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Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios

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AINFLUNCIADAPOROSIDADE DO PAPEL DE
MICROFIBRADE VIDRO NADETERMINAO DOS
SLIDOS SUSPENSOS, DBO E DQO FILTRADAS
Edna Toledo*, Brbara Zanicotti Leite e Miguel Mansur Aisse
* Pontifcia Universidade Catlica do Paran; Rua Imaculada Conceio, 1155, Prado Velho;
Curitiba PR; CEP 80 215 901; edna@rla13.pucpr.br
INTRODUO
Na discusso de aspectos metodolgicos das anlises fsico-qumicas, durante reunies da Rede
do PROSAB 2 (Tema 2), foi identificada grande diversidade da porosidade do papel de
microfibra de vidro, utilizado nas determinaes de Slidos Suspensos, DBO e DQO Filtradas.
Entre as vrias marcas existentes no mercado, o ISAM-PUCPR, juntamente com a CAESB,
fazem uso do papel microfibra SS GF/50 (Schleicher & Schull), pela facilidade de aquisio e
pelo baixo custo. Foi, ento, sugerido pela Rede PROSAB, um estudo comparativo entre os
diferentes papis que esto sendo usados por esta.
A filtrao a reteno de partculas presentes em um fluido (gua ou esgoto sanitrio, por
exemplo), quando da passagem deste em um material poroso, fibroso ou granular. Vrios
aspectos influenciam na filtrao, dentre eles cabe citar:
caractersticas qumicas, contedo inico, viscosidade do fluido;
deformabilidade e tamanho das partculas. O esgoto apresenta partculas deformveis
(protenas, lipdeos, microorganismos) e partculas no deformveis (areia, cristais, carvo
etc);
velocidade e presso de filtrao aplicadas;
tamanho e tipo de filtro.
Nos laboratrios de anlises, a filtrao realizada fazendo-se passar um fluido atravs de papel
filtro, constitudo por mantas sobrepostas em camadas, onde certas partculas ficam retidas
nestas camadas, ao longo de sua profundidade.
Na Tabela 1 so apresentadas algumas caractersticas de papis microfibra de vidro disponveis
no mercado. A ausncia da resina de ligao entre as fibras do material filtrante, citado como
caracterstica do papel Millipore AP 40, significa que o filtro mantm integridade estrutural, sem
perda de peso quando calcinado a 550 C, aps a filtrao.
Aspectos Metodolgicos 2
Tabela 1 - Caractersticas de papis microfibra de vidro
Especificao
tcnica
WHATMAN
934-AH
WHATMAN
GFA
GELMAN
A/E
MILLIPORE
AP40
WHATMAN
GF/C
SS GF
50A
Reteno de
partculas
1,5 m 1,6m 1,0m Nominal no
especificada
1,2 m 0,4 a 1,0m
Cdigo do
fabricante
1827-047 1820-047 61631 ------ ------ ------
Material
filtrante
Borossilicato Borossilicato ----- Borossilicato,
sem resina de
ligao
------ Borossilicato
Segundo o STANDARD METHODS (1998), Slidos Dissolvidos a poro de slidos que
passa atravs de um filtro de porosidade nominal de 2m (ou menor), sob condies especficas,
e Slidos Suspensos a poro retida no filtro.
Nos aspectos referentes ao material de consumo, so referenciadas as seguintes especificaes:
WHATMAN 934-AH, GELMAN TIPO A/E, MILIPORE TIPO AP40; E-D Scientific specialties
grade 161e Environmental Express Pro Weigh.
METCALF & EDDY (1991) citam que os Slidos Totais podem ser classificados como no
filtrados (suspensos) ou filtrados, e ainda sugerem o tipo fibra de vidro, com uma porosidade
nominal de 1,2 m (Whatman GF/C) ou o filtro de policarbonato de mesma porosidade. No
entanto, alertam os autores que os resultados podem ser diferentes, devido s diferenas nas
estruturas dos filtros.
VON SPERLING (1997) cita que embora os efluentes dos reatores biolgicos possam conter
uma elevada concentrao de slidos em suspenso (slidos biolgicos constituintes da
biomassa), estes slidos so removidos na etapa posterior de decantao. Assim, no
dimensionamento ou avaliao da eficincia do reator, no h sentido em se considerar a DBO
total, efluente do mesmo, que pode ser muito maior que a DBO afluente, devido elevada
concentrao de matria orgnica em suspenso, representada pela populao microbiana.
Surgem, ento, os conceitos de DBO e DQO filtradas para avaliar o desempenho dos reatores, e
DBO e DQO em suspenso para o desempenho da unidade de decantao final.
Quanto preciso dos resultados analticos, a anlise realizada em amostra sinttica, testada por
74 laboratrios, com uma DQO de 200 mg/L, na ausncia de cloretos, revelou um desvio padro
de 13 mg/L (coeficiente de variao de 6,5%). A DQO de 160 mg/L e 100 mg/L de cloretos
revelou um desvio padro de 14 mg/L (coeficiente de variao de 10%). Para os Slidos
Suspensos Totais, um desvio padro de 5,2 mg/L (coeficiente de variao de 33%) em 15 mg/L,
24 mg/L (coeficiente de variao de 10%) em 242 mg/L e de 13 mg/L (coeficiente de variao
de 0,76%) em 1707 mg/L foram obtidos, em estudos, com dois analistas de quatro sries, com
dez determinaes cada. Duplicatas de anlises de 50 amostras de gua e esgoto foram feitas, em
um s laboratrio, com um desvio padro de diferenas de 2,8 mg/L. A DBO apresenta
resultados extremamente variados, sendo sugerido um controle interno com at X 3 para a
soluo padro de cido glutmico-glicose (STANDARD METHODS, 1998).
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OBJETIVO
Avaliar a influncia da porosidade dos papis de microfibra de vidro e consolidar uma
metodologia padronizada para avaliao dos parmetros citados, com anlise de qualidade dos
resultados obtidos.
METODOLOGIA
Os critrios para a seleo dos diversos tipos de papel levaram em considerao, alm das
recomendaes citadas acima, a possibilidade de comparaes com os tipos que esto sendo
utilizados pelas instituies integrantes da Rede PROSAB.
Optou-se, ento, pelo estudo comparativo dos papis WHATMAN 934-AH (indicado pelo
STANDARD METHODS, 1998), SS GF/50 Schleicher & Schull (utilizado pelo ISAM
PUC/PR e CAESB) e, ainda, WHATMAN GFA.
Foram feitas anlises em trs tipos de amostras: esgoto bruto, efluente de sistema UASB + Filtro
Biolgico Aerado Submerso e efluente de sistema UASB + Filtro Biolgico. Os reatores citados
integram a Instalao Piloto projetada, construda e operada pelo ISAM / PUCPR, junto ETE
Belm da SANEPAR, em Curitiba-PR, que recebe esgoto domstico, gradeado e desarenado nas
unidades de escala real, operando com vazes de 250 a 500 L/h.
Nas determinaes da DQO filtrada, feitas pelo mtodo de refluxo aberto, preparou-se
previamente o papel de microfibra com o auxlio do sistema de filtrao, fazendo-se passar por
este 20 mL de gua destilada. Filtrou-se uma alquota de 50 mL de amostra, separadamente em
cada tipo de papel de microfibra.
Para as anlises de DBO filtrada, feitas pelo mtodo da azida sdica modificada, inicialmente
preparou-se o papel de microfibra, fazendo-se passar por este 20 mL de gua destilada. Filtrou-se
uma alquota de 500 mL de amostra, separadamente em cada tipo de papel de microfibra.
Na determinao dos valores de Slidos Suspensos, fixos e volteis, preparou--se previamente o
papel de microfibra com o auxlio do sistema de filtrao, fazendo se passar, por trs vezes
consecutivas, 20 mL de gua destilada. O papel foi ento levado para a estufa, por uma hora, em
temperatura de 103 C 5 C e em seguida para a mufla, por 15 minutos, em temperatura de
550 C, 5 C. Aps o esfriamento, em dessecador, pesou-se e procedeu-se filtrao de uma
alquota de 100 mL das amostras, separadamente em cada tipo de papel de microfibra.
Os resultados finais foram comparados para observar se existiram diferenas entre os papis
utilizados.
RESULTADOS E DISCUSSO
Na discusso dos resultados, os dados com desvio muito grande, que poderiam ser causados por
erros analticos, no foram excludos da anlise, j que uma equipe bastante variada trabalhou
nas determinaes.
Com relao aos resultados obtidos nas determinaes de DQO filtrada, observou-se uma
tendncia (no estatstica) da influncia do papel de microfibra, apesar de muitos valores terem
Aspectos Metodolgicos 4
ultrapassado o desvio proveniente da preciso analtica recomendada pelo STANDARD
METHODS (1998). Sendo assim, o papel SS GF/50 apresentou os menores resultados devido
maior percentagem da DQO particulada ter sido retida, como o esperado, uma vez que este
papel, dentre os trs utilizados nas determinaes, o que tem o menor dimetro de poros.
Considerando-se uma preciso analtica de 10% para a anlise de Slidos Suspensos, foram
poucos os resultados que ultrapassaram este desvio. Observou-se uma tendncia, como esperada,
de que o papel SS GF/50 retivesse uma maior quantidade de slidos, por apresentar a menor
porosidade entre os trs papis em estudo.
Nas determinaes de DBO filtrada, o pequeno nmero de amostras, aliado ao grande desvio
analtico do mtodo em si, tornaram difcil a visualizao de uma tendncia entre os resultados.
As Tabelas 2 a 4 e a Figura 1 apresentam os resultados obtidos nas anlises realizadas.
AMOSTRA DATA
resultado desvio (%) resultado desvio (%) resultado desvio (%)
Esgoto Bruto 02/06/00 166 4,9 174 0,3 184 -5,2
02/06/00 174 2,2 188 -5,5 172 3,3
02/02/01 74 3,4 82 -6,8 74 3,4
12/03/01 170 -11,3 148 3,2 141 8,1
04/07/01 141 12,8 183 -12,8 162 0,0
06/07/01 262 8,5 290 -1,3 307 -7,1
11/07/01 166 -2,4 166 -2,4 154 4,9
DSFBAS (1) 18/08/00 27 8,1 32 -9,7 29 1,6
24/08/00 50 2,5 46 10,0 58 -12,5
13/09/00 21 -7,1 16 14,3 21 -7,1
17/01/01 42 0,6 46 -8,4 39 7,8
02/02/01 42 -1,9 35 15,1 47 -13,2
04/07/01 46 -94,1 17 29,4 8 64,7
06/07/01 178 -6,6 166 0,8 158 5,8
11/07/01 79 1,6 79 1,6 83 -3,3
DSFB (2) 18/08/00 55 -5,1 55 -5,1 47 10,2
18/08/00 55 -4,6 55 -4,6 48 9,1
24/08/00 65 0,0 69 -5,9 61 5,9
13/09/00 21 -15,4 21 -15,4 12 30,8
17/01/01 50 -17,6 46 -8,6 31 26,2
02/02/01 47 -9,1 51 -18,2 31 27,3
04/07/01 25 10,0 37 -35,0 21 25,0
06/07/01 166 5,7 191 -8,5 171 2,8
11/07/01 95 -9,1 87 0,0 79 9,1
(1) DSFBAS, o decantador secundrio do filtro biolgico aerado submerso;
(2) DSFB, o decantador secundrio do filtro biolgico.
TABELA 2 - DQO filtrada (mg/L) para diferentes tipos de papel microfibra
SS GF/50
TIPO DE PAPEL MICROFIBRA
WHATMAN GFA WHATMAN 934-AH
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
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AMOSTRA DATA
desvio desvio
SST SSF SSV SST (%) SST SSF SSV SST (%) SST SSF
Esgoto Bruto 02/06/00 170 40 130 1,9 170 15 155 1,9 180 45
02/06/00 165 45 120 1,0 155 25 130 7,0 180 35
02/06/00 155 20 135 11,4 175 20 155 0,0 195 55
12/02/01 72 29 43 4,4 72 9 63 4,4 82 81
09/03/01 218 38 180 -2,3 203 49 154 4,7 218 42
04/07/01 300 84 216 0,0 306 67 239 -2,0 294 64
06/07/01 282 34 248 -4,3 270 67 203 0,1 259 51
11/07/01 171 30 141 1,5 193 41 152 -11,1 157 30
DSFBAS (1) 22/08/00 70 0 70 19,2 100 0 100 -15,4 90 0
22/08/00 90 30 60 0,0 90 0 90 0,0 90 0
06/03/01 15 6 9 18,2 20 3 17 -9,1 20 6
09/03/01 40 12 28 -5,3 38 11 27 0,0 36 12
04/07/01 29 6 23 -6,1 26 2 24 4,9 27 4
06/07/01 28 6 22 2,3 32 3 29 -11,6 26 2
11/07/01 13 1 12 4,9 14 1 13 -2,4 14 2
DSFB (2) 02/06/00 84 30 54 0,0 88 34 54 -4,8 80 30
02/06/00 82 30 52 3,1 86 32 54 -1,6 86 26
02/06/00 84 30 54 3,8 80 32 48 8,4 98 30
22/08/00 90 30 60 22,9 120 10 110 -2,9 140 10
22/08/00 190 30 160 -29,5 130 0 130 11,4 120 0
06/03/01 15 2 13 13,5 18 2 16 -3,8 19 2
04/07/01 53 12 41 -1,3 51 9 42 1,6 52 14
06/07/01 282 34 248 -4,3 270 67 203 0,1 259 51
11/07/01 58 10 48 7,9 64 13 51 -1,6 67 13
(1) DSFBAS, o decantador secundrio do filtro biolgico aerado submerso;
(2) DSFB, o decantador secundrio do filtro biolgico.
resultados resultados resultados
TABELA 3 - Slidos Suspensos Totais (mg/L) para diferentes tipos de papel microfibra
Papel WHATMAN 934-AH Papel WHATMAN \GFA Papel SS
AMOSTRA DATA
resultado desvio (%) resultado desvio (%) resultado desvio (%) mdia
Esgoto Bruto 02/06/00 95 -1,0 89 4,9 98 -3,9 94
02/06/00 89 11,5 102 -0,8 112 -10,8 101
06/07/01 143 1,2 149 -2,6 143 1,4 145
DSFBAS (1) 18/08/00 6 3,7 8 -21,6 5 17,9 6
06/03/01 2 27,6 3 -2,7 4 -24,9 3
06/07/01 23 2,9 25 -4,5 24 1,7 24
DSFB (2) 18/08/00 16 -3,6 13 11,1 16 -7,6 15
06/03/01 3 4,1 4 -18,6 3 14,5 3
06/07/01 22 23,7 29 -1,7 35 -22,0 28
(1) DSFBAS, o decantador secundrio do filtro biolgico aerado submerso;
(2) DSFB, o decantador secundrio do filtro biolgico.
TABELA 4 - DBO filtrada (mg/L) para diferentes tipos de papel microfibra
TIPO DE PAPEL MICROFIBRA
WHATMAN
934-AH
WHATMAN
GFA
SS GF/50
Aspectos Metodolgicos 6
Figura 1 Resultados de DQO (a), Slidos Suspensos Totais (b) e DBO (c), utilizando
diferentes tipos de papel microfibra
0
50
100
150
200
250
300
350
Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Esg Dec Dec Dec Dec Dec Esg Esg Esg Esg Dec Esg Esg Dec Esg
b) Resultados de Slidos Suspensos Totais (mg/L)
WHATMAN 934-AH
WHATMAN GFA
SS GF/50
0
50
100
150
200
250
300
350
Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Dec Esg Dec Dec Esg Esg Esg Dec Esg Esg Dec Esg
a) Resultados de DQOfiltrada (mg/L)
Whatman 934 - AH
Whatman GFA
SS GF/50
0
20
40
60
80
100
120
Dec Dec Dec Dec Esg Esg
c) Resultados de DBOfiltrada (mg/L)
Whatman 934-AH
Whatman GFA
SS GF/50
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
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CONCLUSES
O presente trabalho apresentou um estudo comparativo entre trs papis de microfibra de vidro
utilizados nas determinaes analticas de Slidos Suspensos e DQO e DBO filtradas, de
amostras de esgoto sanitrio bruto, efluente de sistema UASB + Filtro Biolgico Aerado
Submerso e efluente de sistema UASB + Filtro Biolgico.
Na observao destes resultados preliminares, foi possvel constatar uma tendncia (no
estatstica) da porosidade do papel microfibra de vidro influenciar nos resultados das
determinaes de DQO filtrada e Slidos Suspensos. Com relao s determinaes de DBO
filtrada, ainda no foi possvel a observao desta tendncia.
Em face do pequeno nmero de amostras, recomenda-se um estudo mais intenso e extenso para a
formulao de concluses estatisticamente sustentveis.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem SANEPAR e ao PROSAB, atravs da FINEP, CNPq e CEF, todo o
apoio demonstrado ao longo do desenvolvimento dos trabalhos, desde a construo da instalao
piloto, at o acesso ETE Belm e o financiamento da operao e monitoramento.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
APHA, AWWA, WEF (1998). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20
Edition,Washington,DC,APHA.
COLE PARMER. Catlogo 1999/2000. 238p.
METCALF & EDDY (1991). Wastewater characteristcs. In: Wastewater Engeneering, Treatment,,
Disposal and Reuse. 3 Rd ed., Mc Graw Hill: New York, p. 47 - 119.
SCHLEICHER & SCHUELL (2000). Catlogo de filtrao.
VON SPERLING, M. (1997). Princpios de tratamento biolgico de guas residurias. DESA, UFMG:
Belo Horizonte.
VWR Catlogo 97/98, 633 p.
Aspectos Metodolgicos 8
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
9
METODOLOGIA PARA DETERMINAO DE MATRIA
ORGNICA ESPECFICA EM GUAS RESIDURIAS
Carlos Eduardo Blundi* e Roberto Franca Gadlha
* Escola de Engenharia de So Carlos Departamento de Hidrulica e Saneamento, Avenida
Trabalhador So Carlense, 400 - 13566-590 So Carlos SP
INTRODUO
A matria orgnica presente em guas residurias, devido sua constituio complexa, ,
normalmente, determinada atravs de mtodos indiretos, tais como a Demanda Qumica de
Oxignio (DQO) e Demanda Bioqumica de Oxignio (DBO), comumente empregados em
laboratrios de saneamento.
Objetivando um conhecimento mais especfico da matria orgnica presente em guas
residurias, procedeu-se a um estudo sobre a adaptao de mtodos analticos colorimtricos de
determinao de protenas, carboidratos e lipdios, para aplic-los em tais amostras, uma vez que
esses compostos encontram-se frequentemente presentes em esgotos sanitrios, em despejos de
laticnios, em frigorficos, em abatedouros, em indstrias de bebidas e outros, constituindo parte
dessa matria orgnica.
Essas determinaes tm o objetivo de trazer economia, rapidez e preciso aos ensaios, no
constituindo metodologia substitutiva, mas sim alternativa complementar em relao s usuais.
METODOLOGIA
Apresentam-se, a seguir, os mtodos para determinao de Protenas, Carboidratos, Lipdios em
guas residurias.
Protenas
Mtodo do micro-biureto modificado para a determinao de protenas
O mtodo utilizado para a determinao da concentrao das protenas o mtodo do micro-
biureto modificado, baseado na metodologia descrita por STICKLAND (1951). O mtodo do
micro-biureto modificado consiste na adio de hidrxido de sdio e sulfato de cobre soluo
que contm protenas. O excesso de sulfato de cobre removido por centrifugao. Mede-se a
absorbncia do sobrenadante, que apresenta cor violeta, a 310 nm no espectrofotmetro
BAUSCH & LOMB, modelo 601. A intensidade da cor desenvolvida proporcional
quantidade de protenas presente na amostra.
Aspectos Metodolgicos 10
A concentrao de protenas presente nas amostras determinada com o auxlio de uma curva
padro previamente construda, por exemplo, uma curva construda para casena (Merck, P.A.),
(Figura 1).
Figura 1 - Curva padro para protenas (Padro: Casena)
A determinao de protenas deve ser realizada em trplica, sendo a absorbncia mdia
considerada para clculo da concentrao de protenas.
Reagentes
soluo de hidrxido de sdio, 20%: dissolve-se 20 g de hidrxido de sdio (NaOH, Merck,
P.A.) at completar 100 mL de gua destilada;
soluo de sulfato de cobre, 25%: dissolve-se 25 g de sulfato de cobre penta-hidratado
(CuSO
4
.5H
2
O, Merck, P.A.) at completar 100 mL de gua destilada;
polmero : DREWFLOC (1 g/L).
Procedimento
Adiciona-se 4,0 mL de soluo contendo protenas, 0,03 mL da soluo de NaOH,20%. A
seguir, adiciona-se 0,06 mL da soluo de CuSO
4
,25% e agita-se lentamente a mistura com uma
bagueta de vidro, promovendo a floculao da amostra. Adiciona-se 0,03 mL de polmero (0,062
mL de CuSO
4
, 25%), agita-se lentamente e adiciona-se 0,70 mL de NaOH,20%, agitando-se
novamente (lentamente). Centrifuga-se a 7000 rpm por 10 minutos e procede-se leitura a 310
nm. Deve ser preparado um branco, substituindo-se a amostra por gua destilada. O fluxograma
do procedimento apresenta-se na Figura 2.
Equao da reta: Absorbncia = 0,0015 x C
Coeficiente de determinao (r
2
): 0,998006
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
11
Figura 2 Mtodo do micro-biureto modificado para a determinao de protenas -
Procedimento
Carboidratos
Mtodo do fenol e cido sulfrico para a determinao de carboidratos
O mtodo utilizado para a determinao de carboidratos o mtodo do fenol e cido sulfrico,
baseado na metodologia descrita por DUBOIS et al.; GILLES; HAMILTON (1956), que consiste
na adio de fenol e de cido sulfrico concentrado, os quais em presena de carboidratos,
resultam em uma cor laranja. A absorbncia lida a 488 nm, no espectrofotmetro BAUSCH &
LOMB, modelo 601.
A concentrao de carboidratos presentes nas amostras determinada atravs de uma curva
padro previamente construda, por exemplo para a lactose (Merck, P.A.) (Figura 3).
Este mtodo rpido e simples, com resultados bastante reprodutveis, sendo a cor produzida
estvel por horas. A determinao dos carboidratos deve ser realizada em trplica, sendo a
absorbncia mdia considerada para clculo da concentrao de carboidratos.
Aspectos Metodolgicos 12
Figura 3 - Curva padro para carboidratos (Padro: lactose)
Reagentes
cido sulfrico concentrado (H
2
SO
4
, Merck, P.A.);
soluo de fenol (Synth, P.A.) a 5% (peso/volume).
Procedimento
Toma-se 0,5 mL da amostra a ser analisada, adiciona-se 0,5 mL de soluo de fenol a 5% e 2,5
mL de H
2
SO
4
. O cido deve ser adicionado rapidamente, com jato direcionado para a superfcie
do lquido, de modo a se obter uma boa mistura. Os tubos de ensaio so deixados em repouso por
10 minutos, perodo aps o qual so agitados e depois colocados em um banho de gua entre 25
e 30 C por 15 minutos. A absorbncia lida a 488 nm. Deve ser preparada uma amostra em
branco, substituindo-se a amostra por gua destilada. O fluxograma do procedimento apresenta-
se na Figura 4.
Equao da reta: Absorbncia = 0,0085 x C
Coeficiente de determinao (r
2
): 0,998661
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
13
Figura 4 Mtodo do fenol e cido sulfrico para a determinao de carboidratos -
Procedimento
Lipdios
Mtodo da sulfofosfovanilina para a determinao de lipdios
O mtodo utilizado para a determinao de lipdios o mtodo da sulfofosfovanilina, baseado na
metodologia descrita por POSTMA & STROES (1968), que consiste na adio de cido
sulfrico concentrado, cido fosfrico concentrado e soluo de vanilina, os quais em presena
de lipdio, resultam em uma cor rosa. A absorbncia lida a 537 nm, no espectrofotmetro
BAUSCH & LOMB, modelo 601.
Para a realizao deste ensaio, necessrio verificar se a amostra apresenta-se dentro da faixa de
sensibilidade do mtodo (se a amostra diluda ou no), considerando os seguintes casos:
amostras dentro da faixa de sensibilidade normal e amostras fora da faixa de sensibilidade
normal. Pode-se tambm utilizar o resduo resultante da extrao de leos e graxas (mtodo de
extrao Sohxlet).
