k

OFICINA ESPANOLA
DE
PATENTES Y MARCAS

19

k
ES 2 091 161
kNumero de solicitud: 9500730
kInt. Cl. : C07K 16/00

11 N. de publicaci
on:
21

51

ESPANA

A61K 39/395

12

SOLICITUD DE PATENTE

71 Solicitante/s: Grupo Grifols, S.A.

72 Inventor/es: Ristol Debart, Pere y

74 Agente: Dur
an Moya, Luis Alfonso

22 Fecha de presentaci
on: 12.04.95

Polgono Levante
Can Guasch, 2
08150 Parets del Valles, Barcelona, ES

43 Fecha de publicaci
on de la solicitud: 16.10.96

Camarero Torrecillas, David

43 Fecha de publicaci
on del folleto de la solicitud:

16.10.96

A1

54 Ttulo: Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramascular inactivada por pasteu-

rizaci
on.

57 Resumen:

ES 2 091 161 A1

Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on.
Procedimiento para la preparaci
on de gammaglobulinas intramusculares polivalentes o especficas en el
cual se incluye una etapa de inactivacion vrica especfica mediante pasteurizacion en solucion. En las
condiciones de proceso de la presente invencion no
se detecta alteracion significativa de las moleculas
de Ig o de sus actividades biologicas anticuerpo, as
como presencia de formas moleculares agregadas o
desnaturalizadas. Tiene aplicaciones antitetanicas,
antihepatitis y anti-D (Rh).

Venta de fasc
culos: Oficina Espa
nola de Patentes y Marcas. C/Panam
a, 1 28036 Madrid

ES 2 091 161 A1
DESCRIPCION
Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on.
5

10

Campo de la invenci
on
Esta invencion describe un procedimiento adecuado para la preparaci
on industrial de gammaglobulina intramuscular, polivalente o especfica (antitet
anica, anti-D (Rho), antihepatitis B), inactivada por
pasteurizacion en etapa terminal, previa al ajuste de excipientes y filtracion esterilizante por membrana,
de forma tal que el riesgo de contaminacion vrica cruzada posterior a la pasteurizaci
on es muy reducido.
Objeto de la invenci
on

15

El objeto primario de la invencion es proporcionar un metodo adecuado para inactivar vricamente por
pasteurizacion una soluci
on de gammaglobulina purificada, sin que ello suponga una desnaturalizaci
on
proteica o alteracion de las moleculas de gammaglobulina.
Estado actual de la t
ecnica

20

25

30

35

40

45

50

55

60

El riesgo de transmisi
on vrica por administraci
on de hemoderivados por va intravenosa o intramuscular debe tenerse en cuenta principalmente para los productos no inactivados en una etapa especfica. No
obstante, la seguridad vrica ha quedado demostrada durante decadas por la administraci
on de gammaglobulina obtenida en base al metodo de fraccionamiento de Cohn-Oncley.
Sin embargo, en los u
ltimos a
nos se han producido algunos casos aislados de transmisi
on de virus,
especialmente hepatitis C (o NoA NoB) en preparados de gammaglobulina negativa frente anti-hepatitis
C.
Como es sabido, el metodo de fraccionamiento de Cohn-Oncley tiene cierta capacidad de separar/inactivar los virus contenidos en el plasma. Sin embargo, esta capacidad de eliminaci
on de virus,
se debe mayoritariamente al fenomeno fsico de la precipitacion de protenas con etanol en fro. As
los virus tambien son susceptibles de ser fraccionados y eliminados en los subproductos resultantes. El
potencial de eliminaci
on de virus depender
a de las caractersticas fsico-qumicas de estos, obteniendose
resultados de reducci
on vrica diferentes en funci
on del tipo de virus (as por ejemplo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), se comporta de diferente forma que el virus de hepatitis C (VHC), al realizar
el proceso de Cohn-Oncley para gammaglobulina).
En vista de ello, es indispensable reforzar el potencial de eliminaci
on de virus,sea por inactivaci
on o
separaci
on (partici
on), del actual proceso de producci
on de gammaglobulina a partir de la Fracci
on II del
mencionado procedimiento de Cohn-Oncley.
La incorporaci
on de una etapa de inactivaci
on por pasteurizaci
on al proceso de producci
on se ha escogido en base a la conocida eficacia virucida de este procedimiento y a la ausencia de residuos qumicos
debidos al propio tratamiento de inactivaci
on. Otros metodos propuestos, tales como la esterilizacion
qumica por reactivos del tipo solvente organico di-o tri-alquil fosfato, s
olo o junto a un detergente no
ionico, por ejemplo polisorbato (Tween 80) o Triton (X-100), pueden inactivar efectivamente virus con
cubierta lipdica, pero requiere la introducci
on de etapas complementarias para la eliminacion de los
reactivos qumicos empleados.
Otro procedimiento tal como la retenci
on de virus por membrana conducen a reducciones significativas
de virus, por un mecanismo de separaci
on fsica en la cual intervienen los tama
nos de los virus a separar,
las moleculas de protena y el poro nominal de la membrana. La elecci
on apropiada de la membrana
permitir
a el paso de la protena (tama
no inferior al poro) y separar el concentrado en el que se hallar
an
los virus retenidos.
Si bien, la tecnica de membrana es muy atractiva, en la pr
actica se detectan dos problemas importantes. El primero de los cuales es que la proximidad de tama
nos entre las protenas globulares y los
virus m
as peque
nos no permite la separacion total de estos, y por otro lado el paso de protena puede ser
parcial de forma que se requiere una gran superficie de filtraci
on, resultando inviable el proceso a nivel
industrial para la producci
on de lotes de algunos Kg de protena seca de gammaglobulina.
Por tanto, la pasteurizaci
on parece ser la tecnica mas indicada si bien, no obstante, es conocido el
efecto desnaturalizante que el calor ejerce sobre las soluciones de gammaglobulina que conducen a la
2

ES 2 091 161 A1
agregacion o polimeracion de formas moleculares solubles por calentamiento a la temperatura de pasteurizacion (ver Rosenqvist, E. et al., Molecular Immunology, 24, n 5, pp. 495-501 (1987)).

