I.

Tujuan
Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri
Gram negatif menggunakan GeneJET
TM
Genomic DNA Purification Kit.

II. Prinsip
Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan proteinase K dan
Digestion Solution atau Lysis solution. RNA dihilangkan dengan penambahan RNase
A. Lisat dicampurkan dengan etanol, lalu dituangkan dalam kolom purifikasi,
sehingga molekul DNA terikat pada membrane silica. Kolom dicuci dengan Wash
Buffer untuk membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari membrane silica
pada kondisi kekuatan ionic yang rendah menggunakan Elution buffer.

III. Teori Dasar
Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai
organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan
bahan yang digunakan. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap
langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.
Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan
kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan
digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif
lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan
dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap
penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik
seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen
cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni
dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.

Beberapa Metode Pemecahan Sel Cara Fisik
1. Dengan alat homogenizer, seperti waring blender, atau hammer mill.
Biasa digunakan untuk memecah dinding sel jaringan hewan dan tumbuhan.
Cara ini kurang baik untuk sel mikroba karena dinding selnya lebih keras.
Untuk membantu proses pemecahan digunakan : bubuk alumina, pasir atau
silica
Untuk preparat kecil digunakan mortar dan penumbuk
Untuk skala besar digunakan homogenizer atau penggiling bertekanan
ditambah bubuk metal sebagai pemecah
Sel dibasahi dengan buffer untuk mempermudah pemecahan
Dapat ditambah dengan proses agitasi
Letak enzim di dalam sel mempengaruhi waktu pemecahan
2. Pembekuan dan Pencairan
Jika pasta sel didinginkan pada -20 oC, maka ia akan mengalami perusakan
dinding sel akibat anomali air (volume membesar ketika air membeku).
Sekitar 50% protein periplasma akan dilepaskan ke dalam medium, tapi hanya
10% protein terlarut total.
Bila enzim dapat dilepaskan dengan cara ini, umumnya enzim tersebut
memiliki derajat kemurnian yang tinggi.
Senyawa kriopektan (laktosa, dekstran, rafinosa, gliserol) yang digunakan
pada proses pembekuan akan menghambat pemecahan sel
Sel yang sudah tua lebih mudah dipecah daripada sel muda
Bakteri gram negatif lebih mudah dipecah daripada gram positif
3. Kejutan Osmosis
Bakteri Gram negatif lebih rentan terhadap perubahan tekanan osmosa yang
besar dibandingkan bakteri Gram positif.
Bila bakteri diletakkan dalam media dengan tekanan osmosa tinggi (mis.
larutan sukrosa20%) sampai dicapai keadaan setimbang, kemudian
dipindahkan ke dalam air, maka akan timbul aliran air dari media ke dalam
sel, sehingga akan menyebabkan pecahnya dinding sel.
4. Sonifikasi
Sel dalam media cair diberi getaran di atas frekuensi batas pendengaran
manusia (> 20kHz, ultrasonik)
Getaran ini menimbulkan perapatan dan perenggangan yang menimbulkan
perubahan periodik tekanan dalam cairan medium dan plasma sel
5. Agitasi dengan Abrasi
Pasta ditempatkan pada wadah yang mengandung butir-butir gelas dan
digetarkan dengan cepat. Timbulnya gaya gesek akibat gradien kecepatan oleh
tumbukan antar butiran dan antara butiran dengan mikroorganisme
menyebabkan pecahnya sel.
Ekstraksi Secara Kimia
Lebih halus dari cara fisik.
Agitasi diterapkan hanya sekali-kali.
1. Detergent
Detergent-detergent anionik, kationik, dan nonionik cukup efektif untuk
merusak membran sel.
Contoh detergent yang sering digunakan untuk isolasi enzim a.l: setiltrimetil
amonium bromida (kationik), natrium laurel sulfat (anionik), tweens, spans
dan triton (non-ionik)
Pada kondisi pH dan kekuatan ion yang sesuai, detergent akan berinteraksi
dengan lipoprotein untuk membentuk misel. Akibatnya lipoprotein yang
merupakan konstituen membrane dapat larut dan enzim dapat dikeluarkan.
Pemilihan dan penggunaan detergent ini harus cukup selektif, karena beberapa
enzim dapat menjadi tak aktif akibat denaturasi protein dan pengendapan oleh
detergen.
Umumnya detergent harusa segera dipisahkan sebelum enzim hasil isolasi
digunakan.
2. Enzim Litik
Pemecahan dinding sel dengan cara ini merupakan cara yang paling efektif.
Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih
telur.
-1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat)
penyusun dinding sel.
Dinding sel bakteri gram positif lebih banyak mengandung polisakarida
dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehingga penggunaan enzim litik
lebih efektif untuk memecah dinding sel bakteri gram positif.
EDTA perlu ditambahkan pada media sebelum enzim ini digunakan untuk
memecah dinding sel bakteri gram negatif, untuk mengikat ion-ion divalen
yang dapat menginaktifkan enzim ini.
Enzim lisozim sudah digunakan secara komersial pada ekstraksi enzim
glukosa isomerase dari Streptomyces sp.
Jenis enzim lain : papain
Mudah dikendalikan dan bersifat selektif
3. Alkali
Penempatan sel pada medium dengan pH 11 12,5 selama 20 menit
menyebabkan pecahnya dinding sel.
Penggunaan cara ini hanya berhasil diterapkan untuk enzimenzim yang stabil
pada pH tinggi (Julianti, 2012).