A concentrao de lipdios presentes nas amostras determinada com o auxlio de uma curva
padro previamente construda, por exemplo para o leo de soja Savoy (indstria Minasa)
(Figura 5).
Aspectos Metodolgicos 14
Figura 5 - Curva padro para lipdios (Padro: leo Savoy)
Reagentes
cido sulfrico concentrado (H
2
SO
4
, Merck, P.A.);
cido fosfrico concentrado (H
3
PO
4
, Synth, P.A.);
soluo de vanilina: dissolvem-se 0,6 g de vanilina at completar 100 mL de gua destilada.
Procedimento
a) Amostra dentro da faixa de sensibilidade (amostra sem diluio ou sem concentrao)
Coloca-se 0,1 mL de amostra e 2,0 mL de H
2
SO
4
, e aquece-se por 10 minutos em um banho de
gua em ebulio. Paralelamente, desenvolve-se um teste em branco, para o qual se utiliza um
tubo de ensaio contendo 0,1 mL de gua destilada e 2,0 mL de cido sulfrico, aquecendo-a de
maneira anloga. Aps o banho de gua em ebulio, retira-se 0,1 mL desse material e adiciona-
se 2,0 mL de H
3
PO
4
e 0,5 da soluo de vanilina, respectivamente. Mistura-se bem e deixa-se os
tubos de ensaio em um banho de gua a 37 C (aparelho modelo 169, Fabbe-Primar Indstria
Ltda.) por 15 minutos. Procede-se de maneira anloga para o teste em branco . A absorbncia
lida a 537 nm, dentro de um prazo de 10 minutos, contra o teste em branco. O fluxograma do
procedimento apresenta-se na Figura 6.
Equao da reta: Absorbncia = 0,000053 x C
Coeficiente de determinao (r
2
): 0,996640
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
15
Figura 6 Mtodo da sulfofosfovanilina para a determinao de lipdios Procedimento:
Amostra dentro da faixa de sensibilidade Normal
Obs: a amostra em branco processada de maneira anloga amostra, utilizando,
incialmente, 0,1 mL de gua destilada
b) Amostra fora da faixa de sensibilidade
b.1) Concentrando-se amostras
No caso em que a amostra encontra-se muito diluda, com baixa concentrao de lipdios, abaixo
da sensibilidade, necessrio concentrar a amostra, de forma a possibilitar a leitura.
Coleta-se um volume A, em mL da amostra diluda, leva-se estufa a 100 C, levando-a a
resduo slido contendo lipdios. Adiciona-se 0,1 mL de gua destilada a um tubo de ensaio
contendo o resduo slido, que ser a amostra concentrada. A seguir, adiciona-se 2,0 mL de
H
2
SO
4
e aquece-se por 10 minutos em um banho de gua em ebulio. Paralelamente,
desenvolve-se um teste em branco, para o qual se utiliza um tubo de ensaio contendo 0,1 mL de
gua destilada e 2,0 mL de cido sulfrico, aquecendo-a de maneira anloga. Aps o banho de
gua em ebulio, retira-se 0,1 mL desse material e adiciona-se 2,0 mL de H
3
PO
4
e 0,5 mL da
soluo de vanilina, respectivamente. Mistura-se bem, e deixa-se os tubos de ensaio em um
banho de gua a 37 C (aparelho modelo 169, Fabbe-Primar Indstria Ltda.) por 15 minutos.
Procede-se de maneira anloga para o teste em branco. A absorbncia lida a 537 nm, dentro de
um prazo de 10 minutos, contra o teste em branco. O fluxograma do procedimento apresenta-se
na Figura 7.
O resultado obtido deve ser dividido por A / 0,1, que representa o nmero de vezes em que a
amostra foi concentrada.
Aspectos Metodolgicos 16
Figura 7 Mtodo da sulfofosfovanilina para a determinao de lipdios Procedimento:
Amostra fora da faixa de sensibilidade - Concentrando amostras
Obs: 1) a amostra em branco processada de maneira anloga amostra, utilizando,
incialmente, 0,1 mL de gua destilada; 2) o resultado obtido deve ser dividido
por A / 0,1, que representa o nmero de vezes que a amostra foi concentrada.
b.2) Utilizando resduos de leos e graxas
Coloca-se 0,1 mL de gua destilada e 2,0 mL de H
2
SO
4
em um balo contendo o resduo
resultante da extrao de leos e graxas (mtodo da extrao Soxhlet), e aquece-se por 10
minutos em um banho de gua em ebulio. Paralelamente, desenvolve-se um teste em branco,
para o qual se utiliza um tubo de ensaio contendo 0,1 mL de gua destilada e 2,0 mL de cido
sulfrico, aquecendo-a de maneira anloga ao balo. A seguir, transfere-se 0,1 mL do contedo
do balo a um tubo de ensaio e adiciona-se 2,0 mL de H
3
PO
4
e 0,5 da soluo de vanilina,
respectivamente. Mistura-se bem, e deixa-se os tubos de ensaio em um banho de gua a 37 C
(aparelho modelo 169, Fabbe-Primar Indstria Ltda.) por 15 minutos. Procede-se de maneira
anloga para o teste em branco. A absorbncia lida a 537 nm, dentro de um prazo de 10
minutos, contra o teste em branco. O fluxograma do procedimento apresenta-se na Figura 8.
O resultado final deve ser dividido por: (100 / 0,1 = 1000), devido a amostra inicial, no ensaio
de leos e graxas, ser de 100 mL.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
17
Figura 8 Mtodo da sulfofosfovanilina para a determinao de lipdios Procedimento:
Amostra fora da faixa de sensibilidade - Utilizando resduos de leos e graxas
Obs: a amostra em branco processada de maneira anloga amostra, utilizando,
incialmente, 0,1 mL de gua destilada
CURVA PADRO
A curva padro determinada a partir de concentraes conhecidas do material em estudo,
verificando a absorbncia correspondente.
O material utilizado, para construo da curva padro deve ser determinado visando o trabalho a
ser realizado. As leituras das concentraes, utilizando a curva padro, so referenciadas em
unidade de massa do material utilizado por unidade de volume.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
BLUNDI, C. E. (1988). Aplicao de Mtodos Alternativos para a Determinao de Matria Orgnica e
Biomassa em guas Residurias. So Carlos, EESC-USP (Tese de Doutorado).
CORTES, S. G. C. (1992). Estudo de Mtodos Analticos Alternativos Para Avaliao do Desempenho
das Unidades de Tratamento de guas Residurias de Uma Indstria de Maionese e Molhos. So
Carlos, EESC-USP (Dissertao de Mestrado).
GADLHA, R. F. (2000). Remoo de Matria Orgnica Especfica de um Sistema de Flotoozonizao
como Ps-tratamento de Reatores Anaerbios. So Carlos, EESC-USP (Dissertao de Mestrado).
MANZOLLI, I. M. (1992). Emprego de Mtodos Analticos Alternativos no Estudo da Degradao
Aerbia de um SubstratoMulticomposto. So Carlos, EESC-USP (Dissertao de Mestrado).
Aspectos Metodolgicos 18
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
19
DETERMINAO DAS ALCALINIDADES REAL E TOTAL
EMAMOSTRAS DE REATORES ANAERBIOS POR
TITULAES CONDUTOMTRICAS
Elizabeth de Mattos Moraes*, Maria Angela Tallarico Adorno, Marcelo Zaiat e
Eugnio Foresti
* Escola de Engenharia de So Carlos Departamento de Hidrulica e Saneamento
Laboratrio de Processos Biolgicos, Avenida Trabalhador So Carlense, 400 - 13566-590 -
So Carlos/SP
INTRODUO
Segundo SPEECE (1996), o processo anaerbio de degradao da matria orgnica composto
por quatro etapas: 1. Hidrlise, 2. Acidognese, 3. Acetognese e 4. Metanognese.
De acordo com FORESTI (1994), essas etapas devem ser mantidas em equilbrio dinmico, para
que a metanognese ocorra taxa mxima. O estabelecimento e a manuteno desse equilbrio
relacionam-se com a natureza e a taxa de cargas aplicadas ao sistema, com o destino final dos
produtos gerados, principalmente os cidos e o hidrognio gasoso, e com a alcalinidade gerada
ou imposta ao sistema.
Como a atuao dos microrganismos metanognicos limitada pela acidificao do meio, o
tampo mais usado para impedir a queda de pH bicarbonato, alctone ou autctone, e a
quantificao desse parmetro muito importante para o controle operacional dos reatores
anaerbios.
Bicarbonato de sdio, sal formado por uma base forte (NaOH), e um cido diprtico fraco
(H
2
CO
3
), como todos os demais sais assim formados, apresenta caractersticas tamponantes. O
on bicarbonato tampona estreita faixa de pH, prxima a 6,8, adequada para a manuteno das
atividades das bactrias metanognicas. O equilbrio, que se segue,
CO
3
2-
HCO
3
-
H
2
CO
3
regido pela concentrao de ons H+ do sistema: acima de pH 8,3, a espcie dominante o on
CO
3
-2
, enquanto que em pH abaixo de 4,0, a espcie dominante o cido carbnico.
As quantificaes das alcalinidades totais e parciais vm sendo realizadas atravs dos mtodos
potenciomtricos ou adaptaes propostas por DILALLO & ORRIS (1961), KAPP (1984) apud
CAVALCANTI & VAN HAANDEL (2000), RIPLEY & CONVERSE (1986), JENKINS et al.
(1991), ANDERSON & YANG (1992) e FRAYNE & CAMPOS (1995). Nesses mtodos, a
alcalinidade parcial quantifica tambm parte dos cidos volteis, uma vez que a substncia
utilizada na titulao (cido forte) reage tanto com os ons bicarbonato, quanto com os nions
dos cidos orgnicos gerados. Porm, temos observado incoerncias de resultados quando baixas
concentraes de cidos volteis, de uma mesma amostra, so determinadas atravs de mtodos
titulomtricos utilizando cido forte por titulao potenciomtrica e por cromatografia gasosa.
Aspectos Metodolgicos 20
Essa discordncia de resultados levou sugesto da utilizao de outro tipo de substncia para a
quantificao da alcalinidade real de reatores anaerbios.
O fato do cido carbnico ser um cido diprotonado e o bicarbonato de sdio um sal formado
pela neutralizao de apenas um de seus prtons, confere a natureza anftera ao on bicarbonato,
explorada pela metodologia agora apresentada. importante ressaltar ainda que todos os cidos
orgnicos usados para monitorar os processos anaerbios so cidos monoprticos, no
geradores de sais anfteros, cujos nions no reagem com ons OH-.
Ento, a quantificao da concentrao de ons bicarbonato em uma soluo poder ocorrer pela
adio controlada de uma soluo de concentrao conhecida de uma base forte.
A condutividade k uma medida da habilidade de uma soluo aquosa em conduzir uma
corrente eltrica, relacionada com a presena de ons, suas concentraes, mobilidades e
valncias, bem como com a temperatura da soluo que est sendo titulada. Os valores de
Condutncia Equivalente (
0
), em MHO.cm
2
/Equivalente, em gua a 25C, de alguns ons
envolvidos na determinao da alcalinidade real de amostras de reatores anaerbios, so os
seguintes: HCO
3
-
(44,5); CO
3
2-
(72); H
2
PO
4
-
(33); HPO
4
2-
(57); OH
-
(198,6). A adio de
NaOH, transformando ons HCO
3
-
em CO
3
2-
e H
2
PO
4
-
e HPO
4
2-
em PO
4
3-
, entre outros, e
posteriormente em excesso, responsvel pela variao da condutividade da amostra, tornando
possvel a quantificao.
A quantificao de alcalinidade total, por meio da titulao com soluo padronizada de cido
sulfrico, utilizando-se medidas de condutividade eltrica da soluo, permite determinaes
mais exatas de pontos finais, independentes de pH pr-estabelecidos, que no devem ser
coincidentes, para diferentes amostras, e que dificilmente so realmente atingidos no final da
titulao.
MATERIAL E MTODOS
Material
aparelho de ultra-som;
condutivmetro marca Horiba modelo DS/15, eletrodo duplo de platina;
bureta;
soluo padronizada de NaOH;
ftalato cido de potssio (padro primrio);
soluo padronizada de cido sulfrico aproximadamente 0,020 M;
tetraborato de sdio decahidratado (padro primrio).
METODOLOGIA
Determinao da alcalinidade real
Os volumes conhecidos da amostra (25,0 mL), contidos em copos de Becker, permaneceram
durante 10 minutos sob ultra-som. Aps esse perodo, a amostra foi titulada com soluo
padronizada de NaOH, acompanhando-se a variao de condutividade eltrica. A titulao foi
processada at garantir-se vrias adies em excesso de soluo de hidrxido de sdio. Foram
construdos grficos, lanando-se os volumes de soluo de NaOH adicionados contra os valores
corrigidos da condutividade eltrica da amostra. As diluies provocadas pelas adies da
soluo titulante exigem as correes, multiplicando-se o valor da condutividade lida em cada
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
21
ponto pela razo entre o volume total de cada ponto (V
amostra
+ V
titulante
) e o volume inicial
(V
amostra
)
.
Determinao da alcalinidade total
Os volumes conhecidos da amostra (25,0 mL), contidos em copos de Becker, foram titulados
com soluo padronizada de cido sulfrico, aproximadamente 0,020 M, acompanhando-se a
variao de condutividade eltrica. As adies de cido garantiram sua presena em excesso na
amostra. Os grficos e clculos foram realizados conforme descrito anteriormente.
RESULTADOS E DISCUSSO
Na Tabela 1 esto apresentados os parmetros de acompanhamento (sem e com correo) da
titulao condutomtrica de uma amostra de efluente de reator anaerbio, por soluo de NaOH.
Tabela 1 - Volumes adicionados de NaOH, valores de condutividade lidos,
e valores de condutividades corrigidos durante a titulao de 25,0 mL
amostra de efluente de reator anaerbio, por soluo 0,020 M de NaOH
Volume de NaOH Condutividade
(mS/cm)
Condutividade corrigida
(mS/cm)
0,00 0,400 0,400
0,50 0,436 0,445
1,00 0,480 0,499
1,50 0,520 0,551
2,00 0,558 0,603
2,50 0,598 0,658
3,00 0,636 0,712
3,50 0,676 0,771
4,00 0,715 0,829
4,50 0,756 0,884
5,00 0,797 0,956
5,25 0,819 0,991
5,50 0,842 1,027
5,75 0,865 1,064
6,00 0,888 1,101
6,25 0,913 1,141
6,50 0,936 1,179
6,75 0,962 1,222
7,75 1,059 1,387
8,50 1,133 1,518
9,50 1,227 1,693
10,00 1,274 1,784
A Figura 1 mostra a variao da condutividade durante a titulao. Como pode ser observado,
duas retas compem o grfico.
Aspectos Metodolgicos 22
Variao da Condutividade Corrigida da Amostra pela Adio de
Soluo de NaOH
0,300
0,500
0,700
0,900
1,100
1,300
1,500
1,700
0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000
Volume de NaOH(mL)
C
o
n
d
u
t
i
v
i
d
a
d
e
C
o
r
r
i
g
i
d
a
(
m
S
/
c
m
)
Variao da Condutividade Corrigida da Amostra
pela Adio de Soluo de NaOH
y = 0,1137x + 0,383
R
2
= 0,9974
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000
Volume de NaOH(mL)
C
o
n
d
u
t
i
v
i
d
a
d
e
C
o
r
r
i
g
i
d
a
(
m
S
/
c
m
)
Variao da Condutividade Corrigida da Amostra
pela Adio de Soluo de NaOH
y = 0,1687x + 0,0887
R
2
= 0,9994
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 10,000 11,000
Volume de NaOH(mL)
C
o
n
d
u
t
i
v
i
d
a
d
e
C
o
r
r
i
g
i
d
a
(
m
S
/
c
m
)
Figura 1 - Variao da Condutividade corrigida da amostra
durante adio de soluo de NaOH
A Figura 2 (a e b) apresentam as duas retas obtidas quando os valores de condutividade corrigida
so plotados contra os volumes adicionados de soluo de NaOH.
a)
b)
Figura 2 (a e b) - Retas obtidas de acordo com as diferentes inclinaes observadas na
variao da Condutividade Corrigida da amostra durante a adio de soluo de NaOH
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
23
A reta 1 (Figura 2a), caracterizada pela equao y=0,1137x+0,383 e R
2
=0,9974, representa a
variao de condutividade eltrica da amostra, obtida, principalmente, pela reao entre os ons
HCO
3
- e OH-, representada pela Reao 1:
NaHCO
3
+ NaOH Na
2
CO
3
+ H
2
O (Reao 1)
A reta 2 (Figura 2b), caracterizada pela equao y=0,1687x+0,0887 e R
2
=0,9994, representa a
variao da condutividade eltrica da soluo da amostra, em presena de excesso crescente do
on OH-.
O ponto de interseo das duas retas pode ser obtido, matematicamente, igualando-se as
equaes, e indica o valor do volume da soluo padronizada de NaOH, 5,35 mL, usado para
atingir o ponto final da titulao.
A partir do volume gasto de NaOH, da concentrao molar da soluo, do volume titulado da
amostra (25,0 mL) e da reao 1, calcula-se a concentrao da alcalinidade da soluo, expressa
em miligramas de ons bicarbonato por litro, a partir da Equao 1:
mg HCO
3
-
/L = V
NaOH
x M
NaOH
x 2440 (Equao 1)
Atravs de procedimentos idnticos, utilizando-se soluo padronizada de cido sulfrico, a
alcalinidade total expressa em bicarbonato, pode ser calculada da seguinte forma, baseando-se na
Reao 2:
2 NaHCO
3
+ H
2
SO
4
H
2
O + 2 CO
2
+ Na
2
SO
4
(Reao 2)
A concentrao da alcalinidade total, expressa em mg/L de HCO3-, quando 25,0 mL de amostra
foram titulados, calculada a partir da Equao 2:
mg/L alcalinidade total, expressa como HCO
3
-
- M
cido
x V
cido
x 4880 (Equao 2)
A concentrao de cidos volteis, como cido actico, poder ser determinada atravs da
Equao 3:
mg/L cido actico = (M
H2SO4
x V
H2SO4
M
NaOH
x V
NaOH
) x 3000 (Equao 3)
CONCLUSO
O mtodo proposto pode fornecer valores muito mais prximos de alcalinidade real de reatores
anaerbios do que os mtodos que utilizam titulaes com solues de cidos fortes. Este
mtodo proposto titula, tambm, outras espcies geradoras de alcalinidade como ons HPO
4
-
,
H
2
PO
4
2-
, silicatos, HS
-
, presentes em guas residurias.
Uma reao que poderia interferir, quando uma base forte usada como titulante, seria a reao
com CO
2 (g)
presente na amostra. Porm, CO
2 (g)
pode ser eliminado, no por aquecimento, pois
a concentrao do on HCO
3
-
tambm seria afetada, mas por ultra-som que, aplicado amostra,
expulsa os gases nela dissolvidos. ons NH
4
+
, se presentes, podero interferir positivamente no
resultado. Essa interferncia, se significativa, pode ser eliminada pela determinao da
concentrao de nitrognio amoniacal.
Aspectos Metodolgicos 24
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq (Processo 360079/99-7) e FINEP.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ANDERSON, G. K., YANG, G. (1992). Determination of bicarbonate and total volatile acid
concentration in anaerobic digesters using a simple titration. Water Environment Research, v. 64, n.
1, p. 53-59.
CAVALCANTI, P. F. F., VAN HAANDEL, A . V. (2000). Comparao entre os mtodos titrimtricos
Kapp e DiLallo para determinao da alcalinidade e AGV. Engenharia Sanitria e Ambiental, v. 5,
n. 2, p. 47-52.
DILALLO, R., ORRIS, E. A. (1961). Volatile acids by direct titration. Journal WPCF, v. 33, n. 4, p. 356-
365.
FRAYNE, R. M., CAMPOS, J. R. (1995). Avaliao e aprimoramento do mtodo DiLallo para
determinao de cidos volteis em reatores anaerbios. In: 18 Congresso Brasileiro de
Engenharia Sanitria. Salvador BA. CD ROM.
FORESTI, E. Fundamentos do Processo de Digesto Anaerbia. (1994) Anais do III Taller y Seminario
Latino-americano Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales. Motevideo Uruguay, p.17-110.
Editado por: Vinhas, M.; Soubes, M.; Borzacconi, L.; Luxi, L.
JENKINS, S. R., MORGAN, J. M., ZHANG, X. (1991). Measuring the usable carbonate alkalinity of
operation anaerobic digesters. Research Journal WPCF, v. 63, n.1, p.28-34.
RIPLEY, L.E., BOYLE, W.C., CONVERSE, J.C. (1986) Improved alkalimetric monitoring for anaerobic
digestion of high-strength wastes. J. Water Pollut. Control Fed., v. 58, p. 406-411.
SPEECE, R.E. (1996) Anaerobic Biotechinology for Industrial Wastewaters. Vanderbilt University.
Nashville, Tennessee. 394 p.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
25
COMPARAO ENTRE OS MTODOS TITRIMTRICOS
KAPP E DILALLO PARADETERMINAO DA
ALCALINIDADE E AGV
Paula Frassinetti Feitosa Cavalcanti* e Adrianus van Haandel
*Rua Aprgio Voloso,882-Bodocong 58100-790-Campina Grande PB - Telfax:83.331.4809
E.mail:prosab@cgnet.com.br
INTRODUO
Reatores anaerbios de fluxo ascendente e manto de lodo, reatores UASB, tm sido amplamente
investigados como uma alternativa para o tratamento de esgoto sanitrio em pases de clima
quente. No que concerne converso da matria orgnica (MO) em produtos mais estveis como
metano e gs carbnico, o desempenho desses reatores est relacionado s condies timas do
pH, entre outras.
A converso da MO se d atravs de processos anaerbios metablicos de grupos distintos de
bactrias que vo se sucedendo, passando pela liquefao (hidrlise) de protenas, carboidratos e
lipdeos, pela fermentao acidognica e acetognica e, por ltimo, pela fermentao
metanognica. O pH pode ser um fator de inibio dos diversos processos anaerbios, exigindo
faixas de valores muitas vezes restritas. Considerando-se as diversas fases da digesto anaerbia
e para que no haja inibio dos diversos grupos de bactrias que participam do processo, VAN
HAANDEL & LETTINGA (1984) indicaram a faixa de pH de 6,5 a 7,5 como sendo a tima para
a digesto anaerbia.
Embora os esgotos sanitrios geralmente apresentem alcalinidade de bicarbonato (AB) suficiente
para garantir que o aumento da acidez, devido formao AGV, o que no corresponde a uma
diminuio acentuada do pH, a determinao desses trs parmetros (AB , AGV e pH) deve fazer
parte da rotina de acompanhamento do desempenho de digestores anaerbios. Exceto o pH, que
pode ser determinado com um potencimetro, a determinao da alcalinidade e de AGV pode se
constituir em dificuldade para laboratrios de controle de estaes de tratamento de guas
residurias.
As dificuldades encontradas na determinao de AGV e AB esto relacionadas ao grau de
preciso das respostas obtidas pelos diversos mtodos propostos, disponibilidade de
equipamentos sofisticados, normalmente no encontrados em laboratrios de controle de
processos, ao tempo consumido para obteno de respostas e interferncia, no caso de esgoto,
de outros sistemas cidos/base (amnia, fosfato, sulfeto e cidos graxos volteis). Na faixa de pH
tima para a digesto anaerbia (6,5 a 7,5), geralmente encontrada na digesto de esgoto
domstico, a amnia (pKa= 9,26 a 25
o
C) no tem influncia significativa na determinao das
concentraes de AGV e AB, pois, nesta faixa, a amnia est completamente dissociada (VAN