Para superar el efecto de agregacion, el estado actual de la tecnica preve la posibilidad de utilizacion
ucares-alcohol (sorbitol), como agentes de estabilide az
ucares (Patente US N 4.440.679), as como az
zacion de gammaglobulinas durante la pasteurizaci
on (ver Notificacion Scottish Red Cross, The Lancet
(1 984); y Hirao, Y. et al., EPA N 01 96761 y 0278422).

10

La estabilizacion mediante az
ucares evita la desnaturalizacion de las protenas durante la pasteurizacion, pero ejerce asimismo un efecto de protecci
on frente a los virus (virus tales como parvovirus porcino
o de la vacuna, quedan estabilizados por la sucrosa durante la pasteurizaci
on).
Ello es debido a la elevada cantidad del estabilizante sucrosa a
nadida a la soluci
on de protena (50%
o superior) para evitar su desnaturalizaci
on.

15

20

25

30

El empleo de sorbitol como estabilizante primario conduce a resultados aceptables en cuanto a nivel
ua muy cerca del lmite m
aximo de % de
de agregacion (ver Patente EA N 01 96761), aunque se sit
formas polimerizadas solubles permisibles. La utilizacion de mezclas de estabilizantes por adicion de un
estabilizante secundario evita la actividad anticomplementaria (ACA) generada por pasteurizaci
on, lo
cual es interesante para la infusion intravenosa del preparado, pero no tiene ninguna relevancia para la
administracion intramuscular.
Asimismo, en el estado actual de la tecnica no se menciona la generacion de la coloraci
on parduzca
que se produce en mayor o menor extension durante la pasteurizaci
on y su relaci
on con los estabilizantes.
El aspecto fsico (coloracion) puede ser causa de rechazo de las preparaciones en estado lquido.
Ademas, los procesos de obtenci
on de gammaglobulina con inactivacion por pasteurizaci
on requieren de alguna etapa posterior de eliminacion de productos de agregaci
on, ya que la presencia de estos
es indeseable para la administracion intravenosa del producto. Independientemente de la va de administracion,la tecnica actual describe metodos complementarios para la eliminacion de los mencionados
productos de agregaci
on con el fin de aumentar la estabilidad de producto y reducir tambien la posible
pigmentacion o coloraci
on de la solucion.

35

El metodo de la invenci
on introduce la pasteurizaci
on de la gammaglobulina en etapa final de fraccionamiento, en unas condiciones tales que se controla la generacion de agregados y coloraci
on, de forma
que no se requieren las posteriores etapas de purificacion que describe el estado actual de la tecnica.

40

La presente invencion es fruto del estudio de los estabilizantes y mezclas de estos a diferentes condiciones del tratamiento de pasteurizacion. La posible interacci
on del estabilizante primario (sorbitol) con un
secundario (aminoacido: glicina) da lugar a coloracion sensible por espectroscopia UV-visible. Asimismo,
este efecto puede hacerse extensible a la propia protena y a su estado previo anterior a la pasteurizaci
on.
El control de la integridad molecular y la ausencia de formas desnaturalizadas (presencia de polipeptidos
y fragmentos) evita el riesgo de generacion de coloraci
on en la pasteurizacion.

45

50

Como consecuencia de los estudios realizados, los inventores han descubierto un medio de detecci
on y
de control de este fen
omeno en base a eliminar la presencia de los estabilizantes secundarios (amino
acidos),
mencionados por el estado de la tecnica y con un calentamiento progresivo (gradiente) de la solucion hasta
alcanzar la temperatura de pasteurizacion, de forma tal, que el contenido de oxgeno en solucion se haya
reducido sensiblemente y se minimice el efecto de oxidacion proteica, posiblemente responsable de la
generacion de coloraci
on, apreciable cuando se concentra la soluci
on de gammaglobulina.
Los estudios realizados tambien demuestran cierta dependencia entre la extension de la agregaci
on
producida, por efecto termico (alta temperatura) o presencia de agentes desnaturalizantes (etanol), y la
pigmentacion de la solucion.

55

Como resultado de las investigaciones ha sido posible obtener gammaglobulina intramuscular pasteurizada en forma liofilizada o liquida (16%) sin los inconvenientes que hasta la actualidad presentaban
estos productos, que en parte hacan inviable la preparaci
on industrial del producto inactivado.
60

Descripci
on detallada de la invenci
on
La presente invencion relata un procedimiento de obtenci
on de gammaglobulina intramuscular, poli3

ES 2 091 161 A1

valente o especfica, en el que se incluye una etapa de inactivaci

on vrica general para cualquier tipo de
virus (con y sin cubierta lipdica), mediante pasteurizaci
on de la protena en soluci
on, a la temperatura de
on. Para la realizacion de esta inactivaci
on por pasteurizaci
on se han
60C durante 10 horas de exposici
estudiado las condiciones precisas para el tratamiento, tales como concentraci
on proteica, presencia de
etanol, estabilizantes, pH, fuerza ionica, formas de calentamiento, temperaturas y tiempo de exposicion.

