Anda di halaman 1dari 27

TUGAS MAKALAH ANALISIS PANGAN

Analisis Kromatografi

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Analisis Pangan
















Disusun oleh :

Kelompok 8
Ratih Siswanina P. 240210120115
Hanni Listia F. 240210120116
Asti Arya N. 240210120117
Mahfud Ainun N. 240210120118
Rosaria Puspasari 240210120119









UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
JURUSAN TEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN
JATINANGOR
2014
BAB I
PENDAHULUAN

Analisis pangan adalah salah satu subbidang ilmu pangan yang berhubungan
dengan cara-cara atau metode analitik dalam mendeteksi dan menetapkan
komponen-komponen yang terdapat dalam bahan pangan baik segar maupun
olahan. Pengetahuan tentang analisis pangan sangat dibutuhkan oleh ahli ilmu dan
teknologi pangan, terutama untuk menentukan apakah suatu bahan atau produk
pangan mengandung komponen-komponen yang berbahaya atau tidak.
Pengetahuan tentang analisis pangan menjadi lebih penting dengan adanya
perkembangan yang pesat dalam teknologi pangan.Dengan teknologi pangan,
bahan pangan dapat diproses, dimodifikasi, diperbaiki, dan dimanipulasi menjadi
suatu produk yang sifatnya sudah berubah dari aslinya. Dengan analisis pangan
diharapkan setiap perkembangan ini dapat diikuti, sehingga produ-produk yang
dihasilkan tersebut tetap dapat dipantau segi keamanannya bagi konsumen selain
dari segi mutu yang sangat mempengaruhi perdagangannya.
Salah satu metode analisis pangan yang sering digunakan adalah metode
kromatografi. Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk
bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel di antara
suatu fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fase diam yang juga bisa
berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu kromatografi adalah Tswett yang
pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan
menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO
4
). lstilah kromatografi
diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang
bergerak ke bawah kolom. Metode analisis kromatografi memiliki banyak
manfaat, di antaranya yaitu pemisahan campuran, identifikasi, analisis kuantitatif,
dan analisis preparatif.





BAB II
PRINSIP DAN JENIS-JENIS KROMATOGRAFI

2.1. Prinsip Kromatografi
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen.
Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fase stasioner
(padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan
campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fase mobile).
Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam
kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase
mobil dan fase diam (stationer).
Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase-fase yang
digunakan dalam kromatografi. Fase gerak dapat berupa gas atau cair, dan fase
diam dapat berupa zat padat atau zat cair. Berdasarkan fase bergerak dan fase
diam, terdapat empat macam sistem kromatografi. Yaitu kromatografi gas-cair,
kromatografi gas-padat, kromatografi cair-padat, dan kromatografi cair-cair.