HAANDEL & LETTINGA, 1994). Contudo, as presenas de fosfato inorgnico (pKa
2
= 7,21 a
25
o
C) e de sulfeto (pKa
1
= 6,96 a 25
o
C) podem levar a erros significativos, principalmente na
determinao da AB (MOOSBRUGGER et al., 1993.c).
Aspectos Metodolgicos 26
Para determinao de AGV, os mtodos de separao cromatogrfica ou de destilao, seguida de
titulao, eliminam a interferncia de outros sistemas cido/base. No entanto, esses mtodos
exigem equipamentos especializados e pessoal qualificado. No caso da destilao, a recuperao
de AGV no completa (70%, segundo SAWYER & McCARTY (1978) e 68 a 85%, segundo
DILALLO & ALBERTSON (1961)), alm de requerer tempo considervel para ser completada.
O mtodo potenciomtrico, para a determinao da alcalinidade devido ao sistema carbnico,
trata da titulao de uma amostra at um valor determinado de pH, que corresponde ao pH
estabelecido por uma soluo equivalente de cido carbnico (ou gs carbnico). Para a
determinao da alcalinidade de bicarbonato em guas residurias spticas, o mtodo
potenciomtrico de titulao, at o ponto de equivalncia do H
2
CO
3
(aproximadamente a um
pH=4), pode superestimar o resultado. Na regio do ponto de equivalncia, cerca de 85% dos
cidos volteis contribuem para a alcalinidade (MOOSBRUGGER et al., 1993.a). Para essas
guas, a alcalinidade assim determinada chamada de alcalinidade total (AT), que a soma da
alcalinidade de bicarbonato e alcalinidade devido aos cidos graxos volteis (AAV).
No Brasil, emprega-se com bastante frequncia o mtodo DiLallo para avaliar as concentraes
de AGV e alcalinidade de bicarbonato (e, consequentemente, a capacidade de tamponamento) de
afluentes e efluentes de sistemas anaerbios de tratamento de guas residurias. Para eliminar a
influncia do sistema carbnico (CO
2
), na determinao da alcalinidade devida aos cidos
volteis (alcalinidade negativa ou acidez), o mtodo recomenda ferver a amostra por trs
minutos. DILALLO & ALBERTSON (1961) verificaram que as perdas de AGV, durante o
aquecimento, eram muito pequenas, para tempos de aquecimento de at 9 minutos. No entanto,
FRAYNE & CAMPOS (1995), ao submeterem amostras formadas a partir de solues padres
de acetato, butirato, propionato e formiato, com diferentes concentraes, a temperaturas de 50,
70 e 98
o
C, durante tempos de aquecimento variveis de 5, 10, 15 e 20 minutos, determinaram
perdas bastante significativas Os resultados apresentados por esses autores, para um tempo e
temperatura de aquecimento de 5 minutos e de 70
o
C, mostraram que a percentagem mxima
recuperada, variava de 70 a 74% para o acetato; de 30 a 35% para o formiato; de 55 a 65% para
o butirato; de 50 a 55% para o propionato. No mesmo trabalho, os autores concluem que, para
todas as concentraes analisadas e temperaturas de aquecimento aplicadas, o mtodo DiLallo se
aplica melhor para a determinao dos cidos actico e propinico, quando o aquecimento da
amostra se d a uma temperatura de 70
o
C, durante 5 minutos.
Um outro mtodo titrimtrico, o mtodo Kapp, desenvolvido na Alemanha e descrito por
BUCHAUER (1998), consistindo apenas da titulao acidimtrica at trs valores de pH, deriva
equaes, atravs de procedimentos interativos, que permitem a determinao da alcalinidade de
bicarbonato e da concentrao de AGV.
O mtodo Kapp considera que na titulao do pH=5 at pH=4 a capacidade da amostra de aceitar
prtons (ou capacidade de tamponamento) devida, principalmente, aos sistemas AGV e
carbnico (HCO
3
-
/H
2
CO
3
) e que os outros sistemas cido/base no tm influncia significativa.
De fato, os sistemas cido/base, normalmente presentes na digesto anaerbia de esgoto
(fosfrico: pK
a2
= 7,21, na faixa de 5<pH<9; amnia: pK
a
= 9,3, na faixa de 7<pH<11; sulfeto:
pK
a2
7, na faixa de 5<pH<9), tm valores de pK
a
situados noutras faixas de pH diferentes
daquela da titulao pelo mtodo Kapp, alm do que esses sistemas se apresentam em
concentraes baixas, no contribuindo significativamente para a capacidade de tamponamento.
Neste trabalho, apresenta-se os resultados de uma investigao que teve como objetivo comparar
os mtodos Kapp e DiLallo para, no caso de equivalncia de respostas entre os dois mtodos ou
superioridade do mtodo Kapp, recomendar esse mtodo por ser mais simples de execuo.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
27
Os Mtodos Analisados
O Mtodo DiLallo
Em 1961, DiLallo e Albertson propuseram um mtodo titrimtrico para determinao de AGV,
AT e AB, baseado nas seguintes consideraes:
os mtodos de titulao direta so acessveis a todos os laboratrios de controle de ETE;
na determinao da alcalinidade total (AT), titulando-se a amostra at pH=4,0, apenas
significante a influncia do sistema carbnico e dos AGV, principalmente acetatos e
propionatos, no sendo considerada a influncia de outros sistemas cido/base;
ao reduzir o pH de 4,0 para 3,3 para, em seguida, ferver a amostra por 3 minutos, todo o
sistema carbnico, predominantemente na forma de CO
2
removido da amostra;
a titulao alcalimtrica de pH 4,0 at pH 7,0 determinar a alcalinidade negativa ou
alcalinidade de cidos volteis AAV (o mtodo no considera outros sistemas cidos bases
que possam contribuir com a acidez);
ao comparar o mtodo proposto com o mtodo de destilao (considerando, neste ltimo,
uma recuperao de 70% de AGV), DILALLO e ALBERTSON (1961) indicam um fator de
converso da alcalinidade negativa, AAV em concentrao de AGV, sendo este fator igual a 1
quando AAV< 180 mg/L, como CaCO
3
, e 1,5 quando AAV> 180 mg/L, como CaCO
3;
a alcalinidade de bicarbonato (AB) ser igual diferena entre a alcalinidade total (AT) e a de
cidos volteis (AAV).
Equaes
AT (mg CaCO
3
/L) = (N
ac
xV
ac
)x50.000/V
am
(1)
AAV (mg CaCO
3
/L) =( N
b
xV
b
)x50.000/V
am
(2)
AB (mg CaCO
3
/L) = AT-AAV (3)
AGV ( mgHAc/L)= fx0,83x(AAV) (4)
nas quais:
N
ac
a normalidade da soluo cida em eq/L
V
ac
o volume gasto para titular a amostra do pH inicial at pH=4,0, em mL
V
am
o volume da amostra, geralmente 50mL
N
b
a normalidade da base em eq/L
V
b
o volume da base em mL
50.000 o fator de converso de eq/L para mg CaCO
3
/L
0,83 o fator de converso de mgCaCO
3
/L para mgHAc/L
No caso de esgoto domstico com suficiente capacidade de tamponao e, portanto, condies
ideais para o desenvolvimento da metanognese, a carga orgnica afluente sempre ser de tal
ordem que a concentrao de AGV no efluente ser sempre menor que 180 mg/L, como CaCO
3
.
Dessa forma, a concentrao de AGV ser sempre igual de AAV, ou seja, 100% de AGV sero
titulados como alcalinidade de cidos volteis. No caso de valores de AAV maiores que 180
mgCaCO
3
/L, AAV = 67% AGV (ambos em mgCaCO
3
/L).
Outra considerao para a adoo do mtodo DiLallo o seu tempo de execuo. As diversas
etapas que incluem titulao acidimtica, aquecimento e resfriamento da amostra e, por fim,
titulao alcalimtrica, resultam num tempo expressivo (30 minutos ou mais).
Aspectos Metodolgicos 28
O Mtodo DiLallo Modificado
Os mtodos DiLallo e DiLallo Modificado (DM) so semelhantes quanto ao procedimento,
diferenciando-se o DM pelo fato que na titulao alcalimtrica de pH=4 at pH=7, a alcalinidade
negativa (AAV), assim determinada, corresponde a 85% dos AGV presentes (SOUZA, 1984). A
concentrao de AGV determinada pelo mtodo DM como:
AGV = AAV/(0,85x0,833) = 1,41AAV (5)
na qual:
0,83 o fator de converso de mgCaCO
3
/L para mgHAc/L
O Mtodo Kapp
O mtodo Kapp consiste em titular a amostra com um cido forte, de normalidade conhecida, at
trs valores de pH.
Os procedimentos de titulao, segundo o mtodo Kapp, so:
a) Soluo cida tituladora
Preparar uma soluo de HCl ou H
2
SO
4
,de normalidade padronizada, com uma soluo padro
de carbonato de sdio (Na
2
CO
3
). No caso dos esgotos de Campina Grande, cuja alcalinidade
total est em torno de 6 meq/L, uma concentrao de 0,04 eq/L para a soluo cida adequada,
pois ir requerer um volume do titulante menor que 10 mL. Para alcalinidade total maior que 6
meq/L, uma concentrao do cido maior dever ser utilizada.
b) Procedimento
aferir o medidor de pH, primeiro com a soluo tampo pH=7 e depois com a soluo pH=4;
tomar 50 mL da amostra. Se a amostra no for analisada imediatamente aps a coleta, filtr-
la atravs de uma membrana ou papel de filtro dimetro dos poros igual a 0,45 m, evitando,
dessa maneira, modificaes na alcalinidade de AAV, devido atividade dos
microrganismos. No caso de amostras de lodo primrio, diluir a amostra em partes iguais: 25
mL do filtrado e 25 mL de gua destilada ou de preferncia deionizada;
imergir o eletrodo e iniciar a agitao suavemente da amostra. (A agitao suave para evitar
perdas excessivas de CO
2
da amostra e, dessa maneira, alterar o sistema carbnico ou, mais
especificamente, a acidez mineral);
registrar o pH inicial da amostra;
iniciar a titulao com a soluo cida e registrar o volume gasto at atingir pH = 5;
continuar a titulao at pH = 4,3 e registrar o volume acumulado da soluo titulante;
concluir a titulao at alcanar o pH = 4 e registar o volume total acumulado.
Equaes
AGV(mgHAc/L) = (131340xN
ac
xV
ac(5-4)
/V
am
)-(0,0616 AT)-10,9 (6)
AAV(mgCaCO
3
/L) = 0,6xAGVx50/60 = 0,5AGV (7)
AT(mgCaCO
3
/L) = V
ac(4,3)
x50.000xN/V
am
(8)
AB(mgCaCO
3
/L)=AT-AAV (9)
ou
AB(mgCaCO
3
/L)= -(1312,26xN
ac
xV
ac(5-4)
/V
am
)+0,0206AT+0,11 (10)
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
29
nas quais:
V
am
o volume da amostra, normalmente 50 mL
N a normalidade do cido em eq/L
V
ac(5-4)
o volume em mL de cido gasto para titular de pH=5 at pH=4
V
ac(4,3)
o volume em mL gasto para titular a amostra do pH inicial at pH=4,3
No mtodo Kapp, a alcalinidade de cidos volteis considerada como sendo 60% da
concentrao de AGV (Equao (07)). Dessa forma, a alcalinidade de bicarbonato pode ser
obtida pela diferena entre AT e AAV (Equao (09)) ou diretamente pela Equao (10).
Observa-se que, comparado ao mtodo DiLallo, o mtodo Kapp bastante simples, pois exige
apenas titulao.
METODOLOGIA
As determinaes de AT, AB, AGV e AAA foram feitas em amostras do efluente de um reator
UASB, tratando esgoto municipal. As amostras eram coletadas e imediatamente tratadas e
analisadas, sem filtrao prvia, conforme indicam os mtodos, por se pressupor que o teor in
situ de AT, AB e AGV no seria modificado. Cada amostra tomada era dividida em trs pores,
sendo dosado, em duas delas, 60 e 120 mg/L de cido actico (HAc). De cada poro eram
tomadas quatro alquotas, as quais eram analisadas duas a duas pelos mtodos Kapp e DiLallo.
Os resultados obtidos foram tratados estatisticamente, comparando-se as mdias obtidas de cada
parmetro, na determinao pelos dois mtodos. Utilizando-se o mtodo ANOVA (anlise de
varincia), disponvel no Microsoft Office, foi possvel decidir, com um nvel de significncia de
5% ( = 0,05), a hiptese (H
o
): os dois tratamentos (ou mtodos empregados) conduzem a
mdias iguais (H
o
:
1
=
2
), ou seja, se os mtodos so equivalentes.
Tratando-se de AGV, onde a hiptese de mdias iguais no foi confirmada, a deciso de qual o
melhor mtodo recaiu sobre aquele que apresentasse o menor erro de recuperao da
concentrao esperada para o parmetro analisado.
RESULTADOS
Embora tenham sido obtidos dados da alcalinidade total (AT) e da alcalinidade devido aos cidos
volteis (AAV), a anlise e a discusso dos resultados sero feitas apenas quanto alcalinidade de
bicarbonato (AB) e concentrao de cidos graxos volteis (AGV), por serem esses parmetros
os de interesse para a estabilidade de reatores anaerbios.
As Figuras 1 a 6 mostram os dados obtidos da anlise de amostras (com e sem adio de cido
actico (HAc)) do efluente de um reator UASB. Nas Figuras 1 a 3 esto apresentados os dados
da alcalinidade de bicarbonato (AB) ,em amostra sem adio de HAc (Figura 1), e com adio de
60 e 120 mgHAc/L (Figuras 2 e 3, respectivamente). Da mesma forma, as Figuras 4 a 6
apresentam os dados de AGV.
A Tabela 1 apresenta um resumo das informaes obtidas com o mtodo ANOVA: fator nico
(anlise de varincia), aplicado para comparar a equivalncia dos dois mtodos na determinao
dos parmetros AT, AB, AGV e AAA. Nesta tabela esto indicados na 1
a
. coluna os parmetros
analisados nas alquotas sem HAc e com 60 e 120 mgHAc/L, simbolizados pelos ndices 1, 2 e 3,
respectivamente. Na 2
a
. coluna esto os graus de liberdade da anlise, sendo o primeiro nmero
Aspectos Metodolgicos 30
relativo ao tratamento e o segundo ao resduo. Nas colunas 3, 4, 5 e 6 esto as mdias (coluna 3 e
4) e a varincia de cada parmetro, obtidas segundo os mtodos Kapp e DM. Nas colunas de
nmero 7 e 8 esto os valores dos fatores F (determinado) e F
c
(F crtico, encontrado em tabela).
O valor de F
c
est relacionado aos graus de liberdade e ao nvel de significncia especificados,
sendo este ltimo, em todos os casos, de 5%. A ltima coluna, coluna 9, conclui, a partir da
hiptese de que as mdias obtidas pelos dois mtodos so iguais, se h equivalncia entre os dois
mtodos ou no, ou seja, se, dentro do nvel de significncia de 5%, os dois mtodos podem ser
considerados equivalentes.
Para verificar o grau de recuperao de cada um dos dois mtodos na determinao de AGV, foi
feita uma anlise da percentagem recuperada de AGV, considerando-se as mdias dos valores
encontrados. Nesta anlise, foi aceito que a mdia dos valores determinados de AGV nas
amostras sem adio de HAc, representaria a mdia dos valores verdadeiros de AGV nas
amostras. Esse valor, acrescido da dosagem de cido actico, seria o valor mdio esperado nas
amostras dosadas com HAc. Assim, por exemplo, foi determinado que a mdia dos valores de
AGV obtidos pelo mtodo Kapp, em amostras sem adio de HAc, foi de 52 mgHAc/L= X
am
, a
mdia observada das amostras com 60 mgHAc/L (=X
adic
) foi 107 mgHAc/L (=X
obs.
), e a
percentagem de recuperao (%R) seria (107-52)x100/60 = 92%. Assim, a percentagem de
recuperao ento calculada como:
%R = (X
obs
.-X
am
)x100/X
adic
(11)
na qual:
X
obs
o valor medido na amostra dosada com HAc
X
am
o valor da concentrao de AGV na amostra sem ser dosada
X
adic
. a dosagem de HAc adicionada amostra
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
31
Figuras 1 e 2 - Valores de AB em mg CaCO
3
/L, determinados pelos mtodos de Kapp
(sequncia 1) e DM (sequncia 2), em amostras do efluente de um reator UASB
Figura 3 Valores de AB em mg CaCO
3
/L,
determinados pelos mtodos Kapp (sequn-
cia 1) e DM (sequncia 2), em amostras do
efluente de um reator UASB com adio de
HAc
Figura 4 - Valores da concentrao de AGV
em mgHAc/L, determinados pelos mtodos
Kapp (sequncia 1) e DM (sequncia 2), em
amostras do efluente de um reator UASB
sem HAc
Figuras 5 e 6 - Valores da concentrao de AGV em mg de HAc/L, determinados pelos
mtodos de Kapp (sequncia 1) e DM (sequncia 2), em amostras do efluente de um reator
UASB, com adio de HAc
Valores de AB
c/ 60 mgHAc/l
200
250
300
350
13579
1
1
1
3
1
5
1
7
1
9
amostras
A
B
Seqncia1 Seqncia2
Valor e s de AB
c/ 120 mgHAc/l
140
160
180
200
220
240
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
amostr as
A
B
Se q n c ia 1 Se q n c ia 2
Valo re s de A GV
s / H A c
0
20
40
60
80
147
1
0
1
3
1
6
1
9
amo st r as
A
G
V
Se q n c ia 1 Se q n c ia 2
Valore s de AGV
c/60mgHAc/l
45
65
85
105
125
145
147
1
0
1
3
1
6
1
9
amostr as
A
G
V
Seqncia1 Seqncia2
Valore s de AGV
c/120mgHAc/l
90
140
190
240
13579
1
1
1
3
amostr as
A
G
V
Seqncia1 Seqncia2
Valors de AB
s/ HAc
250
300
350
400
147
1
0
1
3
1
6
1
9
amostras
A
B
Seqn cia1 Seqn ci a2
Aspectos Metodolgicos 32
Tabela 1 - Valores das mdias e varincia das anlises dos parmetros AT, AB, AGV e AAV,
obtidos pelo mtodo Kapp e DiLallo Modificado (DM), dos valores de F e F
c
para os graus de
liberdade (gl) especificados e para um nvel de significncia de 5%
Parmetro gl
(*2)
Mdias Varincia F F
c
Equivalncia
(*3)
(*1)
Kapp-1 DM-2 Kapp DM
AT
1
(1 e 36) 331 341 1173 1174 0,85 4,11 sim
AT
2
(1 e 36) 308 323 1491 1477 1,47 4,11 sim
AT
3
(1 e 26) 268 288 271 292 10,88 4,22 no
AB
1
(1 e 36) 312 325 1405 1300 1,30 4,11 sim
AB
2
(1 e 36) 261 268 1482 1806 0,31 4,11 sim
AB
3
(1 e 26) 195 185 327 711 1,11 4,22 sim
AGV
1
(1 e 36) 52 30 313 40 31,35 4,11 no
AGV
2
(1 e 36) 107 77 238 196 39,66 4,11 no
AGV
3
(1 e 26) 160 111 359 256 54,56 4,22 no
AAV
1
(1 e 36) 26 15 52 14 29,69 4,11 no
AAV
2
(1 e 36) 54 39 59 48 40,29 4,11 no
AAV
3
(1 e 26) 80 55 90 64 54,55 4,22 no
(*1) os ndices 1, 2 e 3 se referem, respectivamente, s amostras sem e com adio de 60 e 120
mgHAc/L;
(*2) graus de liberdade (tratamento e resduo);
(*3) quando F<F
c
,as mdias so estatisticamente iguais e os mtodos so equivalentes para um
nvel de significncia de 5%.
Na Tabela 2 esto os resultados da anlise de capacidade de recuperao de AGV, apresentada
pelos dois mtodos, para as amostras com 60 e 120 mgHAc/L.
Tabela 2 Valores mdios da concentrao de AGV de amostras com e sem adio de HAc e
as porcentagens de recuperao segundo os mtodos Kapp e DM
Mtodo Mdias Recuperao%
s/HAc c/60ppmHAc c/120ppmHAC c/60ppmHAc c/120ppmHAc
Kapp 52 107 160 92 90
DM 30 77 111 78 68
DISCUSSO DOS RESULTADOS
A anlise grfica dos resultados (Figuras 1 a 6) mostra que com relao ao parmetro AB, os
dois mtodos apresentam valores muito prximos, distanciando-se um pouco para aquelas
amostras dosadas com 120 mgHAc/L. No entanto, quanto concentrao de AGV, os dados
obtidos pelos dois mtodos so notadamente diferentes, apresentando o mtodo Kapp (sequncia
1) valores maiores de AGV do que o mtodo DiLallo.
A observao grfica fica comprovada pela anlise estatstica dos dados quanto equivalncia
dos mtodos. A anlise da varincia (mtodo ANOVA), para um nvel de significncia bastante
rgido (=0,05), mostra que:
os mtodos Kapp e DiLallo Modificado so equivalentes quanto determinao da
alcalinidade de bicarbonato, o que era esperado pois ambos os mtodos conduzem uma
titulao at valores prximos de pH;
os mtodos Kapp e DiLallo modificado no so equivalentes quanto determinao de AGV,
o que tambm era esperado, visto que o tratamento dado amostra pelo mtodo DiLallo
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
33
(fervura por 3 minutos) leva a uma perda quantitativamente significativa de AGV (FRAYNE
& CAMPOS, 1995).
A maior capacidade de recuperao de AGV pelo mtodo Kapp, observada graficamente, fica
demonstrada na Tabela 2. Esta tabela mostra que os dois mtodos inferem num mesmo tipo de
erro: recuperam menos da concentrao de cidos volteis esperada. Essa recuperao
significativamente menor quando se aplica o mtodo DM, e quando o valor esperado de
recuperao aumenta de 60 (com 78% de recuperao) para 120 mgHAc/L (com 69% de
recuperao).O mtodo Kapp apresentou uma recuperao de 92 e 90% quando o valor esperado
(a ser recuperado) era de 60 e 130 mgHAc/L, respectivamente. Isso d uma recuperao a mais
que o mtodo DiLallo, ou seja, de 15 a 24%.
CONCLUSES
Para valores mdios de AB entre 3,7 e 6,5 meq/L, os mtodos Kapp e DiLallo Modificado so
equivalentes na determinao deste parmetro. As mdias obtidas pelos dois mtodos so
consideradas estatisticamente iguais, dentro de um nvel de significncia de =0,05.
Para valores mdios de AGV entre 0,5 e 2,7 meq/L, os mtodos Kapp e DiLallo no so
equivalentes na determinao de AGV. As mdias obtidas pelos dois mtodos so consideradas
estatisticamente diferentes, dentro de um nvel de significncia de =0,05.
Para um valor esperado da concentrao de AGV nas amostras analisadas pelos dois mtodos, o
mtodo Kapp apresentou uma recuperao significativamente maior do que o mtodo DiLallo.
Recomenda-se o mtodo Kapp, para anlises de rotina de controle de processos de digesto
anaerbia e caracterizao de efluentes, considerando-se:
(1) os aspectos de equivalncia entre os dois mtodos investigados;
(2) a capacidade de recuperao, quando da determinao de cidos graxos volteis;
(3) o tempo e a simplicidade de execuo do mtodo Kapp.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem FINEP, pelo apoio dado ao grupo de pesquisadores atravs do
PROSAB, tcnica Nlia Luna Leal, pelo levantamento dos dados, CAGEPA, por ceder o
terreno onde esto as unidades experimentais do DEC/CCT/UFPB e UFPB.
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Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
35
DETERMINAO DE CIDOS VOLTEIS POR
CROMATOGRAFIA GASOSA EM EFLUENTES DE
REATORES ANAERBIOS
Elizabeth de Mattos Moraes
*
, Eugnio Foresti, Marcelo Zaiat e Maria
Angela Tallarico Adorno
* Escola de Engenharia de So Carlos Departamento de Hidrulica e Saneamento
Laboratrio de Processos Biolgicos, Avenida Trabalhador So Carlense, 400 - 13566-590 -
So Carlos/SP
INTRODUO
cidos volteis de cadeias curtas so produzidos durante processos metablicos de fermentao
anaerbia. A anlise desses cidos de especial interesse em processos de digesto anaerbia,
atravs dos quais a maior parte das macromolculas consumidas degradada a cidos de cadeias
curtas (C
2
-C
7