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium
dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain
berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi
aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Selain
digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA
tumbuhan. Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada
beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah
terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit
diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl
dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung
CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
bersifatinsolublepada suhu di bawah 15C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan
kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan
sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel
diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah
pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15C. Karena
efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk
purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada
sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan
Rhizobium.
Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH
5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan
mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi.
Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai
ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses
penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein
dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah
perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer,
dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan
detergen.
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase
yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim
nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai
kofaktor enzim DNAse. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu
dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan
protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali
digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol
menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang
selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi. Bettelheim dan
Landesberg menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang
terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan
atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi
sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan
berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran
fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk
mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi
oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian
RNAse.

Gambar 1. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi
pada tahapan ekstraksi.

Isolasi dan Purifikasi DNA Genom
Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pada dasarnya
isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa tahap yaitu:
1. Kultivasi sel dalam media yang sesuai
2. Pemecahan dinding sel
3. Ekstraksi DNA genom
4. Purifikasi DNA
Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya dengan cara
sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim lisozim, etilen
diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya. Pada kondisi tertentu
pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi
sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain deterjen
triton X-100 atau sodium dedosil sulfat (SDS). Setelah sel mengalami lisis, tahap
selanjutnya adalah memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi. Komponen sel
yang tidak larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel
dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011).
Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Disamping
DNA, ekstrak sel mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar.
Umumnya cara pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau
campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1, untuk mengendapkan
protein dengan cara di sentrifugasikan dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA
sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul
DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi
etanol. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na
+
), pada suhu
20
o
C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah
dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011).
Pada isolasi dan purifikasi DNA sel total yang berasal dari sel eukariot,
misalnya sel tanaman atau sel hewan, walaupun pada dasarnya tahapan isolasi dan