10

Todos los parametros anteriores de control y ajuste se han investigado con respecto a la generaci
on
de polmero y turbidez, as como por la presencia de pigmentacion parduzca en el producto final concentrado. Asimismo, se ha estudiado el espectro de anticuerpos y su estabilidad por pasteurizacion, y otros
par
ametros de pureza (electroforesis en acetato de celulosa).
El proceso de producci
on se completa estudiandose un procedimiento para la eliminacion del sorbitol
adicionado como estabilizante en la pasteurizacion, as como las etapas de pulido o purificacion final por
filtraci
on.

15

Tambien se ha comprobado la productividad y rendimiento proteico del proceso desarrollado que supera el 85% de recuperacion en el conjunto de estas etapas.
El procedimiento seguido para la producci
on de lotes industriales se describe a continuacion:
20

25

Se parte de una fracci

on rica en gammaglobulina, preferentemente de la Fraccion II del metodo
de Cohn-Oncley, con una pureza > 95% en gammaglobulina. La Fraccion II se suspende en cantidad
suficiente de agua fra para inyecci
on para llevar a la concentracion entre un 5 y 15% de protena, y
preferentemente entre un 6 y 10%. Seguidamente se le a
nade glicina hasta un 0,5%, y preferentemente
entre el 0,1 y 2%, ajust
andose el pH de la soluci
on entre 6,0 y 8,0, y de forma preferente, entre 6,5 y 7,0.
A continuaci
on, se a
nade bentonita, preferentemente entre 0,1 a 0,2 g por Kg de protena seca. Se somete a un tratamiento de adsorcion por agitaci
on de la solucion de gammaglobulina y bentonita durante
0,15 a 10 h, y preferentemente entre 1 y 3 horas a temperatura comprendida entre 0 y 5C.

30

35

40

La suspension de gammaglobulina y bentonita se separa preferentemente por centrifugaci

on entre 2000
y 15000 g (Supercentrfugas del tipo Sharples de RIERA NADEU, Westfalia de WESTFALIA SEPARATOR, SORVALL de Ivan Sorvall, Inc. o equivalentes), recuper
andose un sobrenadante que es clarificado
por filtraci
on en placa de celulosa con carga (Marcas CUNO, SEITZ, MILLIPORE o equivalentes). La
operaci
on de clarificaci
on puede optativamente realizarse directamente por filtracion por placa de celulosa
con carga sin necesidad de recurrir a la centrifugacion previa, pero aumentando en este caso la superficie
de filtraci
on.
La anterior etapa de proceso (adsorci
on con bentonita), tambien es optativa y puede ser omitida,
de forma tal que partiendo de la Fraccion II reconstituida en solucion de glicina a las condiciones anteriormente indicadas, esta es clarificada directamente por filtros de celulosa con carga (Marcas CUNO,
SEITZ, MILLIPORE o equivalentes).

50

La solucion clarificada, ajustada a pH 5,5 - 6,0 se somete a di

alisis por ultrafiltraci
on, emple
andose
entre 3 y 7 vol
umenes de agua fra para inyecci
on como soluci
on de di
alisis, y de forma preferente 5
vol
umenes en total. El equipo de ultrafiltraci
on se compone de membranas de polisulfona (marcas MILLIPORE, FILTRON o equivalentes) preferentemente, o de otro material similar con porosidad nominal
de 5 a 100 KD, y preferentemente de 10 a 50 KD. La diafiltraci
on frente a agua para inyecci
on permite
eliminar el etanol residual que contiene la Fracci
on II, y as evitar el efecto de desnaturalizaci
on durante
la pasteurizacion posterior.

55

Seguidamente la solucion diafiltrada se diluye con agua fra para inyecci

on hasta una concentraci
on
proteica de 1 a 9% y preferentemente de 2,5 a 5%. Se a
nade el estabilizante D-sorbitol a razon de 150
a 1000 g por litro de solucion, y preferentemente de 250 a 500 g por litro de soluci
on actual. Una vez
conseguida una buena disoluci
on, se ajusta el pH entre 5,0 y 7,0, y preferentemente entre 5,5 y 6,5.

45

A continuaci
on, se realiza una filtraci
on optativa, con el fin de reducir la carga microbiana, empleandose filtros de poro nominal inferior a 0,5 m.
60

La solucion se somete a pasteurizacion a la temperatura de entre 59,5 y 63,CC, y preferentemente

on. El
entre 60,0 y 61,0C, durante 10 a 20 horas y preferentemente entre 10 y 11 horas de exposici
calentamiento se puede realizar en depositos especiales con camisa de calefaccion y agitador interno in4