2.2. Jenis-jenis Kromatografi
Kromatografi adalah istilah umum yang diterapkan pada berbagai macam
teknik pemisahan berdasarkan partisi atau distribusi sampel (zat terlarut) antara
fase gerak dengan fase tetap atau stasioner. Interaksi relatif dari zat terlarut
dengan dua fase ini dijelaskan oleh koefisien partisi (K) atau distribusi (D), yaitu
rasio konsentrasi zat terlarut dalam fase diam untuk konsentrasi zat terlarut dalam
fase gerak. Fase gerak dapat berupa gas (GC) atau cairan (LC) atau fluida
superkritis. Fase diam dapat berupa cair atau biasanya berupa padat. Kromatografi
dapat dibagi dalam beberapa cara yang berbeda, sesuai dengan prinsip-prinsip
fisika yang terlibat dalam pemisahan atau sesuai dengan berbagai teknik yang
diterapkan. Tabel berikut meringkas beberapa prosedur kromatografi atau metode
yang telah dikembangkan atas dasar kombinasi fase gerak-stasioner yang berbeda.
Sejauh sifat interaksi antara molekul zat terlarut dan fase gerak atau stasioner
berbeda, metode ini memiliki kemampuan untuk memisahkan berbagai jenis
molekul.
Tabel 1. Karakteristik Metode Kromatografi
Metode
Fase Gerak/Fase
Stasioner
Retensi bervariasi dengan
Gas-liquid
chromatography
Gas/cairan Ukuran molekul/polaritas
Gas-solid
chromatography
Gas/padat Ukuran molekul/polaritas
Supercritical fluid
chromatography
Fluida superkritis/padat Ukuran molekul/polaritas
Reversed-phase
chromatography
Cairan polar/cairan atau
padatan nonpolar
Ukuran molekul/polaritas
Normal-phase
chromatography
Cairan kurang
polar/cairan atau padat
yang lebih polar
Ukuran molekul/polaritas
Ion-exchange
chromatography
Cairan polar/padat ionik Pertukaran molekul
Size-exclusion
chromatography
Cairan/padatan Ukuran molekul
Hydrophobic-interaction
chromatography
Cairan polar/cairan atau
padatan nonpolar
Ukuran molekul/polaritas
Affinity chromatography Air/binding sites Struktur spesifik
(Sumber : Nielsen, 2003)
Berdasarkan prinsip pemisahannya, terdapat lima macam kromatografi
antara lain sebagai berikut.
1. Kromatografi Adsorpsi (Adsorption Chromatography)
Fase diam pada kromatografi ini berupa padatan yang telah dihaluskan
(untuk memaksimalkan luas permukaan) dan fase gerak dapat berupa gas atau
cairan. Fase diam (adsorben) dipilih untuk memungkinkan interaksi diferensial
dengan komponen sampel yang akan dianalisis. Gaya yang terjadi antarmolekul
pada kromatografi adsorpsi ini meliputi gaya Van der Waals, gaya elektrostatik,
ikatan hidrogen, dan interaksi hidrofobik. Urutan elusi senyawa dari fase-fase
stasioner dapat diprediksi berdasarkan polaritas relatifnya. Senyawa polar yang
paling kuat pada adsorben polar akan dielusi terakhir. Zat terlarut nonpolar yang
kurang baik akan dielusi pertama. Kromatografi adsorpsi digunakan untuk
memisahkan senyawa nonpolar aromatik atau alifatik, seperti lipid, terutama
sesuai dengan jenis dan jumlahnya. Kromatografi adsorpsi juga telah digunakan
untuk analisis vitamin yang larut dalam lemak. Kromatografi ini sering digunakan
untuk menghilangkan kotoran dari sampel sebelum analisis lainnya. Misalnya
digunakan untuk analisis makanan, seperti lipid dalam minyak kedelai, karotenoid
dalam buah jeruk, dan vitamin E pada biji.
2. Kromatografi Partisi (Partition Chromatography)
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang
dapat diterapkan pada sistem multi komponen yang telah dibahas di bagian
sebelumnya. Dalam kromatografi partisi ekstraksi terjadi berulang-ulang dalam
satu proses. Dalam percobaan zat terlarut didistribusikan antara fase stasioner dan
fase mobile. Fase stasioner dalam banyak kasus pelarut diabsorpsikan pada
adsorben dan fase mobile adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antara
partikel yang teradsorbsi. Contoh kromatografi partisi adalah kromatografi kolom,
yang digunakan luas karena sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik.
3. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)
Kromatografi pertukaran ion-ion (ion exchange chromatography) biasanya
digunakan untuk penurunan materi biologis, seperti asam amino, peptida, dan
protein. Metode ini dapat dilakukan dalam kolom maupun ruang datar (planar).
Terdapat dua tipe penukaran ion yaitu penukaran kation (cation exchange) dan
pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner
bermuatan negatif. Sedangkan pada fase anion, fase stasioner bermuatan positif.
Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom diperlukan
penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan
menggunakan metode ini sangat selektif dan biasa digunakan pada awal proses
keseluruhan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya
tinggi.
4. Size-Exclusion Chromatography (SEC)
SEC juga dikenal sebagai kromatografi gel permeasi (GPC) dan
kromatografi gel filtrasi (GFC), merupakan metode yang paling mudah untuk
dilakukan dan dipahami. Hal ini banyak digunakan dalam ilmu biologi untuk
resolusi makromolekul, seperti protein dan karbohidrat, dan juga digunakan untuk
fraksinasi dan karakterisasi polimer sintetis. Dalam sistem SEC ideal, molekul
dipisahkan hanya berdasarkan ukurannya, yaitu tidak ada interaksi yang terjadi
antara zat terlarut dan fase diam. Fase diam di SEC terdiri dari bahan kemasan
kolom yang berisi pori-pori sebanding dalam ukuran molekul yang akan
difraksinasi. SEC dapat digunakan untuk fraksinasi campuran secara langsung
atau untuk memperoleh informasi tentang zat terlarut secara tidak langsung.
5. Kromatografi Afinitas (Affinity Chromatography)
Kromatografi afinitas adalah pemisahan yang didasarkan pada interaksi
spesifik dan reversibel antara molekul zat terlarut dan ligan bergerak pada fase
diam kromatografi. Kromatografi afinitas biasanya melibatkan bahan biologis tak
bergerak sebagai fase diam. Ligan yang selektif dan reversibel akan mengikat
molekul analit dalam sampel. Pemisahan memanfaatkan sistem lock and key
dalam pemisahan molekul. Prinsip-prinsip kromatografi afinitas adalah ligan
dipilih karena spesifik dan kekuatan interaksi antara dirinya dan molekul terisolasi
(analit) yang bergerak pada bahan pendukung yang sesuai. Sebagai sampel
dilewatkan melalui kolom, molekul yang saling melengkapi ligan terikat diserap
sementara komponen sampel lainnya dielusi. Ikatan dengan analit selanjutnya
dielusi melalui perubahan komposisi fase gerak .
Sedangkan berdasarkan teknik yang diterapkan, kromatografi terbagi
menjadi empat macam, antara lain sebagai berikut.
1. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas diperkenalkan pada tahun 1944. Meskipun adsorpsi
dengan kertas itu sendiri telah digunakan, kertas umumnya hanya berfungsi
sebagai pendukung untuk fase diam cair (kromatografi partisi). Fase diam dalam
kromatografi partisi kertas biasanya air. Namun, kertas tersebut dapat diresapi
oleh pelarut organik nonpolar dan dilanjutkan dengan pelarut polar atau air
(kromatografi kertas fase terbalik). Untuk melaksanakan teknik ini, sampel yang
telah dilarutkan diteteskan satu setengah inci atau lebih dari tepi strip kertas filter
(biasanya selulosa) dan dibiarkan kering. Strip kemudian disuspensikan dalam
wadah tertutup, dalam suasana yang jenuh oleh pelarut (fase gerak). Sampel
ditempatkan dalam kontak dengan pelarut, yang kemudian pelarut akan bergerak
naik atau turun pada kertas akibat gaya kapiler, memisahkan komponen sampel
selama proses berlangsung.
2. Kromatografi Layar Tipis (TLC)
TLC, pertama kali dijelaskan pada tahun 1938, telah menggantikan
kromatografi kertas karena lebih cepat, lebih sensitif, dan lebih direproduktif.
Resolusi di TLC lebih besar daripada kromatografi kertas karena partikel di piring
yang lebih kecil dan lebih teratur dari serat kertas. TLC diterapkan di berbagai
bidang, termasuk lingkungan, klinis, forensik, farmasi, makanan, rasa, dan
kosmetik. Dalam industri makanan, TLC dapat digunakan untuk pengendalian
kualitas. Misalnya, jagung dan kacang tanah yang diuji untuk aflatoksin atau
mikotoksin sebelum dilakukan pengolahan menjadi tepung jagung dan selai
kacang.
3. Kromatografi Kolom Cairan (Column Liquid Chromatography)
Kromatografi kolom adalah metode yang paling berguna untuk memisahkan
senyawa dalam campuran. Fraksinasi zat terlarut terjadi sebagai akibat dari
migrasi diferensial melalui tabung tertutup dari fase diam, dan analit dapat
dipantau sementara pemisahan sedang berlangsung.
4. Supercritical Fluid Chromatography (SFC)
Sebuah fluida superkritis adalah suatu fluida yang berada di atas kedua
tekanan kritis dan temperatur kritis (kombinasi dari mereka dikenal sebagai titik
kritis). SFC menawarkan berbagai penyesuaian selektivitas karena k' dan dapat
diubah oleh perubahan komposisi fase gerak dan fase diam. Selain itu, SFC
memungkinkan pemisahan nonvolatil, senyawa termal labil yang tidak dapat
dilakukan pada GC. SFC telah digunakan terutama untuk senyawa nonpolar.
Lemak, minyak, dan lipid lainnya adalah senyawa yang dipisahkan menggunakan
SFC.