), antes da produo de metano e gs carbnico (HENDERSON et al., 1982).
Essas substncias, juntamente com cidos de cadeias maiores (no volteis), tambm so de
grande interesse taxonmico, como produtos finais do metabolismo de bactrias anaerbias
fermentativas, pois a caracterizao dos organismos anaerbios pode ser difcil se apenas testes
bioqumicos clssicos forem utilizados (ARELLANO et al., 2000).
Para os processos biotecnolgicos levando formao de metano, os conhecimentos qualitativo
e quantitativo dos metablicos intermedirios (como os cidos de cadeias curtas, os cidos
volteis) so de fundamental importncia para definio das rotas metablicas. Esses resultados,
associados s anlises microbiolgicas de bactrias e arqueas metanognicas, permitem inferir,
com clareza, as relaes sintrficas entre esses microrganismos.
No Laboratrio de Processos Biolgicos do Departamento de Hidrulica e Saneamento, da
Escola de Engenharia de So Carlos (EESC), so estudados os processos de degradao de
compostos orgnicos comumente encontrados em esgotos sanitrios e de substncias txicas que
podem estar presentes em esgotos industriais, como por exemplo, fenis, compostos clorados,
hidrocarbonetos aromticos etc.
Mtodos titulomtricos que utilizam cido forte para quantificao de cidos volteis (DILALLO
& ALBERTSON, 1961), alm de impedirem a especiao, comprometem os resultados quando
suas concentraes nas amostras so baixas. Assim, uma anlise por cromatografia, que permite
a identificao dos cidos, alm da quantificao, ideal.
Existem vrios mtodos de anlise de cidos orgnicos descritos na literatura, a saber:
Aspectos Metodolgicos 36
cromatografia inica (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) com deteco
por UV (SHARMA et al., 1998; OHTA & TANAKA, 1999; LUES et al., 1998; MORALES
et al., 1998; CHEN et al., 1997; TANAKA et al., 1999; CHEN & ADAMS, 1999; STANEK
et al., 1992; SINGER et al., 1997; SZMIGIELSKA et al., 1997; CANO et al., 1994; SINGER
et al., 1997) e por condutividade (KOTALIK et al., 1997);
cromatografia gasosa, com deteco por espectrmetro de massas e/ou por detector de
ionizao de chamas (YO, 1999; URDANETA et al., 1995; PAN et al., 1995; STAHNKE,
1995; CLARK & BUNCH, 1997);
eletroforese (GALLI et al., 2000; ARELLANO et al., 2000);
mtodos titulomtricos (BISOGNII et al., 1998; ROZZI et al., 1997; VAN VOOREN et al.,
1996) e FIA Flow Injection Analysis (SU et al., 1998; MATAIX & CASTRO, 1999).
A anlise de todos os cidos mais importantes, como actico, propinico, isobutrico, butrico,
isovalrico, valrico e caprico, por HPLC, no foi eficiente, pois a sensibilidade do mtodo no
permitiu analisar amostras com concentraes baixas de cidos (1,0 mg/L, por exemplo), com o
loop de 20 L que dispunha-se e o tempo de anlise foi muito longo (em torno de 30 minutos).
Quando as amostras eram provenientes de chorume de resduo slido, isso tornou-se
impraticvel, devido no somente ao tempo maior ainda de anlise (mais de 60 minutos), mas
tambm presena de muita matria orgnica, como cidos hmicos e flvicos, que podem
danificar a coluna cromatogrfica usada na anlise.
A anlise de cidos volteis vinha sendo realizada por CG/FID, mas injetando-se solues
aquosas, com pH em torno de 2,0, o que danificava a coluna, diminuindo sua vida til (somente
cerca de 20 injees). Esse fator era muito agravado quando se tratava de amostras de percolado,
com altas concentraes de cidos, inclusive no volteis, o que, alm de danificar a coluna
cromatogrfica, deixava resduos no detector e no injetor, exigindo limpezas peridicas dos
mesmos e inviabilizando as anlises por meio dessa metodologia.
Por esses motivos, desenvolveu-se uma metodologia adaptada de outras descritas na literatura
(BALDOCHI, 1997; DEL NERY, 1993; HENDERSON & STEEDMAN, 1982; Standard
Methods For The Examination Of Water And Wastewater, 1998), que permitiu a
reprodutibilidade dos resultados das anlises dos cidos volteis por cromatografia gasosa, sem a
injeo de amostras aquosas, fortemente cidas, mesmo tratando-se de amostras provenientes de
percolado. Trata-se da extrao dos cidos volteis por um solvente orgnico polar, como ter
etlico, seguida da injeo da fase etrea no cromatgrafo. Quando as amostras so provenientes
de percolado, uma destilao prvia das mesmas em um microdestilador (ver Figura 1) permite a
separao do material no voltil, aps o que feita uma extrao com ter etlico dos cidos
volteis e injeo no cromatgrafo gasoso.
MATERIAL E MTODOS
Equipamentos e reagentes utilizados
Cromatgrafo gasoso HP 6890, equipado com detector de ionizao de chama.
Coluna HP INNOWAX, 30m x 0,25mm x 0,25 m de espessura de filme; fluxo de gs de
arraste (hidrognio): 2,0 mL/min.; temperatura do forno: 100 C (3 min.) - 180C (5 min.), 5
C/min.
Temperatura do injetor: 250C; split: 20; volume injetado: 1,0 L.
Temperatura do detector: 300C; fluxo de ar sinttico: 300 mL/min., fluxo de hidrognio: 30
mL/min., fluxo de gs auxiliar (nitrognio): 33 mL/min., range:1.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
37
Sistema para cromatografia lquida de alta performance (HPLC) Shimadzu, equipado com
bomba LC-10 AD vp, vlvula FCV-10AL vp, forno para colunas CTO-10 A vp, controlador
SCL-10 A vp e detector SPD-M10 A vp.
Coluna Aminex HPX 87H, 300 x 7,8mm, eluente: cido sulfrico 0,005M, fluxo: 0,6
mL/min., temperatura do forno: 37 C.
ter etlico P.A. purificado neste laboratrio atravs de lavagens sucessivas com soluo
aquosa de KMnO
4
(P.A.) e posterior destilao.
NaCl P.A.
Microdestilador idealizado por Moraes, E. M. (Figura 1).
Manta aquecedora.
cidos orgnicos de cadeia curta (actico, propinico, isobutrico, butrico, isovalrico,
valrico, crotnico e caprico) e cido sulfrico grau P.A.
gua MilliQ
Metodologia desenvolvida
a) Extrao
O solvente mais adequado para a extrao dos cidos foi o ter etlico, por ser um solvente polar,
como o so os cidos em questo.
Para a extrao, uma alquota de 2,0 mL da amostra foi transferida para um tubo de ensaio
contendo, aproximadamente, 1,0 g de NaCl. Adicionou-se soluo de cido sulfrico 1,0 M
suficiente para acidificar a amostra, 100 L de soluo de cido crotnico 700 mg/L (padro
interno) e 0,60 mL ter etlico purificado (mantido em freezer at o momento de utilizao). O
tubo foi hermeticamente fechado e colocado em agitador Vrtex por 1,0 minuto, centrifugado
por 1,0 minuto, a 3000 rpm, e mantido no freezer (devido alta volatilidade do ter), juntamente
com a microsseringa utilizada para a injeo no cromatgrafo, at o momento de serem usados.
b) Destilao de amostras percolado
Antes do incio de cada destilao, feita em capela, o microdestilador foi colocado sobre a manta
aquecedora e conectado gua de refrigerao do condensador. Ao frasco coletor, adicionou-se
0,50 mL de soluo de NaOH 0,1 M e fechou-se com tampa de vidro esmerilhado, envolta por
pelcula de teflon. Adicionou-se ao balo, volumes no superiores a 1,00 mL de branco, padres
ou amostras, 100 L de soluo de cido crotnico ( 3,5 g/L) e 100 L de soluo de cido
sulfrico 6,0 M, e fechou-se com tampa de vidro esmerilhado envolta em pelcula de teflon.
Imediatamente, um tampo de algodo hidrfilo foi colocado no frasco lavador de vapores, ao
qual adicionou-se 0,40 mL de soluo de NaOH 0,1 M. Amostras de percolado provenientes de
aterro sanitrio, contendo altas concentraes de cidos volteis, foram introduzidas em
volumes de 100 L.
O aquecimento mximo da manta permitiu que o final da destilao fosse atingido aps cerca de
3 minutos, quando 1,00 mL de amostra foi destilado, constatado pela ausncia de ebulio do
lquido remanescente (cido sulfrico) e pela presena de resduos escuros no volteis. Durante
o resfriamento do destilador, iniciou-se a adio de gua destilada, atravs do coletor de vapores,
recolhendo-se a gua de lavagem juntamente com o destilado, posteriormente transferido para
balo volumtrico de 10,0 mL e o volume completado com gua destilada. A seguir, alquotas de
2,0 mL do destilado foram preparadas como descrito no item a.
Aspectos Metodolgicos 38
(1) balo de destilao, com entrada para a amostra
(fechado com tampa de com vidro esmerilhado) e sada
lateral (Vigreux) de vapores
(2) basto de vidro, para manter o frasco coletor afastado
do balo de destilao e da manta aquecedora.
(3) coletor do destilado, fechado por tampa de vidro
esmerilhado
(4) condensador, com entrada e sada de gua
(5) lavador de vapores
Figura 1 - Microdestilador
c) Quantificao
Para quantificar os cidos presentes nas amostras, utilizou-se o mtodo do padro interno (cido
crotnico), atravs de comparao dos fatores de resposta de cada cido (rea do cido/rea do
padro interno) com curvas de calibrao (feitas com os fatores de resposta dos cidos nas
solues padro), para as quais as solues de padres receberam tratamento idntico ao das
amostras.
RESULTADOS E DISCUSSO
Valores de coeficientes de correlao prximos de 1,0, para cada um dos cidos analisados pela
tcnica composta por etapas que poderiam ser fontes de erros, como destilao e extrao por
solvente orgnico, permitem a apresentao dessa metodologia como bastante adequada para ser
utilizada em amostras que no podem ser injetadas diretamente no cromatgrafo, como efluentes
de reatores anaerbios tratando esgoto domstico e industrial e de percolado de aterros
sanitrios.
Segundo Standard Methods for The Examination Of Water And Wastewater (1998), a destilao
de amostras contendo cidos volteis causa de perdas dessas substncias. Comparaes
realizadas com padres destilados e no destilados revelaram valores de fatores de resposta,
levemente inferiores para os padres destilados. Porm, as equaes que descrevem as relaes
entre as concentraes de cidos volteis e os fatores de resposta, bem como os coeficientes de
correlao, mostrados na Tabela 1, evidenciam que essas perdas so proporcionais s
4
5
3
2
1
Escala 1:2
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
39
concentraes e que so corrigidas pelo tratamento idntico a que so submetidos brancos,
padres e amostras.
A destilao das amostras de percolado de aterro sanitrio foi muito importante, pois, caso
contrrio, material no voltil tambm extrado pelo ter etlico, deixaria resduos no injetor e
detector, exigindo limpezas peridicas dos mesmos e inviabilizando esse tipo de anlise.
Tabela 1 - Equaes de retas obtidas para cidos volteis, com seus respectivos coeficientes
de determinao (r
2
), em solues padro destiladas
cido Equao r
2
Actico y = 0,0036x 0,0324 0,9994
Propinico y = 0,0208x 0,0110 0,9997
Isobutrico y = 0,0421x + 0,0144 0,9998
Butrico y = 0,0424x + 0,0223 0,9998
Isovalrico y = 0,0603x + 0,1336 0,9998
Valrico y = 0,0632x + 0,0007 0,9998
Caprico y = 0,0596x - 0,0708 0,9996
Na Tabela 2 encontram-se valores de concentraes dos cidos volteis, obtidos em amostras de
percolado provenientes de reatores anaerbios, tratando resduos slidos domiciliares.
Tabela 2 - Resultados obtidos para amostras de percolado provenientes de reatores
anaerbios tratando resduos slidos domiciliares
Amostra/
c
Actico
(g/L)
Propinico
(g/L)
Isobutrico
(g/L)
Butrico
(g/L)
Isovalrico
(g/L)
Valrico
(g/L)
Caprico
(g/L)
R1 18,46 1,93 0,82 10,85 0,60 0,26 1,15
R2 6,43 0,94 0,070 4,41 0,024 0,15 0,67
R3 7,42 1,36 0,24 10,92 0,40 0,34 2,57
Na Tabela 3 encontram-se as equaes de retas obtidas para cidos volteis com seus respectivos
coeficientes de determinao (r
2
) em solues padro no destiladas.
Tabela 3 - Equaes de retas obtidas para cidos volteis, com seus respectivos coeficientes
de determinao (r
2
), em solues padro no destiladas
cido Equao r
2
Actico Y = 0,0023x + 0,0089 0,9987
Propinico Y = 0,0135x + 0,0033 0,9999
Isobutrico Y = 0,0256x + 0,0090 0,9999
Butrico Y = 0,0246x + 0,0074 1,0000
Isovalrico Y = 0,0344x + 0,0117 1,0000
Valrico Y = 0,0352x + 0,0068 1,0000
Caprico Y = 0,0329x + 0,0125 0,9999
Aspectos Metodolgicos 40
Na Tabela 4 encontram-se valores obtidos em um ponto intermedirio de um reator anaerbio
horizontal de leito fixo (RAHLF), tratando substrato sinttico simulando esgoto sanitrio.
Tabela 4 - Resultados obtidos (mg/L) para amostra proveniente de RAHLF, tratando esgoto
domstico sinttico
Amostra/Ac. Actico Propinico Isobutrico Butrico Isovalrico Valrico
RAHLF 22,60 11,54 2,63 0,82 0,59 0,05
CONCLUSES
A extrao foi bastante eficiente, pois apresentou resultados experimentais compatveis com os
esperados para efluentes slidos e lquidos, provenientes de degradao anaerbia, e permitiu a
proteo da coluna contra condies drsticas como injeo de solues aquosas com pH < 2,
aumentando sua vida til. O tratamento igual ao das amostras, realizado para os padres para o
levantamento das curvas de calibrao e a utilizao de um padro interno para a quantificao
dos cidos, minimizam os possveis erros resultantes de processos de tratamento das amostras,
como extrao e destilao.
O mtodo de destilao mostrou-se muito adequado para a purificao de amostras provenientes
de matrizes muito complicadas, como percolado de aterro sanitrio, a serem analisadas por
cromatografia gasosa, porm resultados semelhantes no foram obtidos por cromatografia
lquida. Apesar da amostra ficar totalmente lmpida, testes realizados com cromatografia lquida
(ADAMS et al.,1984) revelaram que algumas outras substncias tambm destiladas, por
apresentarem tempos de reteno muito longos, inviabilizam a anlise por HPLC, uma vez que o
tempo de limpeza da coluna tornou-se muito elevado ( > 60 minutos).
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq (Processo 360079/99-7) e FINEP.
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Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
43
COLIFORMES E pH MDIAS ARITMTICAS, MDIAS
GEOMTRICAS E MEDIANAS
Marcos von Sperling *
* Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental UFMG; Av. Contorno 842 7
o
andar;
30110-060 Belo Horizonte Email: marcos@desa.ufmg.br
INTRODUO
O presente trabalho apresenta uma discusso sobre a melhor forma de se apresentar resultados de
tendncia central (mdias) dos seguintes parmetros de qualidade das guas: coliformes e pH.
Neste contexto, so analisadas mdias aritmticas, mdias geomtricas e medianas.
Com relao a coliformes, h um consenso de que a mdia que fornece uma melhor indicao a
mdia geomtrica, pelo fato dos valores de coliformes variarem segundo diversas ordens de
magnitude. Neste sentido, um nico valor extremamente elevado pode aumentar
substancialmente a mdia aritmtica, mesmo que todos os outros valores sejam baixos.
No entanto, com relao a pH, h uma divergncia, havendo posicionamentos no sentido de que
se pode e outros de que no se pode calcular a mdia aritmtica, j que pH uma varivel
transformada da concentrao de ons [H
+
].
O trabalho apresenta dois exemplos simplificados (coliformes e pH), nos quais se investigam os
trs tipos de representao da tendncia central, com duas diferentes formas de se calcular as
mdias geomtricas. A seguir, so utilizados dados reais de monitoramento de qualidade das
guas de trs postos de monitoramento, avaliando-se a aplicabilidade das mdias de coliformes e
de pH.
O principal objetivo do trabalho buscar esclarecer, de forma simples, alguns conceitos
importantes que interrelacionam as medidas de tendncia central destas importantes variveis de
qualidade das guas.
EXEMPLO SIMPLIFICADO DE UTILIZAO DE MDIA GEOMTRICA PARA
COLIFORMES
Suponha-se que tenham sido obtidos os seguintes valores de coliformes fecais em 4 amostras
dgua: 50, 400, 3.000 e 20.000 CF/100 mL. Estes dados, juntamente com os seus logaritmos na
base 10 (log10) esto apresentados na Tabela 1. Dentro do conceito de que a ordem de grandeza
dos coliformes que realmente importante, vrios pesquisadores relatam os coliformes em
termos de magnitude, a qual corresponde ao log10 do valor original.
Aspectos Metodolgicos 44
Tabela 1- Dados de coliformes
(dados originais e transformao logartmica)
Dado CF/100 mL Log
10
(CF)
1 5,00 x 10
1
1,699
2 4,00 x 10
2
2,602
3 3,00 x 10
3
3,477
4 2,00 x 10
4
4,301
A mdia geomtrica de CF dada pela raiz n do produto dos n termos:
1/n
n 2 1
) ...x .x (x geomtrica Mdia = (1)
No exemplo, aplicando-se a Equao 1:
CF/100mL 1,047x10 1047 00x20000) (50x400x30 ) x . x . x . (x geomtrica Mdia
3 1/4 1/4
4 3 2 1
= = = =
A mdia geomtrica tambm pode ser calculada por:
) logaritmos dos aritmtica (mdia
10 geomtrica Mdia = (2)
No exemplo, a mdia aritmtica dos log10 dos valores de CF apresentados na Tabela 1 3,020.
Assim:
CF/100mL 1,047x10 1047 10 geomtrica Mdia
3 (3,020)
= = =
O valor encontrado , naturalmente, igual ao obtido atravs da Equao 1.
Deve-se notar que a mdia aritmtica dos logaritmos pode ser tambm calculada como: mdia
aritmtica dos expoentes + mdia aritmtica dos log
10
dos termos antes dos expoentes. A mdia
aritmtica dos expoentes (1+2+3+4)/4 = 2,500. A mdia aritmtica dos log
10
dos termos antes
dos expoentes : (log5+log4+log3+log2)/4 = 0,520. A mdia aritmtica dos logaritmos ,
portanto: 2,500+0,520 = 3,020 (mesmo valor calculado anteriormente).
A seguinte afirmativa tambm importante, e facilmente dedutvel das consideraes acima:
Log
10
da mdia geomtrica = mdia aritmtica dos log
10
(3)
No exemplo:
Log
10
(1.047) = 3,020
EXEMPLO SIMPLIFICADO DE UTILIZAO DE MDIA ARITMTICA PARA PH
Suponha-se que tenham sido obtidos os seguintes valores de pH em 4 amostras de gua: 6,00;
6,70; 7,30; 8,00. Estes dados, juntamente com os correspondentes valores da concentrao de
ons H
+
(H
+
=10
-pH
) esto apresentados na Tabela 2.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
45
Tabela 2. Dados de pH e de H
+
(dados originais de pH e clculo de H
+
)
Dado pH [H
+
]
1 6,00 1,000 x 10
-6
2 6,70 1,995 x 10
-7
3 7,30 5,012 x 10
-8
4 8,00 1,000 x 10
-8
[H
+
] =10
pH
pH = -log
10
(H
+
)
A mdia aritmtica de pH : (6,00+6,70+7,30+8,00)/4 = 7,00.
A mdia geomtrica de [H
+
] , segundo a Equao 1:
7 - 1/4 8 - 8 - 7 - 6 -
1/4
4 3 2 1
1,000x10 ) x1,000x10 x5,012x10 x1,995x10 (1,00x10
) x . x . x . (x geomtrica Mdia
= =
= =
A mdia geomtrica de [H
+
] pode ser tambm calculada pela Equao 2, incluindo o sinal
negativo, pelo fato de pH = -log
10
(H
+
) :
-7 (-7,000)
1,000x10 10 geomtrica Mdia = =
Vale aqui tambm a Equao 3, adaptada para o sinal negativo:
- (Log
10
da mdia geomtrica de H
+
) = mdia aritmtica de pH
- log
10
(1,000x10
-7
) = 7,00
O seguinte comentrio pode ento ser feito. O pH uma mera representao da concentrao dos
ons H
+
em uma soluo. Se se pode tirar a mdia geomtrica de H
+
(da mesma forma que se tira
mdia geomtrica de CF, pelo fato de se ter diferentes ordens de magnitude dos valores), ento
se pode tirar a mdia aritmtica de pH (j que a mdia aritmtica de pH igual a log
10
da
mdia geomtrica de H
+
).
Comentrio similar pode ser feito para coliformes: pode-se tirar a mdia geomtrica de CF,
assim como se pode tirar a mdia aritmtica dos seus logaritmos.
No entanto, um ponto deve ficar bem claro: a presente anlise diz respeito busca de uma
medida de tendncia central. Isto no quer dizer que, se misturarmos duas amostras de igual
volume, uma com pH 6,0 e outra com pH 8,0, a amostra resultante ter pH 7,0. Com pH, deve-se
trabalhar, neste caso, com a concentrao de [H
+
]: uma amostra com concentrao 10
-6
e outra
com concentrao 10
-8
geraro uma amostra com a mdia aritmtica de ambas, ou seja, (10
-6
=
10
-8
)/2 = 5,05 x 10
-7
. O mesmo comentrio pode ser feito para coliformes: a mistura de duas
amostras gerar uma amostra com a mdia aritmtica das concentraes de CF, e no dos seus
logaritmos.
Aspectos Metodolgicos 46
DESVIO PADRO DE COLIFORMES E pH
O conceito de desvio padro geomtrico (DP
g
), relativo mdia geomtrica, distinto do
conceito convencional de desvio padro, para a mdia aritmtica (DP
a
). Tem-se, ainda, o desvio
padro, com base nos logaritmos dos valores dos dados originais (DP
log
).
Para os coliformes, o desvio padro convencional, com base na mdia aritmtica (mdia
aritmtica = 5,86x10
3
CF/100ml), DP
a
= 9,52x10
3
CF/100 mL.
Com relao ao desvio padro dos logaritmos (DP
log
) das concentraes de CF, tem-se os
seguintes valores. No exemplo acima, a mdia aritmtica dos log10 de CF 3,020 (j calculada
acima), ao passo que o desvio padro 1,121 (utilizando-se a frmula convencional de desvio
padro). A (mdia) +/- (1 desvio padro) dos logaritmos : 3,020 +/- 1,121 = 1,899 a 4,141.
Para o clculo do desvio padro geomtrico, so necessrias as seguintes consideraes. A
(mdia geomtrica) x/ (1 desvio padro geomtrico) calculada de acordo com:
log) dos aritm. padro desvio 1 log dos aritm. (mdia
10 geom. padro 1desvio x geom mdia
+
= (4)
log) dos aritm. padro desvio 1 - log dos aritm. (mdia
10 geom. padro 1desvio geom mdia = (5)
10
(3,020 +/- 1,121)
= 10
1,899
a 10
4,141
= 79 a 13836 CF/100mL
A mdia geomtrica (calculada acima) 1047 CF/100 mL. Observam-se as seguintes relaes
(CRITES & TCHOBANOGLOUS):
geom.) padro desvio 1 geomtrica (mdia
geom. mdia
geom. mdia
geom.) padro 1desvio x geom. (mdia

