Anda di halaman 1dari 20

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Oleh :
DIAN SUSANTI H 0711035




JURUSAN/PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA

BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang
semakin pesat. Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang
sering diterapkan adalah bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan
berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses
biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme maupun
menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia. Secara umum
bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan
bioteknologi modern.
Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan
mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Produk
dari bioteknologi tradisional tersebut antara lain: tempe, oncom, yoghurt, dan
keju. Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan hingga
ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya. Dengan
ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang
DNA, muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan
bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi
yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen
spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri,
hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi modern, misalnya insulin,
kloning domba Dolly, antibodi monoklonal.
Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai macam disiplin
ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi
sel (tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia
(tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan
yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Polymerase Chain Reaction atau
yang lebih dikenal dengan istilah PCR. PCR adalah suatu metode in vitro untuk
menghasilkan sejumlah fragmen DNA spesifik dengan panjang dan jumlah
skuens yang telah ditentukan dari jumlah kecil template kompleks.
PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat
diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika
populasi, dan analisis forensik. Teknik DNA rekombinan telah memberikan
perubahan secara signifikan dalam ilmu genetika karena memungkinkan
terjadinya isolasi dan karakteristik gen-gen, mempelajari secara rinci fungsi dan
ekspresi selama proses perkembangan terjadi, sebagai respon terhadap
lingkungan. Mengingat peningnya peranan teknik PCR ini terhadap
perkembangan ilmu pengetahuan kedepan, maka dalam makalah ini akan dibahas
tentang teknik PCR, prinsip-prinsip PCR, pertimbangan penggunaan PCR, dan
manfaat PCR.
1.2. Rumusan Masalah
Dari latar belakang tersebut, maka dapat dicari beberapa rumusan masalah
yang dapat dibahas, antara lain:
1. Apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)?
2. Apasaja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)?
3. Alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction
(PCR)?
4. Apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase
Chain Reaction (PCR)?
5. Apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?
6. Apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?



1.3. Tujuan
Dari rumusan masalah tersebut, maka beberapa tujuan yang ingin dicapai
anatara lain:
1. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan pengendalian ekspresi genetik
2. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR).
3. Untuk mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction
(PCR).
4. Untuk mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam
Polymerase Chain Reaction (PCR).
5. Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam
proses Polymerase Chain Reaction (PCR).
6. Untuk mengetahui apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).
7. Untuk mengetahui apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR).
1.3. Manfaat
Manfaat yang diperoleh dari penulisan makalah ini adalah bagi penulis dan
pembaca dapat memperoleh pengetahuan tentang proses Polymerase Chain
Reaction (PCR) serta manfaat dari PCR bagi manusia.








BAB II
PEMBAHASAN

2.1. Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR
(Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di
bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya
memerlukan jumlah sampel yang kecil. Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida
secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan
bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan
PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA
target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah 2006).
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in
vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda,
penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension)
oleh DNA polimerase dari arah terminal 5 ke 3. Hanya saja pada teknik PCR
tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR
dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer
oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq
DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan
menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai
diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan.
Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk
mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua
target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi
sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas
penggunaannya (Saiki et al., 1988 dalam Mahmuddin, 2010).
PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan
menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung
5dari dua untaian skuen target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer
(primer PCR) untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase.
Untuk mendukung terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali
diperlukan untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.
Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan DNA polimerase yang stabil
terhadap panas, seperti polimerase Taq. Awalnya enzim diisolasi dari bakteri
Aquaticus Thermus. DNA polimerase enzimatis ini merakit sebuah untai DNA
baru dari pembangunan blok DNA, nukleotida , dengan menggunakan DNA
beruntai tunggal sebagai template dan oligonukleotida DNA (juga disebut primer
DNA ), yang dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode
PCR menggunakan siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan
sampel PCR untuk serangkaian langkah pasti suhu. Langkah-langkah siklus
termal yang diperlukan pertama yang secara fisik memisahkan dua helai dalam
heliks ganda DNA pada suhu tinggi dalam proses yang disebut DNA leleh . Pada
suhu yang lebih rendah, masing-masing untai kemudian digunakan sebagai
template dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA untuk selektif memperkuat
DNA target. Selektivitas hasil PCR dari penggunaan primer yang komplementer
ke wilayah yang ditargetkan untuk amplifikasi DNA di bawah kondisi spesifik
siklus termal.


2.2. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat,
penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.
Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas
tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan
primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu
90-95C selama beberapa menit (Campbel et al. 2008).
Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai
berikut:
1). Denaturasi.
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi
dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi
menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya
reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya
dilakukan antara suhu 90
o
C 95
o
C.
2). Penempelan Primer.
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju
daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses
annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan
komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC
60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan
hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali
apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.
3). Reaksi Polimerisasi (extension).
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi
pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami
perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang komplemen
dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang
maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara
eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga
mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n
adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi,
seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu
siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3
siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan
berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq
DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan
penambahan satu nukleotida A pada ujung 3 dari potongan DNA yang
dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan
menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5-
nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut
thermocycler.