BAB III
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau disebut sebagai
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) adalah sebuah instrumen yang
menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak
cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor
dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan
cara penyuntikan. Prinsip dasar metode HPLC adalah memisahkan setiap
komponen dalam sampel yang selanjutnya akan diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung konsentrasi dari masing-masing komponen (kuantitatif).
HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC berbeda dengan kromatografi
lainnya karena pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase
gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor, sehingga waktu retensinya yang didapat akan berbeda,
hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Berikut
merupakan diagram alir dari HPLC.

Gambar 1. Diagram Alir HPLC
(Sumber : chem-is-try.org)
Komponen-komponen yang digunakan dalam metode HPLC adalah sebagai
berikut.
1. Pompa
Pompa yang digunakan adalah kinerja konstan (constant pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat
dibagi lagi menjadi dua jenis, yaitu pompa reciprocating dan pompa syringe.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam
elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil,
bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utama dari pompa ini
adalah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran
yang tidak berdenyut, tetapi ukuran reservoir terbatas. Pompa yang ideal
digunakan memiliki syarat-syarat tertentu, yaitu mampu membangkitkan
tekanan tinggi, control laju alir yang akurat, tahan korosi, terbuat dari bahan
yang tahan terhadap fase gerak, dapat menyalurkan fase gerak pada rentang
kecepatan dan tekanan lebar, dapat bekerja pada tekanan sampai 6000 psi
(400 atm).
2. Injektor
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom.
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan
waktu di mana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum dari senyawa itu. Ada tiga tipe dasar injektor yang
dapat digunakan, yaitu :
a. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum : Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70
atmosfir, tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis
(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka
sampel akan masuk ke dalam kolom.
3. Kolom (column)
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat
digunakan kembali (reusable). Kolom diisi dengan partikel padatan yang
berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai
fase diam. Komponen-komponen sampel dibawa oleh cairan fase gerak yang
dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fase diam.
Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fase diam dan
fase gerak yang satu sama lain tidak bercampur.
Efisiensi kolom sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner,
bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan
berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan
efisiensi kolom. Kolom yang pendek dan efisiensi, yang tinggi pemisahan
akan berjalan dengan cepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung
pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang
yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang berukuran 5 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan
pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi,
terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
4. Detektor (detector)
Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis
kuantitatif). Detektor yang bagus memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan
(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons
untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan
fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak
senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga
digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya
kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.
5. Tendon (reservoir)
Tendon terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua
atau lebih. Tendon yang baik disertai degassing system yang berfungsi untuk
mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Degassing dilakukan dengan
mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium.
Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu. Untuk memperoleh
pemisahan yang optimum dianjurkan menggunakan solvent yang masih baru.
Daya tampung tendon harus lebih besar dari 500 ml yang dapat digunakan
selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1 2 ml/menit.
6. Elusi Gradien
Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak
selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari elusi gradien adalah
mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada
kolom. Keuntungan dari elusi gradien adalah total waktu analisis dapat
direduksi, resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran
bertambah, ketajaman peak bertambah (menghilangkan tailing), dan efek
sensitivitas bertambah. Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan.
Optimasi gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Dalam praktek,
gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
7. Pengolahan data (recorder)
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor
kemudian dikirim ke recorder. Recorder lalu akan membuat suatu tampilan.
Dalam kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC
dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas kromatogram
dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.
8. Fase Gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fase gerak adalah
salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi
yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk HPLCT, tetapi ada
beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu fase gerak harus murni (tidak
ada kontaminan), tidak bereaksi dengan wadah, sesuai dengan detektor, dapat
melarutkan sampel, memiliki viskositas rendah, memudahkan sample
recovery, harganya murah.
HPLC merupakan salah satu jenis dari kromatografi cair yang menggunakan
prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang
dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan
bantuan pompa, sedangkan pada kromatografi cair lain tidak digunakan pompa.
Keunggulan HPLC adalah :
a. HPLC dilengkapi dengan adanya pompa. Pompa ini menghasilkan tekanan
sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan
sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu
lebih sedikit. Pada pompa dikenal dua sistem dalam teknik pemisahan yaitu
isokratik dan gradient, namun gradient lebih bersifat akurat karena masing-
masing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda.
b. HPLC memiliki keunggulan kolom, di mana kolom HPLC ini lebih pendek
dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom
HPLC 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih
luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan
panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah
kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan
mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai.
c. HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC
memiliki beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor
fluorometrik, dan detektor elektrokimia.
d. Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga
ke detektor disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana
sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu. Biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang
digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, dan
temperatur kolom.
e. Kromatogram, kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram
yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil
mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya, karena bentuk tersebut menandakan
pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita
menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga
noise. Noise muncul jika sampel ataupun pelarut yang digunakan belum
belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk ke
dalamnya.
HPLC digunakan untuk untuk penentuan kualitatif dan penentuan
kuantitatif. Pada penentuan kualitatif, HPLC digunakan untuk analisa kualitatif
didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan
apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Beberapa
aplikasi HPLC dalam kehidupan adalah sebagai berikut.
1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi
dan pestisida.
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-
SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
7. Analisis Anion Nitrat (NO
3
-
)
Kandungan nitrat dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi
kualitas air. Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan
dengan pengembangan metode dapat diketahui validitas penggunaan HPLC
untuk analisis anion nitrat.
8. Analisis Vitamin C
Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin
C, yakni dalam menentukan susunan kimianya.
9. Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae
Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan berbagai
polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental
HPLC dengan selektifitas (resolusi) yang tinggi untuk komponen yang
termolabil. Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi
dibutuhkan cara eluasi gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu
mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan pada umumnya
ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa
metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip
pasangan ion.
10. Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis
Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara
kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah
ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat
dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara
tidak merusak.
11. Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa
Tanaman Obat
Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui
antara lain melalui metode HPLC dan FTIR (Fourier Transfrorm Infrared).
Penentuan kandungan senyawa aktif dilakukan melalui proses penghancuran
bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan HPLC dan FTIR. Proses ini
memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat diperlukan
metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara
penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif
atau penciri hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR
(absorban).