= (6)
2 , 13
79
1047
1047
13836
geom. padro desvio = = =
geom.) padro desvio 1 geomtrica (mdia x geom.) padro desvio 1 x geom. (mdia geom. mdia = (7)
CF/100mL 1047 13836x79 geomtrica mdia = =
No exemplo, a mdia geomtrica (1047 CF/100mL) 13,2 vezes superior ao limite inferior da
faixa (79 CF/100 mL), e 13,2 vezes inferior ao limite superior da faixa (13836 CF/100 mL). No
h, portanto, um afastamento uniforme entre os limites e a mdia geomtrica, mas sim uma
relao uniforme entre ambos. Desta forma, a faixa pode ser entendida como (mdia geomtrica
x/ desvio padro geomtrico), ao invs de (mdia +/- desvio padro). Caso se extraia os
logaritmos destes valores, ter-se-: mdia dos log10 +/- desvio padro dos log10.
Raciocnio similar ao exposto nos pargrafos precedentes se aplica ao pH. O clculo do desvio
padro para o pH pode ser feito de forma convencional. J o desvio padro das concentraes de
[H
+
], tendo por base o conceito da mdia geomtrica, deve seguir a sistemtica utilizada acima
para CF.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
47
DETERMINAO DAS MEDIDAS DE TENDNCIA CENTRAL PARA AMOSTRAS
EXISTENTES DE CURSOS DGUA
O presente item apresenta os valores da mdia aritmtica, mdia geomtrica e mediana de 96
dados reais de CF e pH, relativos a pontos de amostragem em uma bacia hidrogrfica do Estado
de Minas Gerais. Os pontos foram agrupados em um conjunto nico, de forma a aumentar o
nmero de dados e a facilitar sua interpretao. No h necessidade de se caracterizar a bacia
hidrogrfica, uma vez que o presente trabalho enfoca to somente os valores numricos de CF e
pH, sem fazer inferncias sobre a respectiva qualidade da gua.
A Figura 1 apresenta os histogramas de distribuio de freqncia de CF e de log
10
(CF).
Observa-se claramente que CF no segue uma distribuio normal, ao passo que o log
10
(CF) no
se afasta muito da normalidade. Tal sugere que a distribuio de CF seja log-normal. Testes de
aderncia a distribuies podem ser feitos (fora do escopo do presente trabalho).
HISTOGRAMA DE CF
CF (NMP/100mL)
N
o
d
e
o
b
s
e
r
v
a