ES 2 091 161 A1

10

15

20

25

corporado (procedimiento industrial), o en recipientes hermeticos de peque

no volumen y por inmersi
on
total en ba
no de agua. En cualquiera de los anteriores casos, el calentamiento de la solucion desde la
on (60 -61 C), se
temperatura de la soluci
on filtrada (0 a 35 C) hasta la temperatura de pasteurizaci
realizar
a por gradiente termico, de forma tal que la duraci
on no sea inferior a 1 hora ni superior a 5 horas
en este perodo de precalentamiento.
on de
La solucion pasteurizada, es enfriada a temperatura inferior a 10 C y es clarificada por filtraci
profundidad con placas de celulosa con carga positiva (Marcas CUNO, SEITZ o equivalentes) y con una
porosidad mnima tal que retenga totalmente las partculas superiores a 0,5 m, o bien, por filtraci
on
tangencial sobre membranas de fluoruro de polivinilideno (TFF de PVDF correspondiendo al nombre
comercial de DURAPORE) de 0,65 a 0,22 m de poro preferentemente.
A continuaci
on, el producto se diluye con agua y se concentra por ultrafiltraci
on con membranas de
polisulfona (Marcas MILLIPORE, FILTRON o equivalentes) preferentemente, y porosidad equivalente
de 5 a 100 KD y preferentemente de 10 a 50 KD. Una vez la concentracion proteica se halla entre un
5 y 10%, se inicia la di
alisis a volumen constante emple
andose entre 4 y 7 vol
umenes de una soluci
on
compuesta por los excipientes necesarios para obtener la formula final adecuada. Finalmente se concentra
en el mismo equipo de ultrafiltraci
on hasta un 15-19% de protena. La solucion obtenida se reajusta a la
potencia especfica si es requerida y se filtra esterilmente por membrana de 0,22 m (de PVDF, esteres
celulosicos, o equivalentes). A continuacion la solucion se dosifica a viales, ampollas o jeringas, para presentaciones liofilizadas o lquidas de gammaglobulina intramuscular polivalente o especfica a la potencia
requerida.
El producto obtenido tiene una actividad anticuerpo especfica similar al de una gammaglobulina no
inactivada, es estable durante la cuarentena y almacenamiento posterior, tanto sus presentaciones liofilizadas como lquidas.
Asimismo, la gammaglobulina cumple las especificaciones de Pharmacopea.

30

Usos y ventajas
Hasta la actualidad no se ha considerado relevante la inactivaci
on vrica de las gammaglobulinas polivalentes o especficas intramusculares, debido a la seguridad demostrada durante a
nos de administraci
on
de este tipo de preparados.

35

No obstante, recientemente ha sido puesto en duda esta total seguridad, y de aqu la necesidad de
inactivar vricamente el producto.

40

El producto obtenido por el proceso descrito es nuevo, ya que hasta la fecha no se ha desarrollado comercialmente una gammaglobulina intramuscular con las caractersticas citadas de actividad -estabilidadinactivaci
on vrica, y sustituir
a en el futuro a la gammaglobulina circulante.
En cuanto al proceso objeto de la invenci
on aventaja a otros de similares caractersticas en los siguientes puntos:

45

1. Introducci
on de la pasteurizacion en etapa final del fraccionamiento, con lo cual se reduce mucho
el riesgo de contaminacion vrica cruzada.

50

2. Posterior a la inactivaci
on por pasteurizaci
on no se requiere etapa especial de eliminacion o reducci
on de contaminantes o productos de degradaci
on, tal y como ocurre al preparar gammaglobulina
intravenosa pasteurizada que requiere la separaci
on de los mencionados subproductos de degradaci
on por
metodos de precipitaci
on y/o cromatografa, seg
un se conoce por el estado actual de la tecnica.

55

3. Pueden procesarse grandes cantidades de producto en equipos de reducido tama

no, ya que al contrario de otros metodos descritos puede realizarse el proceso a una concentracion proteica relativamente
elevada.
4. El producto es estable durante su almacenamiento, mantiene su actividad especfica y no genera
coloraci
on y mantiene el nivel de agregacion por debajo del lmite de especificaciones.

60

ES 2 091 161 A1
Ejemplos de la invenci
on
Ejemplo N 1
5

Unos 600 ml de soluci

on bulk de gammaglobulina concentrada al 16% de protena total, conteniendo
glicina 2,25% y cloruro s
odico 0,3% a un pH de 6,5, se sometio a di
alisis exhaustiva frente a agua para
on total del
inyeccion empleando un cartucho de cuprophan de 1,2 m2 (Marca 1-DEC M-11). La duraci
proceso fue de 1 hora, finalizando cuando la conductividad se situ
o a un valor inferior a 0,5 ms/cm.

10

La solucion resultante se ajust

o al 4,5% de protena y a pH 6,0 con acido clorhdrico. A continuaci
on,
se prepararon muestras alcuotas a diferentes concentraciones de estabilizantes y se sometieron a pasteuon total de las muestras en un ba
no
rizacion a la temperatura de 60-61C durante 10 horas, por inmersi
de agua termostatizado. Despues de la pasteurizacion se enfriaron las muestras a temperatura de +5 C.

15

Los resultados de distribuci

on molecular expresado por el % de agregados/polmeros solubles obtenidos
por permeacion en gel (HPLC) se resumen en la siguiente tabla N 1:
TABLA N 1

20

(%)
Sorbitol

Estabilizante
(%)
Glicina NaCl (m)

% Polmeros
antes pasteurizar

% Polmeros
despues pasteurizar

0,33
0,33
0,33
0,33
0,33
0,33
0,33
0,59

27,4
1,27
1,42
1,72
1,70
2,96
13,2
1,48

25

No
33
33
33
33
33
33
33

30

35

40

No
No
No
No
No
No
No
0,5

No
No
0,001
0,005
0,01
0,1
1
No

Estos resultados muestran la necesidad de emplear un estabilizante primario, como el sorbitol a un

33% (p/p) para evitar una generaci
on relevante de % polmeros. Se comprueba asimismo, que la ausencia
de cloruro s
odico puede disminuir la agregaci
on, y que la presencia de un estabilizante secundario del
tipo amino
acido (glicina) no queda en absoluto justificada.
Ejemplo N 2

45

Una solucion de gammaglobulina al 16% se ajust

o a diferentes concentraciones de protena y pH, y
se estabilizo con sorbitol (33% p/p) y glicina (0,5 al 1,25%). Seguidamente se pasteurizo por inmersi
on
on molecular
de las muestras en ba
no de agua a 60-61C durante 10 horas. Los resultados de distribuci
expresados en % de agregados/polmeros solubles obtenidos por permeaci
on en gel (HPLC), as como los
resultados de turbidez obtenidos por nefelometra, se indican en la siguiente tabla N 2:

50

55

60

ES 2 091 161 A1
TABLA N 2
Concentraci
on proteica
5

pH.

