UNIVERSIDAD NACIONAL

JOS FAUSTINO SNCHEZ CARRIN

UNIVERISDAD NACIONAL
JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

BIOLOGIA GENERAL,
CELULAR Y MOLECULAR
TEMA

DOCENTE

PLSMIDOS
:

DR. HUGO SEGAMI SALAZAR

ALUMNO :
SAMANAMUD RAMIREZ,
CARLOS ALBERTO
CICLO

FECHA

I
:

16/ 06 / 09
HUACHO 2009
INTRODUCCION

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Aunque en general es adecuado decir que el genoma de los

procariotas consta de un solo cromosoma, muchas bacterias poseen,
adems,
uno
o
varios
elementos
genticos
accesorios
extracromosmicos, a los que denominamos plsmidos.
Se definen como elementos genticos extracromosmicos con
capacidad de replicacin autnoma (es decir, constituyen replicones
propios). Todos los plsmidos bacterianos estudiados son de ADN de
cadena doble. La inmensa mayora son circulares cerrados
covalentemente (c.c.c.) y superenrollados (aunque en Borrelia y
algunos Actinomicetos existen plsmidos lineares). Algunos plsmidos
poseen, adems, la capacidad de integrarse reversiblemente en el
cromosoma bacteriano: en esta situacin se replican junto con el
cromosoma (bajo el control de ste), y reciben el nombre de
episomas.
En cuanto al tamao, existe una amplia gama: desde plsmidos
muy pequeos (de unas 2 Kb) hasta plsmidos muy grandes (ciertos
plsmidos de Pseudomonas tienen 500 Kb). Incluso existen
megaplsmidos en ciertos Rhizobium que llegan a tener 1600 Kb.
(De hecho, ciertos megaplsmidos se ha visto que son
imprescindibles, por lo que se han recalificado como cromosomas).
Cada tipo de plsmido tiene un nmero medio de copias por
clula caracterstico. Por regla general, los grandes plsmidos tienen
una o dos copias por clula (plsmidos con control estricto de la
replicacin), mientras que los pequeos suelen estar presentes como
varias copias (>10), denominndose plsmidos de control relajado.

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LOS PLSMIDOS
Son pequeas molculas de ADN circular de 1 Kb a 200 Kb que se
pueden encontrar en las bacterias. Los plsmidos se replican y se
transmiten independientemente del cromosoma bacteriano. La
replicacin y la transcripcin de los plsmidos dependen de las
protenas de su hospedero. Los genes codificados por los plsmidos le
donan ciertos privilegios a la clula husped.
Los genes codificados por plsmidos, pueden donar resistencia a
antibiticos, producir antibiticos, degradar compuestos complejos,
producir colicinas, entero toxinas, enzimas de restriccin y de
modificacin. Esos gens, son en general tan importantes como los
normalmente localizados en el cromosoma de la bacteria.

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Existen varios tipos de plsmidos, clasificados de acuerdo al tipo de

genes que transportan: F ("factor sexual") : en Escherichia coli el
plsmido F contiene 25 genes, algunos de los cuales controlan la
produccin de los pilis , "tubos" que se extienden desde la superficie
de las clulas bacterianas "machos"( F +), a la de las clulas
bacterianas hembras ( F-).

Se denomina episoma a un plsmido incorporado al cromosoma

bacteriano. Los plsmidos se replican en manera similar al
cromosoma bacteriano.

El plsmido R confiere, a las clulas que lo poseen, resistencia a los

antibiticos o drogas. Un plsmido R puede llegar a tener hasta 10
genes que confieren resistencia y pueden transferirse a otra bacteria

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de la misma especie, a virus e inclusive, a bacterias de diferentes

especies.
La resistencia a los antibiticos ha sido encontrada en grmenes
patgenos causantes de enfermedades tales como: tifoidea,
meningitis, gonorrea y otras. Actan proporcionando la informacin
necesaria para destruir el antibitico o para circunvalar el bloqueo
que produce el antibitico en la va metablica bacteriana.
En el caso de una infeccin viral, el uso indebido o innecesario de
antibiticos matar a la poblacin bacteriana normal, quedando (o
seleccionando) las que tengan el factor R; stas pueden reproducirse
an en presencia del antibitico. La prxima vez que tenga una
infeccin bacteriana, las bacterias con factores R estarn listas para
transferir su factor a la nueva bacteria invasoras, que se harn
resistentes a los antibiticos.

ESTRUCTURA DE LOS PLSMIDOS

Los plsmidos extrados de una bacteria se encuentran
principalmente en forma superenrollada. El ADN as enrollado adopta
una configuracin ms compacta que el ADN menos enrollado y migra
entonces ms rpido que el otro durante una electroforesis.