e
s
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 30000 60000 90000 120000 150000 180000 210000 240000 270000 300000
HISTOGRAMA DE LOG10(CF)
LOG10 (CF)
N
o
d
e
o
b
s
e
r
v
a

e
s
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0
Figura 1 - Histogramas de distribuio de freqncia de CF e de log
10
(CF)
das 96 amostras analisadas
Aspectos Metodolgicos 48
A Figura 2 apresenta os histogramas de distribuio de freqncia de pH e de [H
+
] =10
pH
.
Observa-se que pH no se afasta da normalidade, o mesmo no ocorrendo com H
+
, o qual exibe
comportamento similar a CF.
HISTOGRAMA DE pH
pH
N
o
d
e
o
b
s
e
r
v
a

e
s
0
5
10
15
20
25
30
35
40
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5
HISTOGRAMA DE H+
H+ (EXP(-8))
N
o
d
e
o
b
s
e
r
v
a

e
s
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
0 5 10 15 20 25 30
Figura 2 - Histogramas de distribuio de pH e de [H
+
] =10
pH
das 96 amostras analisadas
As medidas de tendncia central obtidas para as amostras de CF e pH esto apresentadas na
Tabela 3. Observam-se os seguintes pontos, relativos aos dados do presente exemplo:
Para os parmetros que variam segundo ordens de grandeza, como CF e [H
+
], a mdia
geomtrica e a mediana tm valores similares, ao passo que a mdia aritmtica tem um valor
bem distinto.
Para os parmetros que so uma transformao logartmica dos dados originais, como
log10(CF) e pH, as trs mdias possuem valores relativamente prximos entre si.
Conforme mostrado nos exemplos acima, pode-se verificar que:
mdia geomtrica de CF = 10
(mdia aritm. logCF)
mdia geomtrica de [H
+
] = 10
( - mdia aritm. pH)
Tabela 3 - Medidas de tendncia central de CF e pH das amostras de qualidade das guas
Mdia CF/100mL Log
10
(CF) pH [H
+
]
Mdia aritmtica 15048 3,396 7,227 7,604 x 10
-8
Mediana 2250 3,352 7,245 5,689 x 10
-8
Mdia geomtrica 2488 3,273 7,221 5,930 x 10
-8
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
49
A Figura 3 apresenta o box-plot de CF, no qual podem ser observados os trs valores das
medidas de tendncia central, bem como os quartis inferiores e superiores, e os valores mnimos
e mximos.
Max = 2,4e5
Min = 17
75% = 15000
25% = 495
Mediana = 2250
BOX-PLOT: COLIFORMES
C
F
(
N
M
P
/
1
0
0
m
l
)
1
10
100
1000
10000
1e5
1e6
CF
Mdia arit.
=15048
Mdia geom.
=2488
Figura 3 - Box-plot de CF, com indicao da mdia aritmtica,
mdia geomtrica e mediana
O desvio padro convencional (DP
a
), com base na mdia aritmtica de CF, 37646 CF/100mL.
Desta forma, a faixa da (mdia) +/- (1 desvio padro ) : 15048 +/- 37646 = -22598 a 52694
CF/100mL.
O desvio padro dos log10 de CF (DP
log
) 0,885. Desta forma, a faixa da (mdia) +/- (1 desvio
padro ) dos log10 CF : 3,396 +/- 0,885 = 2,511 a 4,281.
O desvio padro geomtrico (DP
g
) calculado da seguinte forma. A faixa da (mdia geomtrica)
x/ (1 desvio padro geomtrico) dos dados de CF calculada com base na mdia +/- desvio
padro dos logaritmos dos valores originais (ver pargrafo acima): 10
2,511
a 10
4,281
= 324 a
19099 CF/100mL. Sabendo-se que a mdia geomtrica 2488 CF/100mL, e de acordo com a
Equao 6, tem-se que: desvio padro geomtrico 2488/324 = 19099/2488 = 7,68.
CONCLUSES E CONSIDERAES FINAIS
A mdia aritmtica de CF e [H
+
] pode no dar uma boa indicao da tendncia central.
A mdia geomtrica e a mediana de CF e [H
+
] podem dar uma boa indicao da tendncia
central.
A mdia aritmtica de log
10
(CF) e de pH pode dar uma boa indicao da tendncia central.
No h inconsistncias em se expressar a mdia aritmtica de pH, j que a mesma est
diretamente associada mdia geomtrica de [H
+
].
O desvio padro geomtrico, com base no conceito da mdia geomtrica, distinto do desvio
padro convencional, baseado na mdia aritmtica.
Pelo fato da interpretao do desvio padro geomtrico ser totalmente distinta dos desvios
padro convencionais, recomenda-se cautela e clareza na sua utilizao, para evitar
interpretaes errneas, j que os valores de DP
g
so menores do que os de DP
a
, e a faixa de
variabilidade expressa por (mdia geomtrica x/ desvio padro geomtrico), ao invs de
(mdia +/- desvio padro).
Aspectos Metodolgicos 50
Devido menor utilizao do conceito de desvio padro geomtrico, pode-se usar o desvio
padro aritmtico (deixando claro o fato de ser DP
a
), caso se trabalhe com os dados originais,
ou o desvio padro convencional dos logaritmos (DP
log
), caso se trabalhe com os log10 dos
dados originais.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
CRITES, R.,TCHOBANOGLOUS, G. (2000). Tratamiento de aguas residuales en pequeas
poblaciones. McGraw-Hill, Colombia, 776 pp.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
51
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE OS MTODOS DA
MEMBRANAFILTRANTE E DO SUBSTRATO
CROMOGNICO PARADETERMINAO DE
COLIFORMES FECAIS E Escherichia coli
Henio Normando de Souza Melo*, Ccero Onofre de Andrade Neto,
Josette Lourdes de Sousa Melo e Anita Maria de Lima
* Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Departamento de Engenharia Qumica,
Laboratrio de Engenharia Ambiental e Controle de Qualidade. Campus da UFRN, Natal/RN.
CEP 59.078-900. Email: henio@eq.ufrn.br
INTRODUO
Por volta de 1940, passou-se a adotar o critrio da temperatura elevada para diferenciar os
coliformes fecais no grupo de todos os organismos coliformes, baseado em estudos que
indicavam que apenas os coliformes fecais tinham capacidade de fermentar a lactose
temperatura de 44-45C.
Vrios estudos e pesquisas realizados nas ltimas trs dcadas tm demonstrado, contudo, que o
critrio da temperatura elevada no suficiente para diferenciar coliformes fecais (onde
predomina Escherichia coli) de no fecais (termosensveis). Coliformes fecais passaram, ento, a
ser denominados termotolerantes (ANDRADE NETO, 1999, citando: CERQUEIRA & HORTA,
1999; CEBALLOS, 1995; HAZEN, 1988; EDBERG et al., 1988; DUFOUR, 1977).
Nos meados da dcada de 1980, intensificaram-se os estudos na busca da identificao e
quantificao especfica de Escherichia coli, que a espcie termotolerante com maior
probabilidade de ter origem fecal e aceita como origem exclusivamente fecal. Surgiram, ento,
as tcnicas cromofluorognicas baseadas na quebra de molculas do substrato 4-metil-
umbelliferil--D-glucoronida pela enzima -D-glucoronidase, produzida pela Escherichia coli,
liberando 4-metil-umbelliferil, que produz fluorescncia azul intensa sob luz ultravioleta de
comprimento de onda 366 nm.
Com o desenvolvimento dos testes de substrato cromognico, ficou mais simples detectar e
quantificar Escherichia coli do que coliformes termotolerantes. Em 1995, as tcnicas
cromofluorognicas e a escolha de Escherichia coli como indicador de contaminao fecal mais
adequado estavam suficientemente normatizadas, aceitas e consolidadas (publicadas por
APHA/AWWA/WEF, em 1992 e 1995; indicado pela OMS, em 1995).
A Norma de Qualidade da gua para consumo humano, anexo da portaria do Ministrio da
Sade N 1469, de dezembro de 2000, define Escherichia coli como sendo considerada o mais
especfico indicador de contaminao fecal recente e de eventual presena de organismos
patognicos e estabelece padro microbiolgico com base na deteco de Escherichia coli ou
coliformes termotolerantes, mas recomenda a primeira para ser, preferencialmente, adotada.
Aspectos Metodolgicos 52
Porm, as concentraes de coliformes termotolerantes esto, geralmente, relacionadas
diretamente com as de E. coli e, por isso, considera-se aceitvel sua utilizao para avaliar a
qualidade bacteriolgica das guas, em anlises de rotina, atravs de tcnicas de deteco e
contagem consagradas, ainda muito utilizadas devido simplicidade, exequibilidade e aos
custos.
Ademais, pesquisas e estudos recentes tm demonstrado no haver diferenas significativas
quando se utilizam as tcnicas usuais (membrana filtrante com meio FC) para quantificao de
coliformes termotolerantes ou a tcnica cromognica para E. coli, em amostras de esgotos
sanitrios. CERQUEIRA et al. (1998) aplicando os dois mtodos em amostras de afluentes e
efluentes de estaes de tratamento de esgotos de Belo Horizonte, concluram que apesar do
teste da membrana filtrante detectar coliformes termotolerantes e o teste cromognico detectar E.
coli, os resultados obtidos foram semelhantes, indicando a predominncia de E. coli na
populao termotolerante que caracterstica de amostras de esgotos domsticos.
Escherichia coli tem sido o coliforme mais comumente encontrado em guas contaminadas por
fezes e esgotos, enquanto outros gneros tm sido mais freqentes quando se encontram
coliformes termotolerantes em guas sem evidncia de contaminao fecal (ANDRADE NETO,
1999).
CHERNICHARO et al. (2000), em anlise comparativa das tcnicas de tubos mltiplos e de
substrato definido aplicadas s amostras de esgoto bruto e de efluentes anaerbios, concluram
que as duas tcnicas comparadas produziram resultados estatisticamente equivalentes, tanto para
amostras de esgoto bruto como para efluentes anaerbios.
OBJETIVO
Este trabalho compara as tcnicas da membrana filtrante e do substrato cromognico, que
identificam, respectivamente, a presena de coliformes fecais e de Escherichia coli na
determinao de indicadores de contaminao fecal em guas naturais e em esgoto bruto e
tratado.
METODOLOGIA
Este estudo foi desenvolvido em esgoto bruto, em efluente tratado biologicamente em filtros
anaerbios e em gua natural proveniente de um manancial de abastecimento da cidade de Natal,
denominada Lagoa do Jiqui.
O Esgoto Bruto (EB) originado no departamento de educao fsica, no ginsio poliesportivo,
no restaurante e no pouso universitrio, apresentando, assim, caracterstica de esgoto domstico.
Todas essas unidades esto localizadas nos domnios do Campus Central da UFRN
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte).
O efluente tratado proveniente do tratamento biolgico realizado nos filtros anaerbios, com
condutes cortados como material suporte, os quais integram o sistema piloto construdo pelo
PROSAB/RN na Estao de Tratamento de Efluente do Campus Universitrio do Rio Grande do
Norte.
O sistema piloto composto por um Tanque Sptico com Filtros Anaerbios (TS-FAN). O
conjunto constitudo de duas cmaras dispostas em srie seguidas de um filtro anaerbio de
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
53
fluxo ascendente e dois filtros anaerbios com capacidade de 3,38 m
3
, sendo um de fluxo
descendente e o outro ascendente, ambos preenchidos com condutes cortados que servem de
material suporte.
A Lagoa do Jiqui est localizada no municpio de Parnamirim, a cerca de 13 km ao sul de Natal,
e alimentada em parte pelas guas do Rio Pitimbu, e em parte pelos exutrios naturais do grupo
barreira, provenientes dos lenis subterrneos da regio circundante.
Coleta de amostras
Foram realizadas 4 coletas fortuitas em cada ponto estabelecido (Esgoto Bruto, Filtros
anaerbios e Lagoa do Jiqui). As amostras coletadas foram divididas em 3 provas, totalizando,
ao final do estudo, 12 amostras para cada ponto estudado. O procedimento de amostragem e
acondicionamento o estabelecido pelo Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater 19
th
Edition 1995.
A amostragem foi realizada nos dias 24/07, 01/08, 04/08 e 11/08 de 2000, nos horrio de 9:00 h
para coleta realizada na Lagoa do Jiqui e 9:40 h para a coleta no sistema piloto localizado na
ETE-UFRN. Nessa amostragem foram utilizados recipientes de vidro com boca esmerilhada com
capacidade para 1000 mL, devidamente esterilizado.
A amostragem feita na Lagoa do Jiqui foi realizada no ponto de captao, mergulhando o frasco
para que fosse preenchido com a amostra. O ponto de Esgoto Bruto foi coletado aps o tanque de
equalizao do sistema piloto, montado pelo PROSAB na ETE-UFRN. Os efluentes dos filtros
foram coletados no tanque de acumulao, que tem a finalidade de reunir este efluente.
Procedimento de experimental
Preparao do material
Os frascos de coleta foram esterilizados a 160 C em estufa durante 2 horas. Antes da
esterilizao, a tampa do frasco foi protegida com papel bodega, ou papel alumnio, e
amarrada com barbante.
As pipetas graduadas, de 10 e 5 mL foram esterilizadas em estufa a 160 C durante 2 horas,
previamente enroladas com papel.
As placas de Petri e os tubos de ensaio foram esterilizados a 121 C por 15 minutos,
utilizando bonecas de algodo como tampa na sua extremidade superior, possibilitando
condies estreis do seu interior.
Preparo da soluo me para o lquido de diluio
Dissolver 3,4 g de fosfato de potssio monobsico em 50 mL de gua destilada (o pH dever
ser 7,2). Esterilizar num erlenmeyer durante 15 minutos a 121
o
C em autoclave. Aps a
esterilizao, cobrir o frasco com papel alumnio e guardar em geladeira.
Preparo do lquido de diluio
Para cada litro de gua de diluio, colocar 1,25 mL de soluo me e 1 litro de gua
destilada. Esterilizar a 121
o
C em autoclave durante 15 minutos e guardar em geladeira.
Aspectos Metodolgicos 54
Preparo do meio de cultura
Pesar 5,2 gramas de m-FC Agar e dissolver em 100 mL de gua destilada, utilizar 1 mL de
cido roslico a 1%, preparado com hidrxido de sdio 0,2 N.
Aquecer o meio de cultura em banho maria at consistncia gelatinosa.
Distribuir em placas de Petri, tomando o cuidado para a no formao de bolhas, esperar
esfriar e acondicionar em geladeira .
Mtodos empregados
Determinao de Coliformes Fecais pelo mtodo da membrana filtrante
a) Material utilizado
Placas de Petri;
Frascos de vidro com boca esmerilhada
de 1.000 mL para coleta;
Tubos de ensaio;
Pipetas graduadas;
Sistema de filtrao (Millipore);
Meio de cultura m-FC AGAR (Difco);
Algodo;
gua de diluio;
Bico de Busen;
Membrana de acetato de celulose dimetro
0,45 m;
Balo volumtrico de 2 litros;
Autoclave;
Estufa de esterilizao;
Incubadora de coliformes;
Pina estril (Millipore).
O fundamento da tcnica da membrana filtrante consiste em filtrar um volume conhecido de
amostra, ou de suas diluies, atravs de uma membrana atxica com porosidade extremamente
pequena (0,45m), a qual retm as bactrias na sua superfcie. As membranas, por sua vez, so
acondicionadas sobre um meio de cultura apropriado e encubadas sob uma temperatura de 44,5
C, onde ocorrer o desenvolvimento de colnias azuis passveis de quantificao pela Equao
1.
Diluio x amostra de Volume
x colnias de N
mL NMP Total Coli
100
) 100 / ( .
0
=
(1)
O meio de cultura utilizado neste estudo foi o m-FC AGAR (Agar/mFC), DIFCO, cuja
composio :
Triptose bacteriolgica 10,0g
Peptone proteose bacteriolgica 5,0g
Extrato de levedura bacteriolgico 3,0g
Cloreto de sdio 5,0g
Lactose 12,5g
Bile salgado bacteriolgico n3 1,5g
Anilina azul 0,5g
Agar bacteriolgico 15,0g
O meio preparado utilizando-se as quantidades indicadas pelo fabricante (5,2 g para 100 mL de
gua) e acrescenta-se, ainda, cido roslico a 1% diludo em hidrxido de sdio 0,2 N (para
formao colorao azul das colnias). Ao final, apresenta caracterstica slida.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
55
Com o emprego de uma pina estril, a membrana filtrante estril (com a parte reticulada para
cima) colocada sobre a placa porosa do receptculo. Em seguida, a parte superior do funil
acoplada e fixada ao receptculo. Efetua-se uma filtrao apenas com gua de diluio estril
com a finalidade de lavar o sistema de filtrao. Em seguida, nova quantidade de gua de
diluio estril colocada sobre a membrana ainda presa ao sistema de filtrao; sobre esta gua
goteja-se 1 mL da amostra ou diluio previamente preparada e filtra-se. Aps esta operao, a
membrana retirada imediatamente com pina estril e colocada sobre o meio slido (gar)
contido em uma placa de Petri, com o cuidado para evitar bolhas de ar aprisionadas. Dando
prosseguimento, a placa rotulada e encubada a 44 0,5 C por 24 horas. A unidade de filtrao
descontaminada, entre as amostras, com gua em ebulio.
Determinao de Coliformes Totais e Escherichia Coli utilizando o substrato cromognico
a) Material utilizado
Erlenmeyer de 250 mL
Proveta de 250 mL
Pipeta graduada de 20 mL
Bico de Busen
Quanti - Tray Sealer IDEXX
Quanti - Tray 2000 (cartelas com 97 concavidades)
gua de diluio
Todo o material foi esterilizado seguindo os mesmos procedimentos utilizados na metodologia
de membrana filtrante.
O princpio do mtodo baseia-se na utilizao, pelos coliformes, de um substrato cromognico
(-D-galactopiranosido) atravs do emprego da enzima -D- galactosidase, liberando-se uma
substncia que muda a cor do meio (o cromogeno onitrofenol amarelo forte). Pode-se ento dizer
que o teste determina a produo desta enzima (ONPG), normalmente presente nas estirpes de
coliformes, e indica, em 24 horas, coliformes totais positivos. Por sua vez, E. Coli possui a
enzima -glucoronidase que cliva o -D-glucoronido-4-metil-umbelliferona liberando (MUG) 4-
metil-umbelliferona que fluorescente sob a luz Ultra Violeta =360nm, ou seja, aps 24 horas
possvel tambm determinar a presena de E.coli.(CEBALLOS et al., 1999).
Tm sido desenvolvidos vrios meios de cultura com MUG, entre eles se destaca o
COLILERT

, onde o meio de cultura em p estril fornecido em sachet plstico e pronto para


adicionar a 100 mL de amostra ou de suas diluies. Para quantificao, usa-se a tcnica de
nmero mais provvel (NMP), desenvolvida em cartelas plsticas estreis e descartveis, que
substituem os tradicionais tubos de ensaio. A amostra colocada na cartela que selada e, em
seguida, encubada a 35 37 C durante 24 horas. Aps este perodo, promove-se contagem das
clulas que desenvolveram colorao amarelo intenso e/ou fluorescncia e, com o auxlio de uma
tabela fornecida pela COLILERT

, obtm-se o NMP de colnias a partir das relaes 2 e 3.


A Quanti Tray 2000 IDEXX baseia-se no mesmo modelo estatstico que a tradicional diluio
serial em 15 tubos. No mtodo serial, diferentes quantidades da amostra so distribudas em
tubos. Em seguida, acrescenta-se gua para fins de diluio em volume e de cobrir os tubos de
Durham.
Com o sistema Quanti-Tray 2000, a amostra automaticamente dividida nas pores apropriadas
atravs da Seladora Quanti-Tray, no sendo necessrio o uso de tubos de ensaio ou de Durham,
Aspectos Metodolgicos 56
possibilitando a distribuio automtica da amostra em 97 concavidades de 2 tamanhos
diferentes, que proporciona uma faixa de contagem acima de 2000 colnias, com um nvel de
confiana de 95% (encarte da COLILERT).
Diluio
encontrado N
mL NMP coli E
tabela cartela ) (
0
) 100 / ( .