purifikasinya sama, namun memerlukan suatu modifikasi cara isolasi sehubungan
dengan sifat-sifat khusus dari sel yang digunakan. Modifikasi yang sering dilakukan
adalah pada proses pemecahan sel eukariot. Senyawa kimia yang digunakan untuk
memecah sel bakteri tidak selalu dapat digunakan untuk memecah sel tanaman
maupun sel hewan. Untuk memecah sel tanaman dibutuhkan ezim-enzim degeneratif
yang spesifik dan sering dikombinasi dengan cara pemecahan dinding sel secara fisik
antara lain menggunakan butiran-butiran gelas. Sedangkan untuk mengisolasi DNA
total dari sel hewan yang tidak memiliki dinding sel umumnya hanya digunakan
deterjen untuk memecah membran sel dan membran nukleusnya (Radji, 2011).
Ekstraksi dan purifikasi DNA pada prinsipnya adalah suatu cara atau metoda
untuk memisahkan DNA total dari komponen sel lainnya (Sulandari & Zein 2003).
Ekstraksi dan purifikasi DNA pada prinsipnya adalah suatu cara atau metoda
untuk pemisahan DNA total dari komponen sel lainnya. Setiap sel atau jaringan yang
memiliki DNA memungkinkan untuk dilakukan ekstraksi DNA akan tetapi kualitas
atau jumlah DNA yang diperoleh dapat bervariasi tergantung asala jaringan, metode
penyimpangan, dan cara ekstraksi. Ekstraksi DNA dari fosil, spesimen museum,
sample forensic, rambut atau bulu dan feses biasanya lebih sulit dilakukan (Taberlet,
et al. 1996)
Pada prinsipnya, metode purifikasi pada semua jaringan makhluk hidup tidak
jauh berbeda, yaitu terdiri atas tiga tahapan utama. Tiga tahapan tersebut secara
berurutan adalah penghancuran (lisis) membran sel, pemisahan material DNA dari
material organik sel lain, dan pemisahan DNA dari larutannya (presipitasi)
(Sambrook et al. 1989).
Keberadaan plasmid dan kromosom dalam sel bakteri menyebabkan perlunya
teknik isolasi yang tepat untuk dapat membedakan plasmid dan kromosom. Pada
dasarnya prinsip isolasi keduanya memiliki persamaan yaitu memisahkan DNA dari
semua protein sel dan molekul RNA dengan cara lisis, ekstraksi, sentrifugasi dan
pengendapan. Pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosom dilakukan berdasarkan
perbedaan ukuran dan konformasinya. Ukuran kromosom sel bakteri lebih besar dari
DNA plasmid, sehingga dapat dipisahkan bersama dengan protein sel menggunakan
sentrifugasi. Tahap pemurnian selanjutnya dilakukan dengan memperhatikan
konformasi keduanya yang berbeda (Viani, 2010).
Molekul DNA plasmid umumnya berada dalam bentuk supercoil (covalently
closed circular-ccc form). Sedangkan fragmen DNA kromosom memiliki bentuk
linier. Konformasi ccc tersebut dapat dirubah menjadi relaks atau open circular (cc)
bila rantai nukleotida plasmid ada yang terputus. Bentuk ccc plasmid dapat
dipisahkan dari fragmen linier dengan cara ultrasentrifugasi dalam larutan cesium
klorida dengan bantuan interkelar etidium bromida. Dalam kondisi ini, konformasi
ccc memiliki bouyant density yang lebih besar dari fragmen liniar dan oc plasmid,
sehingga pita ccc DNA plasmid akan terletak dibawah pita linier dan oc DNA (Viani,
2010).
Ukuran kromosom bervariasi dari satu spesies ke spesies yang lain. Panjang
kromosom berkisar antara 0,2-0,5 mikro meter, dengan diameter 0,2 sampai 20
mikrometer. Misalnya kromosom manusia mempunyai panjang sampai 6 mikrometer.
Pada umumnya makhluk dengan jumlah kromosom sedikit memiliki kromosom
dengan ukuran lebih besar dari pada kepunyaan makhluk dengan jumlah kromosom
lebih banyak. Kromosom yang berada didalam sebuah sel tidak pernah sama
ukurannya. Pada umumnya tumbuhan mempunyai ukuran kromosom lebih besar
daripada hewan (Viani, 2010).
Plasmid merupakan molekul DNA yang berantai ganda, berbentuk lingkaran
yang tertutup, dapat bereplikasi sendiri diluar kromosom dan tidak mengandung gen-
gen esensial. Plasmid memungkinkan mikroba mampu merespon berbagai tantangan
seperti antibiotic atau substrat baru yang potensial. Jumlah plasmid di dalam sel
berbeda-beda, tergantung spesies organismenya. Ukuran plasmid berkisar antara 1kb
hingga lebih dari 250 kb (Viani, 2010).

IV. Alat dan Bahan
Bahan
1. Biakan bakteri E.coli DH5a berumur 18-24 jam
2. Medium Lurea Bertani (LB) cair (biogen)
3. Ampisilin 100 g/ml dalam medium LB cair
4. GeneJET
TM
Genomic DNA purification kit (Fermentas Life Science)
5. Etanol 50%
Alat
1. Tabung eppendorf 1,5 ml
2. Mikrosentrifuga
3. Mikropipet 100-100 l, 50-200 l, dan 10-100 l
4. Tip mikropipet biru dan kuning
5. Lemari es 1 buah dan freezer -25C
6. Waterbath
7. Thermometer
8. Incubator
9. Sarung tangan
10. Beaker glass
11. Pengocok orbital
12. Bunsen
13. Vortex