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TRANSFORMACIN
Transformar una bacteria una levadura, consiste en introducirle una
molcula de ADN extranjero. Introducir un plsmido en una bacteria
es transformar una bacteria, o sea una transformacin. Para las
clulas eucariotas (no las levaduras), no se dice transformar sino
transfectar (transformar en clula eucariota quiere decir hacerla
eterna o hacerla cancerosa). Existen varios mtodos para introducir
un plsmido en una clula. Cada uno es en s una receta y cada uno
tiene una propia.

Transformacin con CaCl2 + choque trmico:

Consiste en aadir plsmidos a las bacterias tratadas con CaCl2
y de someterlas a un breve choque trmico (42C). La
utilizacin de otras sales de CaCl2 y la adicin de iones
metlicos aumenta la eficiencia de la transformacin. Para
plsmidos de 3 Kb, una transformacin eficaz produce alrededor
de 10+8 colonias/mg de ADN plasmdico superenrollado.

Electroporacin:
Es un procedimiento que consiste en someter las bacterias
suspendidas en agua a una diferencia de potencial elevado para
perforar temporalmente la pared celular.

Otros mtodos de transformacin:

Utilizan por ejemplo liposomas y son ms costosos.
La eficiencia de la transformacin es inversamente proporcional
a la talla del plsmido. Para identificar las bacterias
transformadas,
se
utilizan
marcadores
de
seleccin
proporcionados por plsmidos.
Los marcadores de seleccin ms utilizados son los gens de
resistencia a antibiticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el
cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las bacterias

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transformadas se cultivan en presencia del antibitico para

evitar que la bacteria pierda el plsmido que se le ha
introducido

CLONADO

Vector de clonaje: El principio de clonado consiste en insertar

un segmento de ADN extranjero en una molcula pequea
capaz de replicarse automtica. A se tipo de molcula de ADN
se lo denomina vector de clonaje.

Plsmidos recombinados: Los plsmidos son excelentes

vectores de clonaje. Puede ser "cortado" con una dos enzimas
de restriccin puede incorporrsele un fragmento de ADN que
ha sido previamente cortado usando mas mismas enzimas de
restriccin. Los plsmidos as modificados se los denomina
plsmidos recombinados. En ste estado, se los introduce
entonces en una bacteria donde sern replicados.

Enmarcador de seleccin: Es crucial el poder distinguir entre

las colonias que contienen los plsmidos recombinados de
aquellas que contiene ya sea plsmidos no recombinados que
no contienen ningn plsmido. Varios mtodos existen para
realizar sta distincin y se basan en el uso de un marcador de
seleccin. En el ejemplo de abajo por ejemplo, el marcador de
seleccin es la ampicilina.

Clonado en bacterias es: Insertar un segmento de ADN

extranjeros en un vector transformar las bacterias seleccionar
las bacterias transformadas

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El inserto de un segmento de ADN extranjero en un plsmido:

Transformacin de bacterias por el plsmido

Seleccin de bacterias transformadas

CUALIDADES DE UN VECTOR DE CLONADO

Los plsmidos deben ser pequeos y de replicacin con control
relajado. La mayora de los plsmidos en uso contienen un replicn
derivado del plsmido pMB1, inicialmente aislado de una muestra
clnica. En condiciones normales de cultivo, se encuentra un mnimo

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de 15 a 20 copias de plsmido que contienen el replicn en cada

clula bacteriana.
Deben contener marcadores genticos particulares, como gens de
resistencia a antibiticos el gen que codifica la -galactosidasa.
Deben contener uno ms sitios de restriccin nicos en una regin
que no sea esencial para la replicacin del plsmido.
Si es posible, debe tener sitios de restriccin nicos en los gens
codantes de marcadores selectivos. Esos marcadores son inactivados
cuando en ellos se inserta un fragmento de ADN extranjero.

REPLICACIN DE LOS PLSMIDOS

Como dijimos, los plsmidos son replicones, es decir, unidades de
replicacin autnoma, pero ello no significa que codifiquen toda la
maquinaria para su propia replicacin. De hecho, la mayora de los
plsmidos slo codifican unas pocas protenas para este fin, y
aprovechan la maquinaria de replicacin de la bacteria husped (ADN
polimerasas, ligasas, primasas, etc.), que acta sobre unas
secuencias del plsmido denominadas secuencias oriV, donde tiene
lugar el inicio de esa replicacin. Cada tipo de plsmido se replica por
uno de dos principales tipos de mecanismos:

Modelo de replicacin en (theta): comienza por la

separacin de las dos cadenas en el sitio oriV, creando una
estructura que se parece a la letra griega (theta). En algunos
plsmidos, la replicacin es unidireccional (slo hay una
horquilla de replicacin, que avanza a lo largo de la molcula,
hasta que vuelve al sitio oriV, en el que las dos molculas hijas
se separan). Otros plsmidos se replican en por un modelo
bidireccional (dos horquillas de replicacin de sentidos
opuestos, que se encuentran cerca de la mitad de la molcula).
La replicacin en es frecuente en plsmidos de bacterias
Gram-negativas.
Modelo de replicacin en s (sigma), o modelo del crculo
rodante: una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV, de

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modo que el extremo 3 suministra el cebador para la

replicacin de la cadena adelantada. La cadena desplazada
(cadena menos) funciona como cadena retrasada (lagging)
y debe ser replicada a partir de sitios de cebado especiales.
Este tipo de replicacin es frecuente en plsmidos de bacterias
Gram-positivas.