=
(2)
Diluio
encontrado N
mL NMP CT
tabela cartela ) (
0
) 100 / (

=
(3)
b) Diluies
As diluies utilizadas nos dois mtodos estudados esto apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 Diluies utilizadas nos dois mtodos estudados
PONTO Substrato cromognico Membrana filtrante
Esgoto Bruto 10
-4
10
-5
10
-6
10
-3
10
-4
10
-5
Filtros anaerbios 10
-3
10
-4
10
-5
10
-2
10
-3
10
-4
Agua de superficie 10
0
10
-1
10
-2
10
0
10
-1
10
-2
A escolha de 3 diluies para cada ponto estudado justificada pela variedade de concentraes
de coliformes, em funo das chuvas ocorridas durante o perodo de acompanhamento.
c) Avaliao estatstica
Para a anlise estatstica dos dados foi utilizada a distribuio t de Student, adequada para
amostras pequenas (N<30).
Assumindo um nvel de significncia de 0,01 e 0,05 e grau de liberdade 22 recorreu-se a dados
tabelados e encontrou-se valores percentis de t
p
(t
0,99
) igual a 2,51 e t
p
(t
0,95
) igual a 2,07. A
equao utilizada para obter os valores de t para os dados amostrais foi:
2 1
2 1
1 1
N N
X X
t
+

(4) 2
2 1
2
2 2
2
1 1
+
+
= N N
S N S N
(5)
nas quais:
n
X = mdia das amostras
N = nmero de amostras
= desvio padro da populao
S = desvio padro das amostras
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
57
RESULTADOS E DISCUSSO
A anlise dos dados concernente s amostras provenientes da Lagoa do Jiqui mostra (indica)que
os valores referentes aos coliformes fecais, obtidos atravs da tcnica da membrana filtrante,
mostraram-se sistematicamente superiores aos obtidos pelo mtodo do substrato cromognico.
No obstante esta constatao, foi possvel observar pouca variao nas concentraes, como
pode ser comprovado pelos valores de amplitude de 2,30 x 10
3
e 3,54x10
2
para os mtodos
supracitados, respectivamente.
Para possibilitar a confirmao de que a diferena entre as concentraes mdias obtidas por
ambos os mtodos no era significativa, foi aplicado o mtodo da distribuio t de "Student,
cujos resultados podem ser visualizados na Tabela 2.
Tabela 2 Valores de t de student nos pontos estudados
PONTO t t
0,99
t
0,95
Esgoto Bruto 1,894 2,51 2,07
Efluente dos filtros 1,099 2,51 2,07
Lagoa do Jiqui 5,98 2,51 2,07
No caso da gua natural da Lagoa do Jiqui, o procedimento da anlise de varincia mostra que o
valor de t (5,98) muito maior que os valores de t
0,95
(2,07) e t
0,99
(2,51). Isso indica que a
hiptese nula deve ser rejeitada pois a diferena entre as mdias das concentraes
significativa.
Contudo, algumas consideraes podem ser levantadas como embasamento de uma hiptese
explicativa: as amostras foram coletadas nas imediaes do ponto de captao para o
abastecimento da cidade, com a expectativa de que as concentraes de coliformes fecais sejam
realmente pequenas. Assim sendo, a teoria das pequenas amostras N<30 talvez no seja a mais
indicada, devendo-se realizar um aprofundamento do trabalho com uma populao amostral
superior a 30 amostras para que as concluses sejam mais precisas.
As amostras de esgoto bruto e tratado apresentaram bastante variaes em ambos os mtodos
utilizados. Os efluentes dos filtros anaerbios descendentes tiveram amplitudes de variao de
5,72x10
6
e 5,48x10
6
para os mtodos de E. coli e coliformes fecais, respectivamente, enquanto
que as amplitudes para o esgoto bruto foram de 5,63x10
6
e 4,9x10
6
.
A comparao estatstica efetuada por meio da anlise de varincia mostrou que, em ambos os
casos, as diferenas das mdias no foram significativas. Os resultados no Esgoto Bruto
apresentou t=1,894, sendo, portanto, menor que os valores de t
0,95
=2,07 e t
0,99
=2,51. Isso posto,
pode-se concluir que est confirmada a hiptese nula, indicando que as diferenas mdias de
concentrao de coliformes nesses casos no so representativas.
Os resultados obtidos de Escherichia coli, pelo mtodo cromognico, e de coliforme fecal, por
meio da metodologia de membrana filtrante em m-FC AGAR, podem ser observados na Tabela 3
e nas Figuras 1, 2 e 3.
Aspectos Metodolgicos 58
Tabela 3 Resultados obtidos nos pontos estudados
Amostra Esgoto Bruto Filtros anaerbios Lagoa do Jiqui
E. coli* Coli. fecais E. Coli* Coli. fecais E. coli* Coli. fecais
1 5,50 x 10
5
5,00 x 10
6
1,33 x 10
6
1,80 x 10
5
3,24 x 10
1
6,00 x 10
2
2 2,47 x 10
6
4,47 x 10
6
1,39 x 10
6
2,00 x 10
5
4,78 x 10
1
7,00 x 10
2
3 5,65 x 10
6
2,00 x 10
6
1,41 x 10
6
2,10 x 10
5
5,31 x 10
1
5,00 x 10
2
4 5,16 x 10
5
2,45 x 10
6
4,48 x 10
5
1,30 x 10
6
1,17 x 10
2
7,00 x 10
2
5 4,20 x 10
4
2,74 x 10
6
9,36 x 10
5
5,66 x 10
6
9,71 x 10
1
1,40 x 10
3
6 2,00 x 10
4
1,00 x 10
5
4,53 x 10
6
3,74 x 10
6
7,28 x 10
1
1,00 x 10
3
7 4,45 x 10
5
8,37 x 10
5
6,17 x 10
6
6,40 x 10
5
2,44 x 10
2
1,70 x 10
3
8 1,26 x 10
6
3,55 x 10
6
1,16 x 10
6
1,64 x 10
6
1,72 x 10
2
1,80 x 10
3
9 5,98 x 10
5
1,34 x 10
6
2,06 x 10
6
3,58 x 10
5
2,50 x 10
2
2,00 x 10
3
10 6,98 x 10
5
2,24 x 10
6
1,41 x 10
6
2,49 x 10
5
2,18 x 10
2
1,80 x 10
3
11 5,39 x 10
5
2,32 x 10
6
1,96 x 10
6
3,30 x 10
5
3,87 x 10
2
1,70 x 10
3
12 3,76 x 10
6
4,58 x 10
6
1,56 x 10
6
3,98 x 10
5
2,81 x 10
2
2,80 x 10
3
mdia 1,38 x 10
6
2,64 x 10
6
2,03 x 10
6
1,24 x 10
6
1,64 x 10
2
1,39 x 10
3
mnimo 2,00 x 10
4
1,00 x 10
5
4,48 x 10
5
1,80 x 10
5
3,24 x 10
1
5,00 x 10
2
mximo 5,65 x 10
6
5,00 x 10
6
6,17 x 10
6
5,66 x 10
6
3,87 x 10
2
2,80 x 10
3
amplitude 5,63 x 10
6
4,90 x 10
6
5,72 x 10
6
5,48 x 10
6
3,54 x 10
2
2,30 x 10
3
desv.pad 1,65 x 10
6
1,46 x 10
6
1,64 x 10
6
1,73 x 10
6
1,07 x 10
2
6,71 x 10
2
int.confi 9,36 x 10
5
8,27 x 10
5
9,31 x 10
5
9,78 x 10
5
6,07 x 10
1
3,80 x 10
2
*Escherichia coli obtido pela tcnica do substrato cromognico utilizando COLILERT

Figura 1 Concentraes na Lagoa do Jiqui (gua natural)


Figura 2 Concentraes nos Filtros (efluente tratado)
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
0 2 4 6 8 10 12 14
Amostras da Lagoa do Jiqui
N
M
P
/
1
0
0
m
L
Escherichia
coli
Coliformes
fecais
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 2 4 6 8 10 12 14
Amostras do Esgoto Bruto
N
M
P
/
1
0
0
m
L
Escherichia
coli
Coliformes
fecais
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
59
Figura 3 Concentraes no Esgoto Bruto
Observa-se que, sobretudo na gua natural da lagoa do Jiqui, os valores das concentraes de
coliformes fecais, obtidos pelo mtodo da membrana filtrante, so maiores quando comparados
com as concentraes de Escherichia coli, obtidos a partir do substrato cromognico. Este fato
indica que a determinao de coliformes termotolerantes mais abrangente e a quantificao de
Escherichia coli, como indicador de contaminao, mais seletiva, justificando as diferenas
apresentadas.
A utilizao do substrato cromognico, como mtodo analtico de determinao da contaminao
em efluentes, mostrou-se bastante confivel, podendo ser utilizado em substituio ao mtodo da
membrana filtrante que determina a concentrao de coliformes fecais.
CONCLUSES
Nas amostras de Esgoto Bruto e do efluente do filtro anaerbio no se verificam diferenas
estatisticamente significativas, quando aplicadas as tcnicas da membrana filtrante com meio
mFC Agar ou da COLILERT.
Para amostras de gua natural, provenientes de manancial e com baixa contaminao fecal, as
tcnicas comparadas mostraram resultados diferentes, sendo o nmero de coliformes fecais
sistematicamente maior que o de E. coli. Contudo, em face da reduzida representatividade dos
indicadores, recomenda-se estudos mais profundos e com maior nmero de amostras, antes de
formular concluses definitivas em relao s guas naturais.
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1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 2 4 6 8 10 12 14
Amostras do Esgoto Bruto
N
M
P
/
1
0
0
m
L
Escherichia
coli
Coliformes
fecais
Aspectos Metodolgicos 60
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Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
61
ANLISE COMPARATIVA DAS TCNICAS DE TUBOS
MLTIPLOS E DE SUBSTRATO DEFINIDO, APLICADAS
IDENTIFICAO DE COLIFORMES EM AMOSTRAS DE
ESGOTOS BRUTOS E DE EFLUENTES ANAERBIOS
Carlos Augusto de Lemos Chernicharo*, Adriana Molina Zerbini, Roseli
Bernardo Bittencourt
*Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental - Av. do Contorno, 842 7