9%

10

15

6%

3%

Polmero
(%)

Turbidez
(NTU)

Polmero
(%)

Turbidez
(NTU)

Polmero
(%)

Turbidez
(NTU)

5,5

3,55

7,7

3,05

6,3

1,63

6,0

2,34

10,4

1,91

7,8

1,43

5,3

6,5

1,79

13,4

1,85

10,2

1,63

9,1

20

25

30

Las mejores condiciones para realizar la pasteurizacion son aquellas que generan menor % de polmeros
y turbidez.
Asimismo, interesa que la concentracion de protena sea la mayor posible a fin de obtener una alta
capacidad de producci
on. Seg
un los resultados obtenidos, estas se hallaran a una concentraci
on proteica
de entre 3 y 6, y preferentemente de 2,5 a 5, y a un pH alrededor de 6,0.
Ejemplo N 3

35

40

Una solucion de gammaglobulina bulk concentrado al 16% de protena, se diluy

o con agua para
inyeccion hasta un 4,5% de protena y se ajust
o a pH 6,0. A continuaci
on se a
nadi
o, sorbitol a raz
on de
500 g por cada litro de soluci
on actual, y cantidades conocidas de etanol del 95%.
Las muestras obtenidas se pasteurizaron por inmersion en ba
no de agua a 60-61C durante 10 horas.
El an
alisis de permeacion en gel (HPLC) revelo el % de agregados/polmeros solubles de las muestras.
Los resultados se indican en la siguiente tabla N 3:
TABLA N 3

45

% EtOH

% Polmero

Antes pasteurizar

Despues pasteurizar

Diferencia

2,11
0,76
0,32
0,27
1,48

4,31
3,11
3,03
5,03
15,96

2,20
2,35
2,71
4,76
14,48

50

55

60

0
0,5
1
2
4

La presencia de etanol en la solucion de gammaglobulina a concentraciones superiores al 0,5% induce

a la formacion de polmeros, por lo que su presencia es totalmente indeseable. As pues, las soluciones
de gammaglobulina procedentes de la Fracci
on II obtenida por precipitaci
on con etanol, se dializar
an
7

ES 2 091 161 A1
exhaustivamente para eliminar el etanol contenido en estas.
Ejemplo N 4
5

Una solucion de gammaglobulina se llevo al 4% de concentraci

on proteica y pH de 6,0. Se estabilizo
con sorbitol hasta el 33% (p/p) y se pasteuriz
o durante 10 horas por inmersi
on de las muestras en ba
no
de agua termostatizado a diferentes temperaturas. Los valores hallados de % de polmeros/agregados
solubles obtenidos por permeaci
on en gel (HPLC), se reflejan en la siguiente tabla N 4:
TABLA N 4

10

Temperatura ( C)

Polmeros (%)

59,5
60,0
61,0
63,0

1,00
1,31
1,47
3,08

15

20

Los anteriores resultados muestran la posibilidad de pasteurizar a cualquiera de las anteriores temperaturas, incluso a 63C, sin rebasar el lmite maximo del 5% de polmeros descrito en Pharmacopea.
25

30

35

Ejemplo N 5
Varios lotes de gammaglobulina (Fracci
on II) procedentes de diferentes fraccionamientos de plasma
fueron dializados para eliminar el etanol (mediante ultrafiltro con membrana MILLIPORE o FILTRON
de 10 y 50 KD) y ajustados a 4,0 - 4,5% de protena y pH 6,0. Se estabilizaron con sorbitol hasta el 33% y
en algunos casos con glicina del 0,5 al 1,25%, sometiendose a pasteurizaci
on por inmersi
on de las muestras
en ba
no de agua a 60 - 61 C durante 10 horas. Posteriormente se filtraron por placa de profundidad
(Marcas CUNO con grado 10C, 30C y 50 SA), se dializaron y concentraron por ultrafiltraci
on (membranas
MILLIPORE o FILTRON de 10 y 50 KD) hasta el 16% de protena aproximadamente. Las muestras
se inspeccionaron visualmente, procediendose adem
as a la determinacion del espectro de absorcion UVvisible entre longitudes de onda de 700 y 300 nm, en las muestras diluidas de antes de pasteurizar y
de despues de concentrar, con la finalidad de establecer el rango de longitudes de onda en la cual se
observa mayor diferencia de absorbancia entre las muestras, y la posible correlaci
on con la coloraci
on
visual detectada. Los resultados se resumen en la siguiente tabla N 5:

40

45

50

55

60

TABLA N 5
Coloraci
on
despues
pasteurizar
(Sol. 16%)

Lote
fraccionamiento

Pardo
Gris-perLa
Pardo
Pardo
Gris-perla

401200
402300
401900
401300
402000

(nm) m
ax.
diferencia

330
330
330
330
330

350
350
350
350
350

Absorci
on (UA a 340 nm)
Despues
Antes
pasteurizar
pasteurizar
(Sol. 16%)

0,344
0,042
0,240
0,140
0,086

0,526
0,052
0,300
0,180
0,098

Existe una relaci

on significativa entre coloraci
on visual final (soluci
on concentrada al 16% protena)
y su espectro UV-visible a 340 nm aproximadamente. A m
as alta absorcion (UA) en la longitud de onda
de 340 nm, mayor coloraci
on de la solucion, correspondiendose con un mayor incremento de absorcion
entre la solucion antes y despues de la pasteurizacion.