Gambar 1. Proses Amplikasi Secara Eksponensial.



Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh
tahapan berikut:
a) Pra-Denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan
kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-
start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
b) Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15
menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR
terakhir.














Gambar 2. Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)



2.3. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in
vitro antara lain(Mahmuddin (2010)):
1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan
diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing
sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP
campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat
dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL,
# 5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, #
5524UB)
Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest
Scientific)



2.4. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)
Mahmuddin (2010), menyampaikan beberapa komponen-komponen PCR
antara lain:
1) Enzim DNA Polymerase
Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow
fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini
ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga
peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim
ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi
kurang spesifik. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam
perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang
memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim
tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan
dalam satu mesin
2) Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang
mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan
diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang
urutan primer, perlu diketahui urutannukleotida pada awal dan akhir DNA
target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang
disebut DNA synthesizer.
3) Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut
menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP
untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Konsentrasi
ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis.
Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing,
denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.

2.5. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)
Ada banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:
1. Alel-spesifik PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada -
nukleotida polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan
sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan
menggunakan primer yang 3 'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR
dalam kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian
antara template dan primer, amplifikasi sukses jadi dengan kehadiran sinyal
primer spesifik-SNP dari SNP spesifik secara berurutan.
2. Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang
panjang dengan melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan
segmen tumpang tindih pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa
dan arah antisense, dan segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen
PCR, sehingga selektif menghasilkan produk DNA panjang akhir.
3. Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA
beruntai ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi
probing amplifikasi hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan.
PCR dilakukan seperti biasa, tetapi dengan kelebihan besar primer untuk
untai yang ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat aritmatika
amplifikasi) kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah
digunakan Facebook, siklus PCR tambahan yang diperlukan.
4. Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi
menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan
annealing / siklus ekstensi. DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds
DNA, digunakan di tempat denaturasi termal.
5. Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama
proses set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan
memanaskan komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95C)
sebelum menambahkan polimerase. Khusus sistem enzim telah
dikembangkan yang menghambat polimerase, aktivitas pada suhu sekitar,
baik oleh mengikat dari antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat
kovalen yang terdisosiasi hanya setelah suhu aktivasi langkah-tinggi. Hot-
start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak
aktif pada suhu kamar dan akan segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.
6. PCR spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang
memperkuat daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk
menghasilkan sidik jari yang unik dengan panjang fragmen diperkuat.
7. Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit
sekitar genom sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan
ligasi diri, sehingga diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak
diketahui.
8. Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan
DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah
digunakan untuk sekuensing DNA , berjalan genom , dan DNA footprinting.
9. PCR spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim
Herman di Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk
mendeteksi metilasi dari CpG pulau dalam DNA genom. DNA pertama
diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah unmethylated basa sitosin
ke urasil, yang diakui oleh primer PCR sebagai timin. Dua PCR kemudian
dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali
pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik ini, satu set
primer mengakui DNA dengan sitosin untuk mengamplifikasi DNA alkohol,
dan satu set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk mengamplifikasi
DNA unmethylated. MSP menggunakan qPCR juga dapat dilakukan untuk
mendapatkan informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang metilasi.
10. Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang
dapat memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10
nukleotida. Metode ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR
primer daerah yang lebih kecil, dan digunakan untuk memperkuat sekuens
DNA, seperti atau eukariotik 18S rRNA).
11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa
sasaran diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga
menghindari keterbatasan resolusi PCR multipleks.
12. Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR
tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik
untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus,
informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan
membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk
melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus
dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran
amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk
membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis
gel .
13. Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan
mengurangi latar belakang karena khusus non amplifikasi DNA. Dua set
primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi
pertama, sepasang primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA,
yang selain target yang dimaksud, masih dapat terdiri dari fragmen DNA
non-khusus diperkuat. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR
kedua dengan satu set primer yang mengikat situs sebagian atau seluruhnya
berbeda dari dan terletak 3 'dari masing-masing primer yang digunakan
dalam reaksi pertama. Nested PCR sering lebih berhasil dalam memperkuat
fragmen spesifik DNA yang panjang dari PCR konvensional, tapi
membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang urutan target.
14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi
(BUMN): sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice
bersama lebih fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal
ini digunakan untuk bergabung dengan potongan DNA yang mengandung
gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik tersebut memungkinkan
penciptaan DNA spesifik dan panjang konstruksi.
15. Kuantitatif PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR
(umum secara real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA,
cDNA, atau RNA. Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah
urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel.
Kuantitatif real-time PCR memiliki tinggi tingkat yang sangat presisi. QRT-
PCR metode menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Green,
EvaGreen atau fluorophore DNA probe yang mengandung seperti TaqMan,
untuk mengukur jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini juga
kadang-kadang disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-
PCR atau RTQ-PCR sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya
mengacu pada reverse transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan
dalam hubungannya dengan Q-PCR.
16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari
RNA. Reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang
kemudian diamplifikasi dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam
profiling ekspresi , untuk menentukan ekspresi gen atau untuk
mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan
situs penghentian. Jika urutan DNA genom gen diketahui, RT-PCR dapat
digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam gen. 5 'akhir
dari gen (sesuai dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh
RACE-PCR (Rapid Amplifikasi cDNA End).
17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ): untuk isolasi dari suatu
urutan yang tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan
diketahui, TAIL-PCR menggunakan sepasang nested primer dengan suhu
yang berbeda anil; degenerate primer digunakan untuk memperkuat yang
lain dari arah yang tidak diketahui.
18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR): sebuah varian dari PCR yang
bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap
menurunkan suhu anil sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada
awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 C) di atas m T primer yang
digunakan, sedangkan pada siklus kemudian, ini adalah beberapa derajat (3-
5C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih
besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin lebih
amplifikasi efisien dari produk tertentu terbentuk selama siklus awal.

