlise do tioconazol, no sendo observada a interferncia
dos excipientes e/ou solvente no pico cromatogrco do frmaco.
A Figura 2 mostra a sobreposio dos cromatogramas obtidos para
a amostra (NC-TIO), soluo de trabalho e para a soluo placebo
(NC-B), demonstrando que nenhum pico referente aos excipientes foi
detectado no tempo de reteno do tioconazol e nem mesmo prximo
a ele. A anlise da pureza do pico demonstrou a especicidade do
mtodo, uma vez que o ndice de pureza encontrado foi de 1,000,
conrmando a ausncia de outras substncias coeluindo no mesmo
tempo de reteno do frmaco.
Aps 15 h de exposio do frmaco luz UVC, vericou-se
que o teor residual de tioconazol associado s nanopartculas foi de
44,36 % em relao ao valor obtido no tempo zero. Observou-se a
formao de picos adicionais, que podem ser referentes a produtos
de degradao do tioconazol ou dos excipientes. Cabe salientar que
o mtodo cromatogrco desenvolvido permitiu a total separao
do pico cromatogrco do frmaco e de seus possveis produtos de
degradao, o que foi evidenciado pelo ndice de pureza do pico
(> 0,9999) e pela boa resoluo dos picos adjacentes (R>2) (Figura 3).
Dessa forma, o mtodo pode ser utilizado em estudos de estabilidade
do tioconazol.
Na anlise da linearidade, a curva analtica descrita pela equao
y = 52105x - 386,7 apresentou coeciente de correlao prximo a
unidade (r = 0,9999), o que demonstra que o modelo proposto foi
adequado. A anlise estatstica evidenciou regresso linear signi-
cativa (F
calculado
= 64.256,05 > F
tabelado
= 4,75) e ausncia de desvio de
linearidade (F
calculado
= 1,74 < F
tabelado
= 3,26), em nvel de conana de
95%. Tais resultados demonstraram que o mtodo proposto linear
na faixa de concentrao de 5 a 50 g mL
-1
. Os valores de LQ e LD
foram de 0,61 g mL
-1
e 0,18 g mL
-1
, respectivamente, demonstrando
a sensibilidade do mtodo para baixas concentraes do frmaco.
Os resultados obtidos para a preciso (repetibilidade e preciso
intermediria) esto expressos na Tabela 1. O desvio padro relativo
(DPR) para a repetibilidade foi de 1,42% e para a preciso interme-
diria foi de 1,17%, indicando que o mtodo desenvolvido preciso
Figura 2. Cromatogramas obtidos por CLAE-UV para: (a) formulao
placebo (NC-B); (b) soluo de tioconazol (20,0 g mL
-1
) e (c) suspenso
de nanocpsulas polimricas contendo tioconazol (NC-TIO) (20,0 g mL
-1
)
Figura 3. Cromatogramas obtidos por CLAE-UV para o tioconazol associado
nanocpsulas polimricas no tempo zero (a) e aps 15 horas de exposio
luz UVC (b)
Tabela 1. Resultados obtidos na preciso do mtodo analtico por CLAE-UV (repetibilidade e preciso intermediria) para a quanticao do tioconazol em
nanocpsulas polimricas
Concentrao terica
(g mL
-1
)
Concentrao experimental
(g mL
-1
DP)
Teor
(% DP)
DPR
(%)
Repetibilidade (n = 6) 20,0 19,99 0,28 99,95 1,42 1,42
Preciso intermediria
Dia 1 (n = 3) 20,0 19,74 0,14 98,70 0,68 0,69
Dia 2 (n = 3) 20,0 19,93 0,33 99,64 1,64 1,65
Dia 3 (n = 3) 20,0 19,67 0,18 98,35 0,90 0,92
Mdia DP (n = 9) 19,78 0,23 98,89 1,15 1,17
Desenvolvimento de um mtodo para a determinao de tioconazol associado a nanocpsulas polimricas 999 Vol. 37, No. 6
dentro da faixa de concentrao e das condies adotadas. Os valores
de recuperao alcanados para o ensaio de exatido esto entre 98
e 102 %, demonstrando que o mtodo possui exatido satisfatria
24

(Tabela 2).
A Tabela 3 demonstra os resultados encontrados na robustez do
mtodo analtico. O mtodo no foi afetado pelas pequenas variaes
no comprimento de onda, vazo e nem mesmo pela mudana da marca
da coluna, uma vez que no houve diferena signicativa entre os
teores de tioconazol encontrados nas nanocpsulas polimricas e os
obtidos nas condies recomendadas (p>0,05), indicando a robustez
do mtodo cromatogrco desenvolvido.
Mediante o conjunto dos resultados, foi possvel vericar que o
mtodo cromatogrco desenvolvido adequado para a anlise do tio-
conazol, podendo ser aplicado em estudos de fotoestabilidade e para
a quanticao do frmaco incorporado em matrizes complexas como
as nanocpsulas polimricas, devido sua seletividade satisfatria.
CONCLUSO
Neste trabalho, um mtodo rpido, simples e eciente por croma-
tograa lquida de alta ecincia com deteco UV foi desenvolvido
para a quanticao do tioconazol em nanocpsulas polimricas. O
mtodo proposto mostrou-se especco, robusto, preciso, exato e
linear na faixa de concentrao de 5 a 50 g mL
-1
, demonstrando a
conabilidade do mesmo e seu potencial de aplicao para a quanti-
cao do frmaco no nanocarreador proposto. Alm disso, quando
comparado com os mtodos cromatogrcos j relatados, o mtodo
proposto apresenta como vantagens a facilidade na preparao da
fase mvel, a reduo de solventes orgnicos e a no utilizao de
soluo tampo, que so relacionados a maiores custos e cuidados
preventivos do equipamento.
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Tabela 2. Resultados obtidos para o ensaio de exatido do mtodo analtico
por CLAE-UV para a quanticao do tioconazol em nanocpsulas polim-
ricas (n = 3)
Amostra
Quantidade
adicionada
(g mL
-1
)
Quantidade recuperada
(g mL
-1
DP)
Recuperao
(%) DP
R1 6,0 6,02 0,05 100,3 0,9
R2 10,0 9,99 0,15 99,9 1,5
R3 14,0 13,95 0,16 99,6 1,2
Recuperao mdia (%) 99,9 0,4
DPR 0,35
R1, R2 e R3: amostras acrescidas da soluo estoque (10 g mL
-1
).
Tabela 3. Anlise da robustez do mtodo analtico por CLAE-UV para a
quanticao do tioconazol em nanocpsulas polimricas (n = 3)
Condies
Pratos
tericos
Fator de
cauda
Tempo de
reteno
Teor de
tioconazol
(%) DP
Condies otimizadas
a
5.521 1,2 7,2 99,41 1,10
Vazo (mL min
-1
)
0,8 6.131 1,5 9,0 99,51 0,05
1,2 5.038 1,1 6,2 99,40 0,19
(nm)
216 5.626 1,3 7,3 100,05 0,71
222 5.603 1,3 7,3 100,83 1,82
Coluna
b
3.478 1,2 5,5 99,57 0,04
a
vazo de 1,0 mL min
-1
; deteco UV a 219 nm; coluna Gemini

Phenomenex
C-18.
b
Nanoseparation (150 x 4,6 mm).