BAB IV
GAS CHROMATOGRAPHY (GC)

GC (gas chromatography) merupakan jenis kromatografi yang digunakan
dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis dengan menggunakan
gas sebagai fase penggerak. Kromatografi gas dapat digunakan untuk
mengidentifikasi komponen-komponen hasil pemisahan dan mengukur
konsentrasinya berdasarkan afinitas selektif komponen terhadap baha adsorben
(Agilent Technologies, 2002). Sampel yang akan dianalisis dimasukkan dalam
bentuk cair atau gas dengan jarum suntik ke dalam port injeksi kromatografi gas.
Sampel tersebut akan menguap pada suhu yang telah diatur kemudian melewati
kolom yang berisi fase diam dengan bantuan fase gerak yang mengalir terus dan
dipisahkan. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.
Hasil pemisahan akan terdeteksi oleh detektor dan divisualisasikan ke komputer
dalam bentuk peak.
Kromatografi gas pada prinsipnya sama dengan kromatografi lainnya, tetapi
memiliki beberapa perbedaan misalnya pada proses pemisahan menggunakan
kromatografi gas, fase stasionernya berupa cairan dan fase geraknya berupa gas.
Sedangkan pada kromatografi lain seperti kromatografi kolom, fase stasioner dan
fase gerak berupa cairan. Selain itu, pada kromatografi gas temperatur gas yang
digunakan dapat diatur sedangkan pada kromatografi kolom tidak memiliki
kontrol suhu. Kromatografi gas juga hampir sama dengan proses pemisahan
secara destilasi, karena keduanya memisahkan komponen dari campuran
berdasarkan titik didih. Hanya saja pemisahan secara destilasi biasanya digunakan
untuk memisahkan campuran pada skala besar, sedangkan kromatografi gas dapat
digunakan pada skala yang kecil.
Bagian-bagian penting dari kromatografi gas meliputi: sumber gas sebagai
fase gerak, inlet untuk memasukkan sampel ke kolom, kolom di mana terjadi
pemisahan, oven yang dilengkapi termostat untuk kolom, detektor untuk
mendeteksi bahan kimia di kolom, dan sistem data untuk merekam dan
menampilkan kromatogram. Selain itu, beberapa fasilitas diperlukan agar suhu
dari berbagai komponen dapat diketahui secara akurat dan dikendalikan (Eiceman,
2006). Berikut ini merupakan diagram alir dari kromatografi gas.

Gambar 2. Diagram Alir Kromatografi Gas
(Sumber : Agilent Technologies)
Komponen-komponen yang digunakan dalam metode GC adalah sebagai
berikut.
1. Gas supplies /Gas source
Fase gerak yang berupa gas pembawa dipasok dari tanki melalui
pengaturan pengurangan tekanan. Kemudian membawa sampel langsung ke
dalam kolom. Jika hal ini terjadi, sampel tidak menyebar sebelum proses
pemisahan. Cara ini cocok untuk sampel yang mudah menyerap. Gas
pembawa yang digunakan harus bersifat inert dan harus sangat murni.
Seringkali gas pembawa ini harus disaring untuk menahan debu, uap air, dan
oksigen. Adanya kontaminan dapat bereaksi dengan sampel atau kolom dan
menghasilkan kromatogram palsu. Gas yang sering digunakan adalah N
2
, H
2
,
He, dan Ar.

Gambar 3. Gas Source
(Sumber : Agilent Technologies)
Pemilihan gas pembawa sangat penting untuk diperhatikan. Gas yang
paling umum digunakan adalah hidrogen dan helium. Hidrogen digunakan
karena efisien dan memberikan pemisahan terbaik. Sedangkan helium
memiliki laju aliran dengan kisaran yang lebih besar, tidak mudah terbakar,
dan bekerja dengan lebih banyak detektor.
2. Sistem Injeksi Sampel (Inlet)
Inlet akan memasukkan sampel yang ke dalam kolom bersama dengan
fase gerak, yaitu gas pembawa. Sampel yang akan dianalisis harus berupa
cairan dan mudah menguap agar dapat dianalisis oleh kromatografi gas. Inlet
yang paling umum digunakan adalah port injeksi (injection ports) dan katup
pengambilan sampel (sampling valves).
a. Injection ports
Digunakan untuk menginjeksi sampel berupa gas atau cairan. Untuk
sampel cair, harus dipanaskan untuk menguapkan sampel. Desain dan
pemilihan port injeksi tergantung pada jenis dan diameter kolom. Jarum
suntik yang digunakan untuk memasukkan sampel akan menginjeksikan
melalui septum ke dalam aliran gas pembawa (fase gerak).

Gambar 4. Injection Port
(Sumber : Agilent Technologies)
b. Sampling valves
Sampel dialirkan keluar dari sebuah loop ke dalam aliran gas pembawa.
Katup pengambilan sampel yang digunakan untuk sampel cair berbeda
dengan sampel gas/uap, karena biasanya volume sampel berbeda.