V. Prosedur
Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5
ml, disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm ( 5.000 x g) selama 5 menit, lalu
supernatannya dibuang. Sebanyak 1 ml biakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet
bakteri, disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm ( 5.000 x g) selama menit, lalu
supernatannya dibuang. Pelet bakteri ditambahkan 1 ml aquabides, disentrifugasi
dengan kecepatan 8.000rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang.
Tahap pencucian ini dilakukan 2x sehingga didapatkan pelet bakteri.
Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 45 l Digestion Solution, lalu
ditambahkan 5 l Proteinase K. Campuran dikocok menggunakan vortex atau melalui
pemipetan berulang untuk menghasilkan suspensi yang homogen. Suspensi
diinkubasi pada suhu 56
0
C sambil sesekali divortex atau dimasukkan ke dalam
shaking water bath sampai sel lisis secara sempurna (kira-kira 30 menit). Sebanyak 5
l RNase A Solution ditambahkan ke dalam suspense, lalu dikocok menggunakan
vortex. Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu runag.
Sebanyak 50 l Lysis Solution ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok
menggunakan vortex selama 15 detik hingga diperoleh campuran yang homogen.
Sebanyak 100 l etanol 50% ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok
menggunakan vortex atau melalui pemipetan berulang. Lisat dituangkan ke Genomic
DNA Purification Column dalam tabung kolektor. Kolom disentrifugasi selama 1
menit pada kecepatan 7.000 rpm (6.000 x g). Supernatan dalam tabung kolektor
dibuang dan kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama.
Sebanyak 250 l Wash Buffer I ditambahkan ke dalam kolom, lalu
disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9.400 rpm ( 8.000 x g). Supernatan
dalam tabung kolektor dibuang, lalu kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam
tabung kolektor yang sama. Sebanyak 250 l Wash Buffer II (dengan penambahan
etanol) ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit pada
kecepatan 14.000 rpm (12.000 x g). Jika larutan residu masih terlihat dalam kolom
purifikasi, maka tabung kolektor dikosongkan dan disentrifugasi kembali pada
kecepatan yang sama selama 1 menit. Supernatan pada tabung kolektor dibuang dan
kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml baru.
Sebanyak 100 l Elution Buffer ditambahkan ke bagian tengah membran
kolom plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh membrane kolom). DNA
kromosom dielusi dengan cara kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang,
lalu disentrifugasi pada kecepatan 9.400 rpm (8.000 x g) selama 1 menit. Tahap ini
dilakukan sebanyak 2 kali. Kolom purifikasi dilepaskan dari tabung Eppendorf dan
disimpan pada suhu -20
0
C.

