Claudia Cecilia Barabata Flix pg.

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PCR FUNDAMENTOS Y APLICACIONES.
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en
ingls (polymerase chain reaction), es una tcnica de molecular desarrollada
en 1986 por Kary Mullis,
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cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de
un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de
una nica copia de ese fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la
amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas
(cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Dicha
tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y
bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas
entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de
ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios
repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a
diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres
pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un
choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro
hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje.
Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran
variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN,
la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la
temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se
desea amplificar. En primer lugar, se desnaturaliza el ADN. Este paso puede
realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra
la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la
cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente
empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos
capaces de realizar la desnaturalizacin. A continuacin se producir
la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia
complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a
40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el
alineamiento. Los puentes de hidrgenoestables entre las cadenas de ADN (unin
ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el
cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la
regin de la molcula que va a ser amplificada. Acta la ADN polimerasa, tomando
el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador
como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa
sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo
los dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los
dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se
extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que
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usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-
80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto de el ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a
amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la
polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto. Etapa nica que se lleva
a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de
PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado. Finalmente para conservar es un paso que se lleva a cabo a
4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La
PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en
pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean
tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de
acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la
matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de
agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de
forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente,
la electroforesis capilar.
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El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen
determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene
fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los
productos de PCR.

La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como
herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de
inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo
en diagnstico clnico en medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como
herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006): Permite el genotipar la
especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se
amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas
caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan identificarlo de
forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que implican la integracin del
genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin
por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y
por tanto, del estadio de la enfermedad.

La PCR tambin se puede usar en
revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para
test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones en el
donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin.
Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o
"pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras
colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente
menores hasta que se encuentra el causante. El diagnstico de enfermedades
hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede
acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se
pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente
secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.

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