ES 2 091 161 A1
Ejemplo N 6

Una solucion placebo con u

nicamente los estabilizantes, por separado o mezclados, se sometieron a
pasteurizacion por inmersi
on de las muestras en ba
no de agua termostatizado a 60C durante 10 horas,
determin
andose a continuaci
on el espectro de absorci
on UV-visible, y en especial a la longitud de onda
de 340 nm en las muestras de antes y despues de pasteurizar.
Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente tabla N 6:
TABLA N 6

10

Estabilizante

Absorcion (UA a 340 nm)

Antes pasteurizar Despues pasteurizar

Diferencia

15

20

25

Sorbitol (33%)
Glicina (2,25%)
Sorbitol+Glicina (33+2,25%)

0
0
0

0
0
0,106

0
0
0,106

Al superponer los espectros de absorci

on se observa una zona con diferencias destacables situada entre
400 y 300 nm, con un m
aximo diferencial a 340 nm, comprobandose un efecto de interacci
on entre los
dos estabilizantes empleados (primario y secundario), responsables en parte de la coloraci
on.
Ejemplo N 7

30

Un mismo lote de solucion de gammaglobulina ajustada al 4% de protena y pH 6,0, estabilizada con

sorbitol al 33% (p/p) se someti
o a pasteurizaci
on durante 10 horas, por inmersi
on en ba
no de agua a
diferentes temperaturas, con el fin de observar el espectro de absorci
on UV-visible y en especial la banda
de 340 nm. Los resultados obtenidos de las muestras anterior y posterior a la pasteurizaci
on se reflejan
en la siguiente tabla N 7:
TABLA N 7

35

Temperatura

Absorcion (UA a 340 nm)

Antes pasteurizar
Despues pasteurizar

40

45

59,5
60,0
61,0
63,0
63,0 (muestra
conteniendo 4% EtOH)

0,045
0,045
0,045
0,045
0,045

0,065
0,06
0,075
0,08
0,105

50

Ejemplo N 8

55

Una solucion de gammaglobulina preparada como en el Ejemplo N 7 anterior, se somete a pasteurizacion por inmersi
on en ba
no de agua realiz
andose un calentamiento progresivo de la soluci
on, de forma
que se alcanza la temperatura final de pasteurizaci
on de 60C despues de 3-4 horas. Se comparo el espectro de absorci
on UV-visible de la soluci
on antes y despues de pasteurizar determinandose la diferencia de
absorci
on a la longitud de onda de 340 nm. Los resultados se indican en la siguiente tabla N 8:

60

ES 2 091 161 A1
TABLA N 8

Tiempo de
precalentamiento
(horas)

10

< 1/2
4

15

Absorcion (UA a 340 nm)

Antes pasteurizar
Despues pasteurizar

0,06
0,06

0,09
0,06

Como puede comprobarse, un calentamiento inicial progresivo favorece el aspecto fsico (coloracion)
de la solucion final pasteurizada, debido posiblemente a una eliminaci
on de los compuestos que provocan
la pigmentacion de la solucion durante la etapa de precalentamiento (posible reducci
on del oxgeno en
disoluci
on con el producto).
Ejemplo N 9

20

25

Se determin
o la variabilidad de la actividad antitet
anica y antihepatitis B en distintos lotes de gammaglobulina y las perdidas debidas a la pasteurizaci
on. Para ello, se siguio el procedimiento de la invencion,
partiendo del equivalente a 100 - 500 g de Fraccion II, realizandose la diluci
on con soluci
on de glicina
al 0,5% a pH 6,8 y la adsorci
on con bentonita a raz
on de 0,5 g por Kg de protena seca, dejandose en
o por SORVALL RC-3 a 3500 rpm o Sharples
contacto durante 3 horas a +5 C. Seguidamente se centrifug
a 15000 rpm y se clarific
o por filtros de profundidad (Marca CUNO 30C y/o 50SA). El filtrado resultante
se ajust
o a un pH de 5,8 0,2 y se diafiltr
o por membranas de polisulfona de 10 KD (TFF PrepScale de
Millipore), o de 50 KD (cassettes serie Omega, FILTRON), empleandose en total 5 vol
umenes de di
alisis
de agua fra para inyecci
on.

30

35

40

45

50

La solucion resultante se diluy

o con agua fra para inyecci
on hasta el 4,0% de protenas y se adicion
o
sorbitol hasta una concentraci
on del 33% (p/p). Una vez disuelto el estabilizante se ajust
o a un pH de
6,0 0,1, filtr
andose por prefiltros del tipo CWSS de Millipore. Seguidamente, la soluci
on envasada en
un contenedor apropiado de 500 o 1000 ml, se sumergi
o en un ba
no de agua a una temperatura de 25 a
o un calentamiento progresivo hasta 60,0 - 60,5C, con una duraci
on de 3 a 5 horas, y se
30C. Se inici
dej
o 10 horas una vez alcanzada la temperatura de pasteurizaci
on.
o por filtros de profundidad (CUNO 50 SA o
La solucion pasteurizada y enfriada a +5 C, se clarific
90 SA), procediendose a continuaci
on a una diluci
on con agua para inyecci
on y concentracion por ultrafiltraci
on hasta un 5-7% de protena.
Las membranas empleadas fueron de polisulfona de 10 KD (TFF PrepScale, de Millipore) o de 50 KD
(cassettes serie Omega, de Filtron). En el mismo equipo se procedi
o a la dialisis frente al equivalente a
6 vol
umenes de solucion tamp
on de glicina 2,3% y cloruro s
odico 0,3%, de forma que al final del proceso
la osmolaridad de la soluci
on era pr
acticamente igual a la del tamp
on de di
alisis. Posteriormente se
concentro hasta el 17 2% de protenas. La solucion bulk se ajust
o a pH 6,5 0,1 y se esterilizo directamente por filtraci
on con prefiltros Sartobran (de Sartorius) o CWSS y MCGL 0,22 m (de Millipore),
obteniendose un bulk esteril, que se empleo para la preparaci
on de viales, jeringas e inyectables.
Se determinaron las actividades expresadas en UI/g protena de antitet
anica y antihepatitis en las
diferentes etapas de proceso, as como la agregacion molecular (% polmeros solubles). Los resultados se
reflejan en las siguientes tablas N 9, 10 y 11.