REGULACIN DEL NMERO DE COPIAS

La regulacin del nmero medio de copias de cada plsmido en cada
bacteria es una propiedad caracterstica dependiente de cmo se
controla el inicio de replicacin, siendo diferentes los mecanismos en
los plsmidos de alto nmero de copias (con control relajado) y en los
plsmidos de bajo nmero de copias (de control estricto).

En general, los plsmidos de control relajado tienen

mecanismos que inhiben el inicio de replicacin slo cuando el
nmero de copias ha llegado a un cierto nivel.
En cambio, los plsmidos de control estricto tienen mecanismos
que logran que slo se repliquen una vez o un pequeo nmero
de veces en cada ciclo celular.

REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CLULAS HIJAS

Muchos plsmidos poseen sistemas de reparto (= particin), que
tienden a asegurar que una vez que el plsmido ha sido replicado,
cada una de las clulas hijas va a recibir al menos una copia. A falta
de un tal sistema, y si el reparto fuera aleatorio, de vez en cuando,
las propias fluctuaciones de la segregacin aleatoria haran que parte
de la progenie no recibiera una copia, con lo que quedara curada de
ese plsmido.
El reparto de las copias a las clulas hijas se suele deber a las
llamadas funciones par, que estn cerca de los genes rep y de la zona
ori. Se trata de cortas secuencias de ADN que de alguna manera an
no aclarada, debe unirse a alguna zona de la membrana de la
bacteria que se duplica durante la divisin celular, de modo que cada
copia, unida a una de esas zonas, se segrega a una clula hija.

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PLSMIDOS Y MAMFEROS
1. PLSMIDOS DE EXPRESIN EN MAMFEROS
Se pueden utilizar plsmidos para la expresin de clones de ADNc en
mamferos. El ADNc se inserta en el sitio de clonaje. El plsmido se
multiplica en la E. coli utilizando para la seleccin un gen de
resistencia a la ampicilina. El plsmido as preparado se inserta en las
clulas de mamferos utilizando los mtodos de asemblaje ya
descritos como cuando se usa la E. coli.

Promotor, intrones y cola poly (A):

La figura aqu muestra uno de sos plsmidos. La mayora de los gens
de mamferos son monocistrnicos. En la prctica eso significa que
cada gen tiene su propio inductor/promotor y su cola poly(A). La
adicin de un intrn (una chimera de un intrn de la -globina y de
IgG) a lo largo del sitio de clonaje facilita la transcripcin.
Los promotores que se utilizan son de origen viral (cytomegalovirus y
Simian virus 40 SV40), que son promotores fuertes. Cada gen
termina por una cola poly(A).
Dos gens de seleccin:

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El gen de resistencia a la ampicilina sirve para la propagacin del

vector en las bacterias. El gen de resistencia a la neomicina sirve para
seleccionar las clulas de mamferos transfectadas. Las clulas de
mamferos son insensibles a la neomicina. En contra, el
aminoglycsido G418 es txico para los procariotas y los eucariotas.
Las clulas eucariotas transfectadas con el pCI no sin embargo
resisten al G418.
Transfecciones transitorias y estables:
Se denomina transfeccin transitoria aquella en la que el plsmido no
ha sido integrado a uno de los cromosomas eucariticos. Se habla de
transfeccin estable cuando el plsmido se ha integrado a uno ms
cromosomas eucariotas. La transfeccin se puede realizar utilizando
los mtodos procariotas.
Los transfectantes son seleccionados aadiendo G418 al medio de
cultivo. Para obtener transfectantes estables, se cultiva simplemente
las clulas varias semanas en presencia de G418. Es necesario sin
embargo verificar de vez en cuando que las clulas no han eliminado
el inserto que slo conservan el gen de resistencia.
Cotransfeccin:
La Cotransfeccin es la transfeccin simultnea de varios plsmidos.
Mediante la cotransfeccin se puede verificar si la transfeccin se ha
realizado correctamente. Para lograrlo se cotransfecta un plsmido
cuya presencia es verificada por una reaccin rpida y simple que
indica que el plsmido de inters ha sido bien transfectado. Se puede
tambin cotransfectar plsmidos complementarios: la protena
codificada por una condicin de expresin que es dependiente de
otra.