2.6. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:
1. Amplifikasi urutan nukleotida.
2. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
3. Bidang kedokteran forensik.
4. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print.
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan,
diantaranya:
a) Isolasi Gen.
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat
besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di
dalamnya mengandung ribuan gen. Fungsi utama DNA adalah sebagai
sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein,
DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan
untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang
DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen,
sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA
sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai
contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi
atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan
tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau
babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen
penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel
bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin.
Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh
manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat,
mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang
harus mengorbankan sapi atau babi.
Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan
nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen
yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR
menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
b) DNA Sequencing.
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA
Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger
(chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-
dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan
pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR
biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide
yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa
berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa
ditentukan.
c) Identifikasi Forensik.
Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban),
atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi
secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA
adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun,
kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian
tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian
yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik
jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak
kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa
dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Banyak orang yang juga yang memanfaatkan pengujian ini untuk
menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang
tua merasa ragu.
d) Diagnosa Penyakit.
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi
sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit
berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR
merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini
memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut
akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan
ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau
makhluk lainnya.









BAB III
PENUTUP

3.1. Kesimpulan
Kesimpulan dari pembahasan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah
sebagai berikut :
1. Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan
untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua
target DNA.
2. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA
templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai
DNA.
3. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR), Enzim DNA
Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu
tinggi; Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang
mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak.
Panjang primer berkisar antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP
untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2.
4. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) seperti: Alel-spesifik PCR,
Polymerase Cycling Assembly, Asymmetric PCR, Hot Start PCR, PCR
spesifik Intersequence, Inverse PCR, Mediated PCR Ligasi, dll.
5. Manfaat Polymerase Chain Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan
nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang
dengan membandingkan DNA finger print.


DAFTAR PUSTAKA

Andi 2011. PCR (Polimerase Chain Reaction). www. http://www.medicinenet.com.
Diakses pada 24 Mei 2014.
Campbel et al. 2008. Biologi Jilid II. Erlangga. Jakarta.
Campbell dan Farrell. 2008. Biochemistry Sixt Edition. Brooks/cole. Kanada.
Elrod,S., dan William S. 2011. Genetika edisi 4. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Fatchiyah 2006. Polymerase Chain Reaction : Application to the clinical
Laboratory, Laboratory Roche Diagnostis Research, p. 23-32, 45-49
Mahmuddin 2010. Molecular Cell Biology. Scientific American Book Inc. New
York. p. 99-76
Mahmuddin, 2010. Polimerase Chain Reaction (PCR).
http://mahmuddin.wordpress.com. Diakses pada 24 Mei 2014.
Nasir, M 2002. Bioteknologi Molekuler. Citra Aditya Bakti. Bandung.
Saiki james R. and Owens Krista 1988. Rapid and Specific Detection of the
O15:K52:H1 Clonal Group of Escherichia coli by Gene-specific PCR, J.Clin.
Microbiol. 42:3841-3843
Sandra, R.N 2011. Polimerase Chain Reaction. http://restunidia.blogspot.com/.
Diakses pada 24 Mei 2014.
Stanfield, W., dkk. 2009. Biologi Molekuler dan Sel. Erlangga. Jakarta.
Winda 2011. Polimerase Chain Reaction. http://en.Polymerase_chain_reaction.
Diakses pada 24 Mei 2014.

Anda mungkin juga menyukai