55

60

10

ES 2 091 161 A1
TABLA N 9
Potencia anti-HB (UI/g protena)
5

N Lote
proceso

Sol. antes
pasteurizar

Sol. despues
pasteurizar

Sol. bulk
conc.

10

401900
401200
401300

14,8
9,7
17,1

15,7
8,7
15,4

15,0
8,4
17,1

TABLA N 10

15

Potencia anti-T (UI/g protena)

20

25

N Lote
proceso

Sol. antes
pasteurizar

Sol. despues
pasteurizar

Sol. bulk
conc.

401900
401200
401300

198
2323
1961

243
2047
2079

183
2145
2240

TABLA N 11

30

Polmeros (%)

35

N Lote
proceso

Sol. antes
pasteurizar

Sol. despues
pasteurizar

40

401900
401200
401300

0,28
0,19
0,20

3,00
1,86
1,54

45

50

55

60

Ejemplo n 10
Se proces
o un lote de gammaglobulina antitet
anica al tama
no m
aximo de producci
on. Se parti
o de
24,0 Kg de la Fraccion II (lote 5101) del fraccionamiento de Cohn, suspendiendose en una soluci
on de
glicina al 0,5% y a pH 6,84, obteniendose una concentraci
on del 7,09% de protena (metodo biuret). Se
a
nadieron 915,2 g de bentonita a la soluci
on de Fr-II y se dej
o en agitaci
on 3 h a +3,0C.
A continuaci
on se centrifug
o por Sharples (Riera Nadeu) en rotor de 8 kg a 12000 rpm, siendo el sobrenadante obtenido clarificado por placas filtrantes 30 SA y 50 SA (CUNO), emple
andose en cada caso
o a pH 5,50 por adici
on de acido clorhdrico 1N.
una superficie de 0,96 m2 . El filtrado anterior se ajust
Se procedi
o a la diafiltraci
on por membranas de polisulfona de 10 KD (equipo PROSTAK de Millipore),
utiliz
andose para la di
alisis un total de 420 litros de agua fra para inyecci
on, siendo la duraci
on total del
proceso de 2 horas y 15 minutos.
La solucion diafiltrada se diluy
o hasta una D.O. (280 nm) de 57 UA, obteniendose un peso de 143,7
Kg, a los cuales se a
nadieron 70,5 Kg de D-sorbitol, y se ajust
o el pH a 5,98 por adicion de hidr
oxido
sodico 1N. Seguidamente se filtro por membrana de 0,22 m (Sart roban de 10), recogiendose el liquido
filtrado en un dep
osito de 250 litros con camisa de calefacci
on.

11

ES 2 091 161 A1
Se inicio el precalentamiento inyectando agua caliente por la camisa del dep
osito y manteniendose la
solucion en agitacion mecanica. La temperatura de la solucion alcanzo el valor de consigna de pasteurizacion en 1 hora y 25 minutos y se mantuvo entre 60,1 y 60,5C durante 10 horas.
5

10

15

20

25

o su
Posteriormente se enfri
o r
apidamente la solucion hasta una temperatura de +9,5 C y procedi
clarificacion por 2 placas 90 SA (CUNO) de 12 y 0,3 m2 de superficie respectivamente. La cantidad de
filtrado recogido fue de 223,4 Kg y su D.O. (280 nm) de 39,4 UA.
La solucion clarificada se concentro por membranas de ultrafiltraci
on de 10 KD de poro nominal,
empleandose un equipo PROSTAK (Millipore) de 5 m2 de superficie. Las condiciones operacionales de
presion fueron de 2,8 y 0 bares de entrada y salida, respectivamente. La solucion se concentr
o a 140,0 Kg
y se inicio la di
alisis a volumen constante por adici
on de una soluci
on tamp
on que contiene los excipientes
finales de la gammaglobulina: glicina 2,25% y cloruro s
odico 0,3%. Una vez consumidos 650 litros de
la anterior soluci
on tamp
on se comprob
o que la osmolalidad de la solucion de gammaglobulina era casi
igual a la de la soluci
on tamp
on, siendo de 418 y 3 90 mOsm/Kg respectivamente. A continuacion se
concentro hasta 30,7 Kg finales en el mismo equipo de ultrafiltraci
on, alcanz
andose una concentraci
on
proteica del 16,7%.
A partir de esta soluci
on bulk de gammaglobulina concentrada y pasteurizada, se prepararon tanto
las presentaciones lquidas (al 16% de protena), como la liofilizada, en jeringas o inyectables las primeras
y en viales la segunda, previo ajuste de potencia antitet
anica a 250 y 500 V.I., por adici
on de gammaglobulina inespecfica, y de excipientes, para conseguir la composici
on requerida.
Todo cuanto no afecte, altere, cambie o modifique la esencia del procedimiento descrito sera variable
a los efectos de esta Patente de Invencion.