Gambar 5. Katup Pengambilan Sampel
(Sumber : Agilent Technologies)
Pemasukkan sampel ke dalam kolom dapat dilakukan dengan cara
diinjeksi langsung (direct injection) maupun dengan cara diinjeksi tidak
langsung (indirect injection). Injeksi sampel secara langsung dilakukan
dengan memasukkan sampel ke dalam kolom tanpa terjadi kontak dengan
bagian-bagian lain dari kolom. Sedangkan injeksi sampel secara tidak
langsung dilakukan dengan memasukkan sampel ke dalam evaporator
kemudian uapnya ditransfer ke dalam kolom. Pada cara ini, diperlukan
pengaturan suhu.
3. Kolom
Pemisahan campuran menjadi komponen-komponen kecil terjadi di
dalam kolom. Sebagian besar pemisahan campuran sangat bergantung pada
suhu, sehingga kolom ditempatkan di dalam oven yang terkendali dengan
baik. Pemilihan jenis kolom tergantung pada sifat campuran dan jenis
informasi yang diinginkan. Namun, semua kolom berfungsi menggunakan
mekanisme dasar yang sama. Ada dua jenis kolom yang digunakan dalam
kromatografi gas, yaitu packed columns dan capillary columns.
a. Packed columns
Packed columns memiliki panjang 1,5-10 m dan memiliki diameter
dalam 2-4 mm. Kolom ini biasanya terbuat dari stainless steel atau kaca.
Di dalamnya berisi tabung-tabung kecil yang berbahan inert dan dilapisi
oleh fase stasioner. Tabung-tabung tersebut biasanya terbuat dari logam,
kaca, atau plastik. Packed column ini memiliki kapasitas sampel yang
tinggi dan paling banyak digunakan untuk sampel gas.

Gambar 6. Packed columns
(Sumber : Agilent Technologies)
b. Capillary columns
Capillary columns berupa tabung terbuka dengan fase stasioner melapisi
permukaan bagian dalamnya. Kolom ini memiliki diameter dalam yang
sangat kecil, berkisar antara 0,1-0,5 mm dan memiliki panjang antara 25-
60 m. Capillary columns menghasilkan peak yang sangat sempit
sehingga memungkinkan pemisahan campuran yang sangat kompleks.

Gambar 7. Capillary columns
(Sumber : Agilent Technologies)
4. Detektor
Aliran gas pembawa yang berisi komponen hasil pemisahan melewati
detektor. Detektor berfungsi untuk memonitor gas pembawa yang keluar dari
kolom dan merespon perubahan komposisi yang terelusi. Detektor akan
menghasilkan sinyal listrik yang stabil (baseline) ketika tidak ada komponen
yang terdeteksi dan menghasilkan sinyal yang berbeda ketika suatu
komponen hasil pemisahan melalui detektor. Hasil pemisahan yang dideteksi
oleh detektor akan muncul pada layar dalam bentuk kromatogram. Detektor
yang paling umum digunakan dalam kromatografi gas adalah flame ionization
detector (FID) dan thermal conductivity detector (TCD).
5. Recorder
Hasil pemisahan yang dideteksi oleh detektor akan muncul pada layar
dalam bentuk grafik peak. Fungsi recorder sebagai alat untuk mencetak hasil
percobaan pada sebuah kertas yang hasilnya disebut kromatogram (kumpulan
puncak grafik).
Kromatografi gas sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah
menguap seperti hidrokarbon dan ester. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan
besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Beberapa aplikasi kromatografi
gas dalam kehidupan sehari-hari adalah sebagai berikut.
1. Penentuan secara kualitatif maupun kuantitatif senyawa dalam protein yang
telah dimurnikan untuk keperluan biofarmasi.
2. Pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, dan vitamin.
3. Mengetahui konsentrasi sianida dari sampel ar liur perokok berat.
4. Mendeteksi suatu penyakit dalam tubuh manusia melalui air kencing, darah,
dan fluida badan lainnya.
5. Mendeteksi senyawa oksalat dalam air kencing pada pasien batu ginjal.
6. Menganalisis bahan-bahan kimia yang terkandung dalam bahan peledak,
seperti 2,4,6-trinitrotoluene (TNT), siklonit (RDX), tetril, pentaeritritol
tetranitrat (PETN), dan tetritol serta beberapa anion lain seperti perklorat,
klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfat, dan tiosianat.
7. Berperan penting dalam environmental analysis, misalnya analisis kualitas air
dengan mengetahui jenis dan jumlah anion dan kation yang terkandung dalam
sampel air.
8. Mengetahui kandungan ion sulfat (SO
4
2-
) dan nitrogen trioksida (NO
3-
) yang
terdapat dalam air hujan untuk antisipasi dini terhadap hujan asam.



