VI. Data Pengamatan






















































VII. Pembahasan
Pembahasan prosedural
Praktikum kali ini adalah Isolasi DNA Kromosom, yang bertujuan untuk
memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram
negatif menggunakan GeneJET TM Genomic DNA Purification Kit. Dalam rekayasa
genetika, isolasi DNA kromosom adalah tahap yang paling penting yang sering kali
harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang
umumnya kita kehendaki untuk diklon. Prinsip dari isolasi DNA kromosom adalah
memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.
Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Isolasi DNA
kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuanagn
dinding sel, lsiis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein
dan RNA.
Bakteri yang digunakan pada percobaan ini adalah Escherichia coli. Hal ini
dikarenakan bakteri tersebut mudah didapatkan dan dapat menghasilkan keturunan
yang banyak dalam waktu yang singkat. Dalam memudahkan pengisolasian, DNA
kromosom diperlukan Escherichia coli dalm jumlah yang besar, karena apabila sel
bakteri yang tersedia jumlahnya sedikit maka proses pengisolasdian DNA kromosom
akan sulit dilakukan, oleh klarena itu sel Escherichia coli harus dibiakkan terlebih
dahulu. Medium yang digunakan dalam percobaan ini adalah Lurea Bertani (LB) cair
yang didalamnya ditambahkan Ampisilin g/mL dan telah diinkubasi selama 18-24
jam pada suhu 37C sehingga pada akhirnya akan diperoleh jumlah bakteri
Escherichia coli yang lebih banyak.
Langkah pertama yang dilakukan adalah 1,5 mL biakan bakteri dimasukkan
ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL dengan menggunakan mikropipet dengan tip
yang berwarna biru yang kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 5
menit, lalu supernatannya dibuang. Pada saat melakukan sentrifugasi, tabung lain
yang kemungkinan memiliki bobot yang sama disimpan dengan posisi yang
berhadapan. Hal ini dimaksudkan untuk menghindari kerusakan alat sentrifuga.
Sentrifugasi merupakan suatu teknik pemisahan yang dilakukan untuk
memisahkan suspensi yang jumlahnya sedikit. Suspensi ini dimasukan ke dalam
tabung Eppendorf yang kemudian dimasukkan ke dalam sentrifuga. Prinsip utama
sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
dasar yang disebut dengan pelet, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak
di atas yang disebut dengan supernatan. Sentrifugasi yang cepat menghasilkan sel
bakteri Escherichia coli berada pada pelet, sedangkan supernatan yang merupakan
media bakteri dibuang. Kemudian sebanyak 1 mL suspensi bakteri Escherichia coli
ditambahkan ke dalam pelet bakteri dan disentrifugasi kembali pada kecepatan dan
dalam jangka waktu yang sama dan supernatan kembali dibuang. Hal ini dilakukan
untuk mendapatkan jumlah pelet bakteri yang lebih banyak.
Pelet bakteri Escherichia coli yang didapatkan ditambah dengan aquabides
sebanyak 1 mL dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit,
dan supernatannya kembali dibuang. Tahap ini merupakan tahap pencucuian karena
kemungkinan pelet bakteri masih mengandung supernatan. Tahapan ini dilakukan
sebanyak dua kali.
Selanjutnya, 90 L Digestion Solution ditambahkan ke dalam tabung
Eppendorf yang berisi pelet bakteri. Hal ini dimaksudkan untuk meresuspensi bakteri
agar sel bakteri yang sebelumnya berbentuk pelet menjadi suspensi bakteri kembali.
Lalu ditambahkan 10 L Proteinase K yang bertujuan untuk merusak protein yang
dimiliki oleh bakteri dan kemudian campuran dikocok dengan menggunakan vortex
untuk menghasilkan suspensi bakteri yang homogen. Suspensi tersebut kemudian
diinkubasi pada suhu 56C sambil sesekali di vortex atau diamsukkan ke dalm
shaking water bath. Dengan proses inkubasi pada shaking water bath akan didapatkan
dua keuntungan, yaitu melakukan inkubasi dan juga melakukan proses pengocokan
dengan alat tersebut, sehingga yang diharapkan adalah sel bakteri dapat lisis secara
sempurna (selama kira-kira 30 menit).
Langkah selanjutnya adalah menambahkan 10 L RNAse A Solution ke dalam
suspensi, lalu dikocok dengan menggunakan vortex agar campuran menjadi homogen
. campuran ini kemudian diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu ruang.
Penambahan RNAse A Solution pada suspensi ini bertujuan untuk memecahkan atau
merusak RNA yang kemungkinan terdapat dalam sel bakteri, sehingga RNA akan
terdenaturasi dan kehilangan bentuknya. Inkubasi campuran pada suhu ruang
bertujuan untuk membiarkan RNAse A Solution dapat bekerja lebih maksimal,
sehingga yang diperoleh setelah proses ini adalah hanya DNA.
Kemudian tahap selanjutnya adalah penambahan 100 L Lysis Solution ke
dalam campuran, dan kemudian dikocok kembali dengan menggunakan vortex agar