2. LAS PROTENAS DE FUSIN VERDES FLUORESCENTES

Las protenas verdes fluorescentes fueron extradas de cnidaires.
Estas se hacen fluorescentes (515nm, ici) cuando son excitadas
usando una fuente luminosa adecuada (470 20nm, ici). La

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descripcin a continuacin recuenta aquella clonada a partir de un

coral (Montastraea cavernosa).
Las protenas verdes fluorescentes (Green fluorescent protins, GFP)
son frecuentemente utilizadas para detectar cuantificar la expresin
y los desplazamientos de una protena en una clula eucariota. El
vector phMGFP aqu presentado permite la fabricacin de una
protena de fusin.
Se inserta el ADNc de la protena en el sitio de clonaje situado entre el
intrn y el gen codante de la protena verde fluorescente. El anlisis
de las clulas transfectadas con la ayuda de un microscopio permite
de detectar y de localizar (en el ncleo, en el golgi, la membrana
plsmica) la protena gracias a la fluorescencia que a ella le
proporciona el GFP cuando ella est fusionada.

3. PLSMIDO REPORTERO:

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Ahora vamos a estudiar un vector que no posee secuencia promotora

ni secuencia enhancer. El nos sirve para estudiar las mencionadas
secuencias. Supongamos dos secuencias: x una y y la otra. Creemos
que x es el promotor y que y es el enhancer. Vamos a probar sta
hiptesis utilizando el vector aqu abajo:
Insertamos x en el sitio rojo y anotamos "promotor potencial" y al y
en el sitio marcado "activador potencial", arriba de un gen donde se
pueda cuantificar la respuesta con la luciferasa. En condiciones bien
precisas se puede medir la cantidad de luz emitida por la luciferasa
en presencia de la luciferina.
Esta cantidad donada de luz es directamente proporcional a la fuerza
promotora/enhancer impulsadora de la secuencia insertada.

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FUNCIONES DE LOS PLSMIDOS

En funcin de que los plsmidos sean o no transmisibles de una
bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden
distinguir:
A. Plsmidos Conjugativos (auto transmisible): Que son
aquellos que se transfieren entre cepas por medio de
fenmenos de conjugacin. Algunos de estos plsmidos no slo
se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son
capaces de hacerlo entre especies y gneros muy diversos,
recibiendo el muy apropiado nombre de plsmidos promiscuos o
de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia
horizontal de informacin gentica entre grupos bacterianos
filogenticamente alejados.
B. Plsmidos No Conjugativos: Carentes de esta propiedad de
conjugacin. Dentro de esta categora existe un subgrupo, el de
los plsmidos movilizables: son aquel no auto transmisible que
pueden ser transferidos por la accin de un plsmido
conjugativo coexistente en la misma bacteria.
Existe una variedad de fenotipos y funciones determinados por
plsmidos:

Resistencia a antibiticos (plsmidos R; los estudiaremos en la

seccin de Gentica).
Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a
mercurio).
Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas, factores de
penetracin en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador,
etc., en ciertas bacterias patgenas.
Produccin de bacteriocinas (protenas txicas producidas por
bacterias que matan a otras de la misma especie).
Produccin de siderforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+).
Utilizacin de determinados azcares.
Utilizacin de hidrocarburos, incluyendo algunos cclicos
recalcitrantes (degradacin de tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en
Pseudomonas.

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Induccin de tumores en plantas (plsmido Ti de Agrobacterium

tumefaciens).
Interacciones simbiticas y fijacin de nitrgeno en ciertos
Rhizobium.

Enfermedades relacionadas a los plsmidos

Uretritis
Leiomiomatosis
Epidermlisis Ampollosa Distrfica
Nefritis Hereditaria
Deficiencia del Factor VII
Deficiencia del Factor X
Deficiencia del Factor V
Deficiencia del Factor XI
Osteocondrodisplasias
Deficiencia del Factor XII
Deficiencia del Factor XIII
Hemofilia A
Sndrome de Ehlers-Danlos
Dermatofibrosarcoma
Enfermedad de von Willebrand
Gonorrea

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BIBLIOGRAFIA

DE ROBERTIS
Biologa Celular Y Molecular
GERALD KARP
Biologa Celular y Molecular Pp 115-166.
LEHNINGER Bioqumica 2 edicin. 1991. pp 972
http:llwww.csn.med.ed.ac.uklsessiort2lgroup5/molchap.him

http:llwww.ucm.eslinfo/antdialasignaturalpracticas/trabajos_cie
ncialcaperoninas.htm
Jos Mwa Valpuesta, Oscar Llorca y Sergio Marco

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