BAB V
REVIEW JURNAL ANALISIS KROMATOGRAFI

Jurnal yang di-review berjudul Penentuan Kadar Glukosa dan Fruktosa
pada Madu Randu dan Madu Kelengkeng dengan Metode Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi. Madu randu memiliki ciri rasanya manis, legit, dan agak gurih.
Sedangkan madu lengkeng berciri rasanya manis, legit, dan berarorma tajam.
Jenis gula pereduksi dalam madu adalah glukosa, fruktosa, maltosa, dan dekstrin.
Proses produksi madu oleh lebah kompleks, sehingga ada kemungkinan besar
terjadi perbedaan kadar dan komposisi gula pereduksi dalam madu yang beredar
di masyarakat.
Madu mengandung glukosa dan fruktosa. Glukosa berfungsi untuk
memperlancar kerja jantung dan meringankan gangguan penyakit hati (liver).
Glukosa diubah menjadi glikogen untuk membantu kerja hati dalam menyaring
racun dalam tubuh. Glukosa merupakan sumber energi bagi seluruh jaringan otot.
Fruktosa disimpan sebagai cadangan dalam hati untuk digunakan bila tubuh
membutuhkan dan juga untuk mengurangi kerusakan hati. Fruktosa dapat
dikonsumsi oleh penderita diabetes karena transportasinya ke sel-sel tubuh tidak
membutuhkan insulin (tidak mempengaruhi keluarnya insulin).
Metode yang digunakan dalam penentuan kadar glukosa dan fruktosa adalah
metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Keuntungan metode ini
adalah dapat digunakan pada senyawa dengan bobot molekul besar dan dapat
dipakai untuk senyawa yang tidak tahan panas. Pertimbangan menggunakan
metode ini adalah pemilihan detektor, kolom, pemilihan eluen, laju alir eluen, dan
suhu kolom. Hal-hal ini dapat mempengaruhi resolusi dari tiap-tiap komponen.
Bila dua puncak kromatogram dari dua komponen terpisah sempurna maka
resolusi dua komponen tersebut dapat dikatakan sempurna. Pemisahan masing-
masing komponen oleh KCKT harus dilakukan saat kondisi optimum. Pemisahan
yang baik adalah bila kromatogram masing-masing komponen tidak saling
tumpang tindih. Kondisi pemisahan dapat ditentukan saat pengukuran larutan
standar, eluen yang digunakan adalah air deionisasi pada kolom metakarb 87C
dan dideteksi dengan menggunakan detektor indeks bias.
Sampel diinjeksikan pada alat kromatografi dan sistem dibuat dengan
kondisi pemidahan terbaik, semua komponen dibiarkan terpisah. Hasil yang
diperoleh dilakukan uji kuantitatif dan uji kualitatif. Uji kualitatif dilakukan
dengan cara mencocokkan waktu retensi dari masing-masing puncak pada
kromatogram sampel dengan waktu retensi senyawa standar. Sedangkan uji
kuantitatif dilakukan dengan cara memplotkan luas area komponen-komponen
yang dianalisis ke dalam persamaan regresi linier. Plot hubungan antara
konsentrasi larutan standar dengan luas puncak dari masing-masing komponen,
hubungan antara konsentrasi dengan luas puncak persamaan regresi liniernya : y =
a + bx.
Eluen yang digunakan adalah air deionisasi karena murah dan tidak beracun.
Selain itu, sifat kepolaran air deionisasi sesuai dengan karbohidrat dan dengan
eluen tersebut pemisahan glukosa dan gruktosa menghasilkan resolusi yang baik.
Detektor indeks bias digunakan dalam penelitian ini karena detektor tersebut
sesuai untuk pemisahan kompinen-komponen karbohidrat.
Waktu retensi glukosa lebih cepat dibandingkan fruktosa. Hal ini
disebabkan karena adanya interaksi yang lebih kuat antara fruktosa (yang
mengandung gugus keton) dengan fase diam daripada interaksi antara glukosa
(yang mengandung gugus aldehid) dengan fase diam. Semakin mirip sifat
kepolaran antara senyawa yang dipisahkan dengan fase diam maka interaksinya
akan semakin kuat sehingga waktu retensi dari senyawa tersebut akan semakin
lama.
Laju alir dipercepat atau suhu kolom ditingkatkan maka waktu retensi
komponen lebih pendek. Jika terjadi kebalikannnya maka waktu retensi
komponen lebih lama. Hasil penelitian menunjukkan bahwa saat laju alir 1
ml/menit dan suhu kolom 80
o
C diperoleh pemisahan yang baik. Pada kondisi ini
waktu retensi yang diperoleh merupakan yang tercepat dan diperoleh resolusi
terbaik. Resolusi adalah cara untuk menjelaskan bagaimana dua puncak terpisah
satu sama lain. Bila puncak dua kromatogram dari dua senyawa terpisah sempurna
maka dapat dikatakan kedua senyawa tersebut terpisah secara sempurna. Resolusi
antara dua puncak adalah fungsi dari tiga faktor, yaitu retensi, selektifitas, dan
efisiensi kolom. Retensi merupakan lewatnya detektor dari kolom. Selektifitas
adalah ukuran kemampuan fase diam dalam membedakan dua senyawa. Efisiensi
kolom adalah ukuran luas pita-pita komponen menyebar dalam perjalanannya
sepanjang kolom. Suatu kolom yang lebih efisien akan menghasilkan puncak yang
lebih sempit dari kolom yang kurang efsien, untuk waktu retensi yang sama.
Sistem kromatografi yang digunakan dalam penelitian:
Kolom : Metacarb 87C
Eluen : Air deionisasi
Laju alir : 1 mL/menit
Suhu kolom : 80
o
C
Detektor : Indeks bias
Saat perlakuan sampel madu dilakukan sentrifugasi yang bertujuan untuk
memisahkan komponen larut air dan tidak larut air. Lapisan atas dari hasil
sentrifugasi disaring dan diambil filtratnya untuk kemudian diinjeksikan ke alat
KCKT.
Diagram Alir Jurnal:

