campuran menjadi homogen. Penambahan Lysis Solution ini bertujuan untuk merusak
atau membuat lisis dinding sel bakteri yang kemungkinan belum rusak pada tahap
yang dilakukan sebelumnya. Lalu 200 L etanol 50% ditambahkan ke dalam
campuran dan dikocok kembali dengan menggunakan vortex agar menjadi homogen.
Penambahan etanol 50% ini bertujuab untuk merekristalisasi molekul DNA dan
mengakibatkan terbentuknya endapan sehingga lisat DNA terbentuk.
Tahap selanjutnya yaitu lisat atau campuran tersebut dituang ke dalam
GeneJET
TM
Genomic DNA Purification Column dalam tabung kolektor. Pada saat
memindahkan lisat, usahakan tidak menyentuh dasar atau membran kolom, hal ini
untuk mencegah terjadinya kerusakan pada kolom dan juga menghindari terjadinya
kontaminasi. Kolom disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 7000 rpm agar
DNA kromosom menempel atau terjerap didalam kolom dan supernatan yang ada
dalam lisat jatuh ke dalam tabung kolektor, sehingga supernatan dalam tabung
kolektor dapat dibuang dan kolom dimasukkan kembali dalam tabung kolektor yang
sama.
Sebanyak 250 L Wash Buffer I ditambahkan ke dalam kolom yang bertujuan
untuk mencuci atau membersihkan DNA kromosom, sehingga lisat yang diperoleh
terbebas dari zat-zat lain dan untuk membuang komponen-komponen selain DNA
yang sudah lisis sebelumnya. Wash Buffer I ini bersifat iritan sehingga harus hati-hati
dalam penambahannya. Lalu disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9400 rpm
(8000 x g). Supernatan dalam tabung kolektor dibuang, lalu kolom dipurifikasi
ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama. Lalu sebanyak 250 L Wash
BufferII (dengan penambahan etanol) ditambahkan ke dalam kolom untuk
memastikan bahwa didalam kolom hanya ada DNA yang terjerap didalamnya dan
juga untuk merekristalisasi DNA kromosom yang kemungkinan belum terekristalisasi
pada tahapan sebelumnya, sehingga diharapkan semua DNA kromosom menempel
pada kolom. Kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 14000 rpm
(12000 x g). Jika laruran residu masih terlihat dalam kolom purifikasi, maka tabung
kolektor dikosongkan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang lebih rendah
selama 1 menit. Hal ini dilakukan untuk memastikan dan mengoptimalkan DNA
kromosom yang akan diisolasi. Lalu supernatan dalam tabung kolektor dibuang dan
kolom yang sudah berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5mL baru.
Sebanyak 200L Elution Buffer ditambahkan ke bagian tengah membran
kolom plasmid dan tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom, selain
akan merusak kolom juga menghindari terjadinya kontaminasi yang nantinya akan
mengganggu proses pengelusian. Penambahan Elution Buffer ini untuk mengelusi
DNA kromosom yang menempel pada kolom, sehingga DNA yang sebelumnya telah
terjerap dalam silika akan terlepas dan akan tertampung dalam tabung Eppendorf
tersebut. Kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 9400 rpm (8000 x g) selama 1 menit. Tahap tersebut dilakukan sebanyak 2
kali, dengan catatan jika diperlukan konsentrasi DNA yang lebih pekat atau DNA
diisolasi dari sampel yang jumlahnya sedikit, maka volume Elution Buffer dapat
dikurangi menjadi 50-100 L. Semakin sedikit volume Elution Buffer, semakin
sedikit pula kadar DNA yang terelusi. Kemudian kolom purifikasi dilepaskan dari
tabung Eppendorf. DNA murni dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu -
20
o
C pada freezer yang bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat
disimpan dalam jangka waktu yang lama. DNA kromosom yang telah diisolasi dapat
dilihat dengan metode elektroforesis.

Pembahasan Hasil






















































VIII. Kesimpulan




























DAFTAR PUSTAKA
Julianti, Elisa. 2012. Isolasi dan Pemurnia Enzim. Available online at
http://elisajulianti.files.wordpress.com/2012/09/isolasi-dan-pemurnian-enzim1.pdf
Radji, M. (2011). Rekayasa Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung
Seto: Jakarta.
Sambrook J, Fritschi EF and Maniatis T (1989) Molecular cloning: a
laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Sulandari S & Zein MSA (2003). Protocols in DNA Laboratory, Center of Biology
Research, The Indonesian Institute of Sciences. Pp. 2345.
Taberlet P, Griffin S, Goossens B et al. 1996 .Reliable genotyping of samples with
very low DNA quantities using PCR. Nucleic Acids Research.
Tamam, Badrut. 2012. Isolasi DNA. Available online at http://biology-
community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html
Viani. 2010. materi biologi kuliah teknologi DNA rekombinan. Available online at
http://bima.ipb.ac.id/~tpb-
ipb/materi/genetika/dnarekombinan/textdnarekombinanpdf.pdf (diakses
tanggal 6 oktober 2012)