30

35

40

45

50

55

60

12

ES 2 091 161 A1
REIVINDICACIONES

10

15

20

25

30

35

1. Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
en el que se parte de una fracci
on rica en gammaglobulina preferentemente de la Fraccion II del metodo
de Cohn-Oncley con una pureza mayor de 95 % en gammaglobulina, reconstituida en soluci
on de glicina y clarificada, caracterizado por someter a continuaci
on dicha fracci
on a di
alisis por ultrafiltraci
on,
diluyendo su concentraci
on proteica y a
nadiendo un estabilizante D-sorbitol y ajustando el pH, sometiendo la solucion a filtraci
on con filtros de poro nominal inferior a 0,5 m y sometiendo la solucion a
pasteurizacion, procediendo despues al enfriamiento de la solucion pasteurizada y posterior clarificacion
por filtraci
on de profundidad con placas de celulosa con carga positiva y con una porosidad mnima
que retenga totalmente las partculas superiores a 0,5 m, procediendo a diluir con agua y concentrar
por ultrafiltraci
on preferentemente con membranas de polisulfona, inici
andose despues de una preconcentracion la di
alisis a volumen constante y concentrando finalmente en el mismo tipo de ultrafiltraci
on y
procediendo al reajuste de la potencia especfica y filtrado esteril mediante membrana de 0,22 m, previo
a la dosificacion.
2. Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un la reivindicaci
on 1, caracterizado porque la soluci
on clarificada procedente de la reconstitucion
de la fracci
on II, es ajustada a pH 5,5-6,0 antes de dialisis por ultrafiltraci
on, emple
andose entre 3 y 7
vol
umenes de agua fra para inyecci
on como solucion de di
alisis y, de forma preferente 5 vol
umenes en
total.
3. Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el equipo de ultrafiltraci
on se compone de
membranas de polisulfona preferentemente o de otro material similar con porosidad nominal entre 5 y
100 KD y preferentemente entre 10 y 50 KD.
4. Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la soluci
on ya filtrada se diluye con agua
fra hasta una concentraci
on proteica de 1 a 9 %. preferentemente de 2,5 a 5 %.
5. Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado por la adici
on de D-sorbitol como u
nico estabilizante
a razon de 150 a 1000 g por litro de soluci
on y preferentemente entre 250 y 500 g por litro de soluci
on,
ajustando a continuaci
on el pH entre 5,0 y 7,0, preferentemente entre 5,5 y 6,5.
6. Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado por la realizaci
on de una filtraci
on para la reducci
on
de carga microbiana con filtros de poro nominal inferior a 0,5 m.

40

7. Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado por proceder a la pasteurizaci
on de la solucion a una
temperatura comprendida entre 59,5 y 63,0C, preferentemente entre 60,0 y 61,0C, durante un tiempo
comprendido entre 10 y 20 horas, preferentemente entre 10 y 11 horas.

45

8. Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el calentamiento de la soluci
on desde la
on,
temperatura de la soluci
on filtrada comprendida entre 0 y 35C a la temperatura de pasteurizaci
comprendida entre 59,5 y 63,0C se realiza por gradiente termico de forma que la duracion total no es
inferior a 1 hora ni superior a 5 horas de este perodo de precalentamiento.

50

9. Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizaci
on,
seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado por proceder a la eliminaci
on de subproductos o residuos insolubles por filtraci
on de profundidad.
55

60

10. Procedimiento para la producci

on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizacion, seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque despues de la pasteurizacion, diluci
on
con agua y concentrado por ultrafiltraci
on, se inicia la di
alisis a volumen constante empleando entre 4 y
7 vol
umenes de una soluci
on compuesta por excipientes para obtener la composicion final, concentrando
en el mismo equipo de ultrafiltraci
on hasta 15-19 % de protena.
11. Procedimiento para la producci
on de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizacion, seg
un las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la soluci
on final concentrada y ajus13

ES 2 091 161 A1
tada de estabilizantes, pH y potencia especfica, es esterilizable por filtros de membrana absolutos de 0,22
m, obteniendose una soluci
on lquida de gammaglobulina pasteurizada para administraci
on intramuscular. Las presentaciones lquidas y liofilizadas son estables, manteniendo su actividad como anticuerpo.
5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

14

kES 2 091 161

kN. solicitud: 9500730
kFecha de presentacion de la solicitud: 12.04.95
kFecha de prioridad:

11

OFICINA ESPANOLA
DE PATENTES Y MARCAS

21

ESPANA

22
32

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl.6 :

C07K 16/00, A61K 39/395

DOCUMENTOS RELEVANTES
Categora

Documentos citados

Reivindicaciones
afectadas

ES-2034999-T (GREEN CROSS CORPORATION) 16.04.93

* Pagina 2, lnea 1 - pagina 3, lnea 60 *

1,2,5,7,
9,10

EP-0196761-A (GREEN CROSS CORPORATION) 08.10.86

* Pagina 1, lnea 1 -pagina 3, lnea 20 *

1-11

EP-0278422-A (GREEN CROSS CORPORATION) 17.08.88

* Pagina 3, lnea 13 - pagina 5, lnea 58 *

1-11

US-4440679-A (FERNANDES et al.) 03.04.84

* Pagina 3, lnea 56 - pagina 6, lnea 57 *

1-11

Categora de los documentos citados

X: de particular relevancia

on no escrita
O: referido a divulgaci

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci

misma categora
A: refleja el estado de la tecnica

de la solicitud
es de la fecha
E: documento anterior, pero publicado despu
de presentaci
on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado

para todas las reivindicaciones
Fecha de realizaci
on del informe
11.04.96

para las reivindicaciones n :

Examinador
A. Collados Martn Posadillo

P
agina

1/1