Samp
Sistem dibuat dengan kondisi pemidahan terbaik
Hasi
Uji kuantitaif Uji kualitatif
Hasil
Mencocokkan waktu retensi dari masing-masing
puncak pada kromatogram sampel dengan waktu retensi
Uji Kuantitatif











Uji Kualitatif








Pola kromatogram sampel menunjukkan bahwa pemisahan glukosa dan
fruktosa dalam sampel madu dapat dilakukan dengan baik. Pola kromatogram
juga menunjukkan adanya komponen-komponen lain berupa sakarida penyusun
madu seperti sukrosa, maltosa, laktosa, dan karbohidrat lainnya. Namun,
keberadaan komponen-komponen ini tidak mengganggu identifikasi komponen
utama.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar fruktosa lebih tinggi
dibandingkan kadar glukosa. Kadar glukosa madu kelengkeng lebih tinggi
dibandingkan kadar glukosa madu randu, berdasarkan rata-rata kadar glukosa.
Sedangkan, rata-rata kadar fruktosa madu randu lebih tinggi dibandingkan madu
kelengkeng. Hal ini menunjukkan bahwa madu randu lebih manis dibandingkan
Hasil
Hubungan antara konsentrasi dengan luas
puncak persamaan regresi liniernya:
y = a + bx
Plot hubungan antara konsentrasi larutan standar
dengan luas puncak dari masing-masing komponen
madu kelengkeng karena fruktosa memiliki rasa manis 2,5 kali dari glukosa.
Kadar gula pereduksi menurut SII minimal 60%, kedua jenis madu sudah
memenuhi kriteria tersebut karena kadar gula pereduksi total pada madu randu
adalah 68,12% dan pada madu kelengkeng adalah 68,12%. Madu palsu kadar gula
pereduksinya kurang dari 60% karena pada madu palsu sering dilakukan
pengenceran atau penambahan komponen lain seperti pemanis buatan, gula pasir,
dan pewarna makanan. Namun, pada beberapa kasus madu palsu kadar total gula
pereduksinya mencapai 60%. Hal ini dapat disebabkan oleh proses penyimpanan
madu yang cukup lama sehingga sukrosa dalam madu terurai menjadi glukosa dan
fruktosa.






















BAB VI
KESIMPULAN

Kesimpulan dari makalah ini adalah sebagai berikut.
Kromatografi adalah teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel di
antara suatu fase gerak dengan fase diam dengan bantuan perbedaan sifat fisik
masing-masing komponen.
Kromatografi dapat digolongkan menjadi empat macam sistem kromatografi,
yaitu kromatografi gas-cair, kromatografi gas-padat, kromatografi cair-padat,
dan kromatografi cair-cair.
HPLC adalah instrumen pemisahan dengan menggunakan fase gerak cair
yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor
dengan bantuan pompa.
Komponen-komponen yang digunakan dalam metode HPLC adalah pompa,
injektor, kolom, detektor, tendon (reservoir), elusi gradien, recorder, dan fase
gerak.
GC merupakan jenis kromatografi yang digunakan untuk pemisahan dan
analisis dengan menggunakan gas sebagai fase penggerak.
Pada kromatografi gas, fase stasionernya berupa cairan dan fase geraknya
berupa gas serta temperatur gas yang digunakan dapat diatur.
Komponen-komponen yang digunakan dalam metode GC adalah gas
supplies, sistem injeksi sampel (inlet), kolom, detektor, recorder
Pemisahan dan analisis kadar glukosa dan fruktosa pada madu randu dan
madu kelengkeng dapat dilakukan menggunakan teknik kromatografi cair
kinerja tinggi.
Kadar glukosa pada madu kelengkeng lebih besar daripada madu randu.
Kadar fruktosa pada madu randu lebih besar daripada madu kelengkeng.
Kadar glukosa dan fruktosa dari kedua jenis madu memenuhi syarat mutu
madu nasional (SII).



DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. 2002. Agilent Gas Chromatographs : Fundamentals of Gas
Chromatography. Agilent Technologies, Inc. : USA

Andarwulan, N., Feri K., dan Dian H. 2011. Analisis Pangan. PT. Dian Rakyat :
Jakarta

Eicemen, G.A. 2006. Instrumentation of Gas Chromatography. New Mexico State
University : USA

Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik, Jakarta : UI Press

Marra, Tine. 2004. Sains Kimia. Jakarta : Bumi Aksara

Nielsen, S.S. 2003. Food Analysis Third Edition. Kluwer Academic / Plenum
Publishers : New York

Sastrohamidjojo, H. 1985. Kromotografi. Yogyakarta : Liberty.

Anda mungkin juga menyukai