andar
30110-060 Belo Horizonte MG - Tel: (031) 238.1020 Fax: (031) 238.1879 E-mail:
calemos@desa.ufmg.br
INTRODUO
Para avaliao das condies sanitrias de uma gua, freqentemente so empregadas as
bactrias do grupo coliformes, que atuam como indicadores de poluio fecal. Seu emprego,
dentre outros fatores, se deve ao fato de que esto sempre presentes no trato intestinal humano e
de outros animais de sangue quente, sendo eliminadas pelas fezes em grandes nmeros.
Como o grupo dos coliformes totais inclui gneros que no so de origem exclusivamente fecal,
isto limita sua aplicao como indicador especfico de contaminao fecal. O reconhecimento
deste fato levou ao desenvolvimento de mtodos de enumerao de um subgrupo dos coliformes,
denominado coliformes fecais (coliformes termotolerantes), os quais so diferenciados dos
coliformes totais pela sua capacidade de fermentar a lactose sob temperatura elevada (44,5
0,2
0
C).
Embora a utilizao dos coliformes termotolerantes, em substituio aos totais, tenha
determinado uma melhoria significativa na deteco da contaminao fecal, logo tornou-se
evidente a existncia de outros coliformes termotolerantes, alm da Escherichia coli, podendo-se
estimar que cerca de 15% dos testes positivos para coliformes termotolerantes referem-se a
outros coliformes que no E. coli. Segundo CAPELNAS & KANAREK (1984) e EDBERG et al.
(1988), citados por CERQUEIRA (1999), os organismos presentes nesse percentual so
representados por espcies dos gneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter, provenientes de
contribuio ambiental (solo, vegetais e guas pristinas). Em ambientes aquticos tropicais, esses
gneros so facilmente isolados em condies em que no se observa poluio fecal humana e
animal.
Nesse sentido, as tendncias atuais se direcionam para a deteco especfica de Escherichia coli,
que o nico componente do grupo coliforme de origem exclusivamente fecal, apresentando um
percentual de ocorrncia em fezes humanas e animais prximo a 94% (ALLEN, 1995, citado por
CERQUEIRA, 1999).
De acordo com STANDARD METHODS (AWWA/APHA/WEF, 1998), as tcnicas usuais
empregadas para se detectar microrganismos indicadores de contaminao fecal em amostras de
gua e esgoto so: i) Tubos Mltiplos; ii) Membrana Filtrante; e iii) Substrato Definido. Cada
uma dessas tcnicas apresenta suas vantagens e desvantagens em termos de simplicidade,
rapidez, custos e demanda de equipamentos laboratoriais e de pessoal qualificado.
Anteriormente, justificava-se utilizar o teste da temperatura elevada para a diferenciao da
Aspectos Metodolgicos 62
poro fecal dos coliformes, uma vez que a deteco de E. coli era demorada e complexa para
exames de rotina. Atualmente, com o advento dos testes cromognicos (substrato definido), a
deteco e identificao da E. coli tornou-se simples e rpida, embora os custos de materiais para
realizao das anlises sejam ainda relativamente elevados.
OBJETIVOS
Considerando-se as grandes vantagens do teste cromognico (substrato definido) para a
enumerao de E. coli, principalmente em termos de simplicidade e rapidez, objetivou-se nesse
trabalho a anlise comparativa entre as tcnicas de tubos mltiplos e de substrato definido, a
partir dos perfis de ocorrncia de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia
coli, em esgoto bruto e no efluente de um reator anaerbio.
Tal anlise comparativa foi motivada, primariamente, para se saber se as contagens (nmero
mais provvel) de coliformes totais e E. coli obtidas com o mtodo de substrato definido
(Colilert, Quanti-Tray 2000) seriam estatisticamente equivalentes s obtidas com o mtodo de
tubos mltiplos, possibilitando, dessa forma, a comparao dos resultados entre as diferentes
pesquisas que integram o PROSAB Edital 2 Tema 2, uma vez que as mesmas utilizam
diferentes mtodos para deteco e enumerao de coliformes.
Adicionalmente, a anlise comparativa dos dois mtodos possibilitaria verificar se os resultados
obtidos com o mtodo de substrato definido podem ser comparados com limites mximos
estabelecidos pela legislao ambiental (Resoluo n
o
. 20 CONAMA), visando a verificao
de enquadramento, ou no, dos corpos receptores, em termos de coliformes totais e coliformes
fecais (termotolerantes).
METODOLOGIA
Para se avaliar comparativamente os mtodos de tubos mltiplos e de substrato definido, foram
analisadas, simultaneamente, amostras de esgoto bruto e de efluentes anaerbios, coletadas,
tambm, simultaneamente, em dias e horrios distintos.
Tendo em vista que a tcnica de substrato definido possibilita a enumerao de coliformes totais
(CT) e Escherichia coli (EC), enquanto a tcnica de tubos mltiplos possibilita a enumerao de
coliformes totais (CT) e coliformes fecais (CF), a comparao entre as contagens pelos dois
mtodos foi feita considerando-se:
Coliformes totais: tcnica de tubos mltiplos (CT) x tcnica de substrato definido (CT).
Coliformes fecais/Escherichia coli: tcnica de tubos mltiplos (CF) x tcnica de substrato
definido (EC).
Amostragem e preparo das amostras
Foram coletadas amostras pontuais do esgoto bruto e do efluente de um reator UASB, no perodo
de setembro a outubro/99, provenientes do Laboratrio de Instalaes Piloto (LIP) do
Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental (DESA), da Escola de Engenharia da
UFMG.
O esgoto bruto foi coletado na sada da tubulao de recalque, aps ser bombeado para o LIP, a
partir de um interceptor da margem direita do Ribeiro Arrudas, configurando-se, dessa forma,
um esgoto representativo da cidade de Belo Horizonte.
O efluente anaerbio foi coletado na sada de um reator UASB (420 L), que se encontra em
operao no LIP h mais de quatro anos. O esgoto bruto, antes de ser encaminhado ao reator
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
63
UASB, era submetido a um tratamento preliminar, constitudo de um cesto coletor de slidos,
caixa de areia e caixa de acumulao/distribuio.
Aps a coleta, as amostras foram transportadas para o Laboratrio de Anlises Bacteriolgicas
do DESA, sendo imediatamente processadas, no havendo necessidade de preservao. Foram
processadas 12 amostras de esgoto bruto e 12 de efluente anaerbio, segundo a rotina de coleta e
preparo das amostras apresentada na Tabela 1.
Tabela 1 Rotina de coleta e preparo das amostras
Diluies utilizadas
Tcnica de Tubos Mltiplos Tcnica de Substrato Definido
Data
Horrio
de coleta
(horas)
Esgoto bruto Efl. UASB Esgoto bruto Efl. UASB
9:30 10
6
10
7
10
8
10
6
10
7
10
8
10
6
10
7 -
10
6
10
7 -
10:30 10
6
10
7
10
8
10
6
10
7
10
8
10
6
10
7 -
10
6
10
7 -
20/09/99
11:30 10
6
10
7
10
8
10
6
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7
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8
10
6
10
7 -
10
6
10
7 -
9:30 10
7
10
8
10
9
10
5
10
6
10
7
10
6 - -
10
6 - -
10:30 10
7
10
8
10
9
10
5
10
6
10
7
10
6 - -
10
6 - -
28/09/99
11:30 10
7
10
8
10
9
10
5
10
6
10
7
10
6 - -
10
6 - -
9:30 10
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10
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6
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7
10
8
10
6
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7
10
8
10
6 - -
10
6 - -
Quantificao de coliformes pela tcnica de tubos mltiplos
Para a quantificao de coliformes totais e coliformes fecais pela tcnica de tubos mltiplos,
foram utilizadas trs sries de cinco tubos, com concentrao simples de caldo lactosado. O
nmero mais provvel (NMP/100 mL) de coliformes foi obtido atravs de tabelas estatsticas,
com um limite de confiana de 95% para cada valor de NMP determinado, de acordo com os
procedimentos descritos no STANDARD METHODS (AWWA/APHA/WEF, 1998).
Quantificao de coliformes pela tcnica de substrato definido
Para a quantificao de coliformes totais e Escherichia coli pela tcnica de substrato definido, foi
utilizado o sistema quanti-tray 2000, que permite uma leitura de coliformes totais/E. coli
variando de 1 a 2419,20 (NMP/100 mL), a partir de uma tabela estatstica com limite de
confiana de 95% para os valores determinados. As anlises foram realizadas de acordo com os
procedimentos descritos no STANDARD METHODS (AWWA/APHA/WEF, 1998).
RESULTADOS E DISCUSSO
Os resultados das anlises bacteriolgicas efetuadas pelos mtodos de tubos mltiplos e substrato
definido so apresentados nas Tabelas 2 e 3. Nas Figuras 1 a 3 so mostrados os resultados de
coliformes totais e nas Figuras 4 a 6 os resultados de coliformes fecais e Escherichia coli.
Aspectos Metodolgicos 64
Tabela. 2 Concentraes de coliformes totais, coliformes fecais
e Escherichia coli no esgoto bruto
Tubos Mltiplos
(NMP/100 mL)
Substrato Definido
(NMP/ 100 mL) Amostra
Dia da
coleta
Horrio
da coleta
(h) Col. Totais Col. Fecais Col. Totais E. coli
1 9:30 3,3E+07 1,60E+09 5,4E+07 5,2E+06
2 10:30 2,8E+08 2,60E+07 7,2E+07 5,2E+06
3
20/09/99
11:30 2,8E+08 2,60E+07 3,8E+06 6,3E+06
4 9:30 4,0E+07 2,0E+07 2,4E+09 4,4E+07
5 10:30 2,2E+08 8,0E+07 4,5E+08 2,1E+07
6
28/09/99
11:30 1,6E+10 3,4E+08 1,9E+08 2,0E+07
7 9:30 2,4E+07 3,90E+07 1,5E+09 5,6E+07
8 10:30 4,8E+07 3,90E+07 2,1E+08 3,7E+07
9
05/10/99
11:30 1,6E+09 4,8E+07 2,6E+08 9,6E+06
10 9:30 1,4E+07 4,0E+06 1,6E+09 5,0E+07
11 10:30 4,2E+08 2,1E+08 2,5E+08 8,6E+06
12
18/10/99
11:30 4,0E+07 4,8E+07 1,2E+09 2,4E+07
Tabela. 3 Concentraes de coliformes totais, coliformes fecais
e Escherichia coli no efluente do reator UASB
Tubos Mltiplos
(NMP/100 mL)
Substrato Definido
(NMP/100 mL) Amostra
Dia da
coleta
Horrio
da coleta
(h) Col. Totais Col. Fecais Col. Totais E. coli
13 9:30 4,0E+06 2,00E+06 1,0E+06 1,0E+06
14 10:30 2,0E+06 2,00E+06 5,9E+07 2,0E+07
15
20/09/99
11:30 6,0E+06 6,00E+06 1,2E+07 6,3E+06
16 9:30 7,0E+05 4,0E+05 8,8E+07 2,0E+07
17 10:30 2,6E+06 1,7E+06 5,3E+07 1,1E+07
18
28/09/99
11:30 1,4E+06 4,0E+05 2,8E+07 8,6E+06
19 9:30 6,0E+06 4,0E+06 1,8E+07 2,0E+06
20 10:30 4,0E+06 4,0E+06 5,3E+07 3,0E+06
21
05/10/99
11:30 1,0E+07 8,0E+06 1,0E+08 8,6E+06
22 9:30 3,9E+07 3,2E+07 1,2E+07 4,1E+06
23 10:30 8,0E+06 8,0E+06 4,4E+07 3,1E+06
24
18/10/99
11:30 (*) (*) (*) (*)
(*) A amostra n
o
. 24 foi perdida
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
65
Figura 1 Concentraes de coliformes totais no esgoto bruto
Figura 2 Concentraes de coliformes totais no efluente
do reator UASB
Figura 3 Concentraes de coliformes totais no esgoto bruto
e no efluente do reator UASB
1.E+06
1.E+07
1.E+08
1.E+09
1.E+10
1.E+11
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Amostra
C
o
l
i
f
o
r
m
e
s
t
o
t
a
i
s
(
N
M
P
/
1
0
0
m
L
)
Tubos Mltiplos Substrato Def inido
1.E+05
1.E+06
1.E+07
1.E+08
1.E+09
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Amostra
C
o
l
i
f
o
r
m
e
s
t
o
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a
i
s
(
N
M
P
/
1
0
0
m
L
)
Tubos Mltiplos Substrato Def inido
1.E+05
1.E+06
1.E+07
1.E+08
1.E+09
1.E+10
1.E+11
0 5 10 15 20 25
Amostra
C
o
l
i
f
o
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m
e
s
t
o
t
a
i
s
(
N
M
P
/
1
0
0
m
L
)
Tubos Mltiplos Substrato Def inido
Aspectos Metodolgicos 66
Figura 4 Concentraes de E. coli e coliformes fecais
no esgoto bruto
Figura 5 Concentraes de E. coli e coliformes fecais
no efluente do UASB
Figura 6 Concentraes de E. coli e coliformes fecais no esgoto bruto
e no efluente do reator UASB
1.E+05
1.E+06
1.E+07
1.E+08
1.E+09
1.E+10
0 5 10 15 20 25
Amostra
E
.
c
o
l
i
/
c
o
l
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f
o
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m
e
s
f
e
c
a
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s
(
N
M
P
/
1
0
0
m
L
)
Tubos mltiplos Substrato def inido
1.E+06
1.E+07
1.E+08
1.E+09
1.E+10
0 2 4 6 8 10 12 14
Amostra
E
.
c
o
l
i
/
c
o
l
i
f
o
r
m
e
s
f
e
c
a
i
s
(
N
M
P
/
1
0
0
m
L
)
Tubos mltiplos Substrato definido
1.E+05
1.E+06
1.E+07
1.E+08
12 14 16 18 20 22 24
Amostra
E
.
c
o
l
i
/
c
o
l
i
f
o
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m
e
s
f
e
c
a
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s
(
N
M
P
/
1
0
0
m
L
)
Tubos mltiplos Substrato Def inido
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
67
Coliformes totais
Nas Figuras 1 a 3 so mostrados os resultados de coliformes totais obtidos pelas duas tcnicas,
inicialmente para o esgoto bruto (Figura 1), depois para o efluente anaerbio (Figura 2) e, por
ltimo, para o conjunto de resultados obtidos com o esgoto bruto e com o efluente anaerbio
(Figura 3).
Esgoto bruto
Pela anlise da Figura 1, pode-se observar que as concentraes de coliformes totais no esgoto
bruto apresentaram-se bastante variveis ao longo do perodo de monitoramento (para diferentes
dias e horrios de coleta de amostras), para ambas as tcnicas de enumerao. No entanto, as
concentraes de coliformes totais obtidas com as duas tcnicas testadas apresentaram-se
aparentemente equivalentes, no tendo sido possvel observar nenhuma tendncia de super- ou
sub-estimao de uma tcnica em relao outra. Para se confirmar que os resultados obtidos
com a tcnica de substrato definido no foram diferentes dos obtidos com a tcnica de tubos
mltiplos, foi realizado o teste estatstico de anlise de varincia, com intervalo de confiana de
95%, tendo sido obtidos os dados de sada apresentados na Tabela 4. Pode-se observar, a partir
da Tabela 4, a confirmao da hiptese nula, ou seja, de no haver diferena entre as mdias das
concentraes de coliformes totais obtidas com os dois mtodos, uma vez que o valor de F
(0,454) muito inferior ao valor de F
crtico
(7,945).
Efluente do reator UASB
Em relao ao efluente do reator UASB, a anlise da Figura 2 mostra que as contagens de
coliformes totais pelas duas tcnicas mantiveram-se mais estveis ao longo do perodo de
monitoramento, mas com uma tendncia de obteno de resultados mais elevados com a tcnica
de substrato definido. Para avaliar se esses resultados mais elevados obtidos com a tcnica de
substrato definido configuravam-se estatisticamente diferentes dos resultados obtidos com a
tcnica de tubos mltiplos, foi novamente realizado o teste de anlise de varincia, tendo sido
obtidos os dados de sada apresentados na Tabela 4. Observa-se, nesse caso, que o valor de F
(11,316) maior que o valor de F
crtico
(7,945), indicando que a hiptese nula deve ser rejeitada,
ou seja, que os resultados obtidos com os dois mtodos podem ser considerados estatisticamente
diferentes. Todavia, a anlise estatstica foi efetuada para um pequeno conjunto de dados (12
anlises), sendo recomendado que mais testes sejam realizados para se inferir com maior
preciso as tendncias observadas nesse estudo comparativo das duas tcnicas.
Tabela 4 Resultados dos testes de anlise de varincia entre as concentraes de coliformes
totais obtidas com as tcnicas de substrato definido e tubos mltiplos
Amostra Grupo Tcnica F valor-P F crtico
C. totais Substrato Definido Esgoto bruto
C. totais Tubos Mltiplos
0,454 0,507283 7,945
C. totais Substrato Definido Efluente UASB
C. totais Tubos Mltiplos
11,316 0,002802 7,945
Aspectos Metodolgicos 68
Coliformes fecais/Escherichia coli
Nas Figuras 4 a 6 so mostrados os resultados de coliformes fecais e Escherichia coli obtidos
pelas duas tcnicas, inicialmente para o esgoto bruto (Figura 4), depois para o efluente anaerbio
(Figura 5) e, por ltimo, para o conjunto de resultados obtidos com o esgoto bruto e com o
efluente anaerbio (Figura 6).
Esgoto bruto
Pela anlise da Figura 4, pode-se observar que as concentraes de coliformes fecais e de E. coli
no esgoto bruto apresentaram-se bastante variveis ao longo do perodo de monitoramento (para
diferentes dias e horrios de coleta de amostras), para ambas as tcnicas de enumerao. No
entanto, as concentraes de coliformes fecais e de E. coli obtidas com as tcnicas de tubos
mltiplos e de substrato definido, respectivamente, apresentaram-se aparentemente equivalentes,
com uma maior diferena sendo observada apenas para a amostra 1. No foi possvel observar
nenhuma tendncia de super- ou subestimao de uma tcnica em relao outra. Para se
confirmar que os resultados obtidos com a tcnica de substrato definido (E. coli) no foram
diferentes dos obtidos com a tcnica de tubos mltiplos (coliformes fecais), foi realizado o teste
estatstico de anlise de varincia, tendo sido obtidos os dados de sada apresentados na Tabela 5.
Os resultados da anlise estatstica confirmam a aceitao da hiptese nula, ou seja, de no haver
diferena entre as mdias das concentraes de coliformes fecais e de E. coli, uma vez que o
valor de F (1,570) muito inferior ao valor de F
crtico
(7,945).
Efluente do reator UASB
Em relao ao efluente do reator UASB, a anlise da Figura 5 mostra que as contagens de
coliformes fecais e de E. coli tambm foram muito variveis ao longo do perodo de
monitoramento, para as duas tcnicas de anlise testadas. Aparentemente, no houve super- ou
subestimaro de contagens de uma tcnica em relao outra. A confirmao de que os
resultados obtidos com a tcnica de substrato definido (E. coli) no foram diferentes dos obtidos
com a tcnica de tubos mltiplos (coliformes fecais), foi obtida, novamente, com a utilizao do
teste estatstico de anlise de varincia, conforme mostram os dados de sada apresentados na
Tabela 5. Os resultados da anlise estatstica confirmam a aceitao da hiptese nula, ou seja, de
no haver diferena entre as mdias das concentraes de coliformes fecais e de E. coli, uma vez
que o valor de F (0,280) muito inferior ao valor de F
crtico
(7,945).
Tabela 5 Resultados dos testes de anlise de varincia entre as concentraes de coliformes
fecais e de E. coli obtidas com as tcnicas tubos mltiplos e de substrato definido
Amostra Grupo Tcnica F Valor-P F crtico
E. coli Substrato Definido Esgoto bruto
C. fecais Tubos Mltiplos
1,570 0,223422 7,945
E. coli Substrato Definido Efluente UASB
C. fecais Tubos Mltiplos
0,280 0,601829 7,945
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
69
CONCLUSES
As tcnicas de tubos mltiplos e de substrato definido, para enumerao de coliformes totais em
esgoto bruto, se mostraram estatisticamente equivalentes, com grau de confiana de 95%,
conforme demonstrado pelos testes de anlise de varincia efetuados. J para o efluente
anaerbio, os resultados de enumerao obtidos com as duas tcnicas se mostraram
estatisticamente diferentes. Todavia, a anlise estatstica foi efetuada para um pequeno conjunto
de dados (12 anlises), sendo recomendado que mais testes sejam realizados para se inferir com
maior preciso as tendncias observadas.
As duas tcnicas comparadas, utilizadas para enumerao de coliformes fecais (tubos mltiplos)
e Escherichia coli (substrato definido), produziram resultados estatisticamente equivalentes,
tanto para amostras de esgoto bruto quanto de efluente anaerbio. Dessa forma, pode-se inferir
que os resultados obtidos nas diferentes pesquisas que integram o PROSAB Edital 2 Tema 2,
em termos de coliformes fecais e E. coli, podem ser analisados de forma comparativa. Alm
disso, pode-se verificar o enquadramento dos corpos receptores, definidos pela legislao
ambiental em termos de coliformes fecais, com base nos resultados de E. coli obtidos pela
tcnica de substrato definido.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ALLEN, M. J., EDBERG, S. C (1995). The public health significance of bacterial indicators in drinking
water. International Conference Coliforms and E. coli: Problem or solution?, University of
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coliformes termotolerantes e Escherichia coli em diferentes amostras de gua. In: Anais eletrnicos
do 20
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Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental, ABES, Rio de Janeiro.
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Washington, 1998.
CAPELNAS, N. R., KANAREK, M. S. (1984). Thermotolerant nonfecal source of Klebsiella
pneumoniae: validity of the fecal coliform test in recreational waters. American. Journal of Public
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de coliformes termotolerantes e Escherichia coli em diferentes amostras de gua. In: Anais
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0
Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental, ABES, Rio de
Janeiro.
CERQUEIRA, D. A., BRITO, L. L. A., GALINARI, P. C. & AMARAL, G. C. M. (1999). Perfis de
ocorrncias de coliformes termotolerantes e Escherichia coli em diferentes amostras de gua. In:
Anais eletrnicos do 20
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Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental, ABES, Rio
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CETESB (1993). Norma tcnica L5.202 Coliformes totais e fecais Determinao pela
tcnica de Tubos Mltiplos Mtodo de ensaio, 39 p.
EDBERG, S. C., ALLEN, M. J. & SMITH, D. B (1988). National field evaluation of a defined substrate
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water: comparison with the standard multiple tube fermentation method. Applied Bacteriology, v.
54, n. 6, p. 1595 1601, apud CERQUEIRA, D. A. et al. (1999). Perfis de ocorrncias de
coliformes termotolerantes e Escherichia coli em diferentes amostras de gua. In: Anais eletrnicos
do 20
0
Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental, ABES, Rio de Janeiro.
Aspectos Metodolgicos 70
METODOLOGIAS PARA QUANTIFICAO,
IDENTIFICAO E ANLISE DE VIABILIDADE DE OVOS
DE HELMINTOS EM ESGOTOS BRUTOS E TRATADOS
SUMRIO
INTRODUO..................................................................................................................................................71
QUANTIFICAO E IDENTIFICAO DE OVOS DE HELMINTOS........................................................71
Consideraes preliminares.................................................................................................. 71
Principais metodologias para quantificao e identificao................................................... 72
Mtodo de Bailenger modificado........................................................................................... 75
Descrio do mtodo de Bailenger modificado................................................................................75
Equipamentos, materiais e reagentes..........................................................................................................76
Preparao de solues ..............................................................................................................................76
Procedimentos para quantificao dos ovos................................................................................................76
Expresso de resultados.............................................................................................................................78
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos ...................................................................................................79
Identificao de ovos de helmintos........................................................................................ 80
Consideraes preliminares.............................................................................................................80
Critrios para diferenciao de ovos de helmintos ...........................................................................80
Ilustrao fotogrfica de ovos de helmintos .....................................................................................83
DETERMINAO DE VIABILIDADE DE OVOS DE HELMINTOS ...........................................................85
Consideraes preliminares.................................................................................................. 85
Principais tcnicas disponveis.............................................................................................. 85
Tcnica de incubao.................................................................................................................................86
Tcnica de critrios morfolgicos ..............................................................................................................87
Tcnica da flutuao com n-butanol...........................................................................................................87
Tcnica de incluso ou excluso de corantes biolgicos..............................................................................88
Descrio da tcnica de incubao adaptada ....................................................................... 89
Equipamentos, materiais e reagentes..........................................................................................................89
Preparao de solues ..............................................................................................................................89
Coleta de amostras.....................................................................................................................................90
Procedimento ............................................................................................................................................90
Expresso dos resultados ...........................................................................................................................90
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos ...................................................................................................92
Ilustrao fotogrfica do desenvolvimento de ovos de Ascaris lumbricoides ...............................................94
Descrio da tcnica de incluso ou excluso de corantes biolgicos .................................. 95
Aplicao para esgotos brutos (tcnica da concentrao por centrifugao) .....................................95
Equipamentos, materiais e reagentes..........................................................................................................95
Preparao de solues ..............................................................................................................................95
Coleta de amostras.....................................................................................................................................96
Procedimento ............................................................................................................................................96
Expresso dos resultados ...........................................................................................................................97
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos ...................................................................................................98
Aplicao para esgotos tratados (tcnica da concentrao por filtrao)...........................................99
Equipamentos, materiais e reagentes..........................................................................................................99
Preparao de solues ..............................................................................................................................99
Coleta de amostras.....................................................................................................................................99
Procedimento ..........................................................................................................................................100
Expresso dos resultados .........................................................................................................................100
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos .................................................................................................102
Ilustrao fotogrfica de ovos de helmintos pela tcnica da colorao............................................103
CONCLUSES.................................................................................................................................................104
Metodologia de quantificao e identificao de ovos de helmintos.................................... 104
Metodologias de viabilidade de ovos de helmintos.............................................................. 104
AGRADECIMENTOS......................................................................................................................................105
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................................................105
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
71
METODOLOGIAS PARA QUANTIFICAO,
IDENTIFICAO E ANLISE DE VIABILIDADE DE OVOS
DE HELMINTOS EM ESGOTOS BRUTOS E TRATADOS
Adriana Molina Zerbini e Carlos Augusto de Lemos Chernicharo
*
* Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental - Escola de Engenharia da UFMG.
Avenida do Contorno, 842/701 - 30110-060 - Belo Horizonte - MG.
E-mail: calemos@desa.ufmg.br
INTRODUO
Este trabalho apresenta uma consolidao de metodologias para anlises de ovos de helmintos
em esgotos brutos e tratados, no que diz respeito sua quantificao, identificao e
determinao de viabilidade, objetivando a padronizao de procedimentos nas pesquisas
apoiadas pelo PROSAB Edital 2 Tema 2.
Esta consolidao foi realizada a partir da implementao de procedimentos laboratoriais de
rotina, que vm propiciando o acompanhamento das pesquisas com ovos de helmintos em
esgotos brutos e tratados. Os procedimentos ora descritos so oriundos, primariamente, dos
trabalhos desenvolvidos por AYRES & MARA (1996); GALVN, GUTIRREZ & de
VICTORICA (1996); GALVN & de VICTORICA (1998) e ROJAS, GALVN & de
VICTORICA (1998), os quais foram parcialmente adaptados pelo Laboratrio de Anlises
Microbiolgicas do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental DESA/UFMG, para
atender s necessidades das pesquisas desenvolvidas no mbito do PROSAB.
QUANTIFICAO E IDENTIFICAO DE OVOS DE HELMINTOS
Consideraes preliminares
Com o desenvolvimento da parasitologia mdica, diversas tcnicas foram propostas para a
quantificao de ovos de helmintos intestinais e larvas, em fezes (FAUST et al., 1939;
BAILENGER, 1979), com os princpios bsicos destas tcnicas tendo sido adaptados para a
quantificao de ovos de helmintos em esgotos (AYRES, 1989; STIEN & SCHWARTZBROD,
1988; WHO, 1989; AYRES & MARA, 1996) e em lodo (MEYER et al., 1978).
Diversos mtodos para a quantificao de ovos de helmintos em esgotos so descritos na
bibliografia especializada, cada um com suas vantagens e desvantagens geralmente citadas pelo
prprio autor. Alguns apresentam uma elevada percentagem de recuperao, mas demandam
grande tempo de anlise; muitos no foram publicados em detalhes para permitir sua aplicao,
ou suas taxas de recuperao no so conhecidas; alguns demandam reagentes qumicos de custo
muito elevado ou no so adequados para o uso em laboratrios com limitaes de
equipamentos; enquanto outros so capazes de recuperar apenas um nmero limitado de espcies
(ver Tabela 1). Fica claro, com isso, que no existe um mtodo que seja universalmente til, que
recupere todos os ovos de helmintos de importncia mdica, e que tenha uma taxa de
recuperao conhecida (AYRES & MARA, 1996).
Aspectos Metodolgicos 72
Nesse sentido, os mtodos empregados para anlise parasitolgica em esgotos variam de
laboratrio para laboratrio, sendo que alguns so mais especficos para esgotos brutos e outros
para efluentes tratados, que podem apresentar um nmero menor de ovos de helmintos. Alguns
mtodos possuem, ainda, aplicabilidade tanto para quantificao quanto para viabilidade de ovos
de helmintos. A escolha do mtodo a ser utilizado deve ser feita unicamente quando as
facilidades e exigncias particulares da situao so conhecidas. Deve-se levar em considerao
o objetivo da pesquisa e o tipo de sistema que est sendo utilizado para o tratamento dos esgotos,
alm da percentagem de recuperao e aplicabilidade do mtodo utilizado.
Todos os mtodos disponveis baseiam-se em um dos dois princpios fundamentais: i) os ovos
dos parasitos so separados, por flutuao, dos resduos presentes na amostra, em uma soluo
de maior densidade relativa; ou ii) a gordura e outros materiais so separados em uma soluo
de interface (usualmente ter ou acetato de etila), enquanto os ovos sedimentam em uma soluo
no miscvel, abaixo.
Ambos os procedimentos so baseados na fora centrfuga. Os fatores que determinam se a
concentrao de determinadas espcies de ovos ser satisfatria dependero do balano
hidroflico-lipoflico dos organismos e da densidade relativa destes, em relao ao reagente de
separao. Isso significa, na prtica, que o pH, ou a presena de metais pesados ou lcoois, nos
reagentes utilizados, poder alterar as propriedades das superfcies dos ovos e cada espcie
responder diferentemente a essas alteraes. Assim, nenhum mtodo concentrar todas as
espcies com a mesma eficincia (AYRES & MARA, 1996).
Principais metodologias para quantificao e identificao
Diversos estudos foram efetuados comparando as metodologias para anlises de ovos de
helmintos em fezes, visando a sua adaptao para amostras de esgotos, mas a maioria apresentou
desvantagens que inviabilizaram sua utilizao. BOUHOUM & SCHWARTZBROD (1989)
compararam vrios mtodos para anlises de ovos de helmintos em fezes, objetivando a
adaptao destes para amostras de esgotos. Dos cinco mtodos testados, trs utilizavam o
princpio da flutuao: i) Janeckso & Urbanyi; ii) Faust ; e iii) Arther. Os outros dois mtodos
utilizavam o princpio da sedimentao: iv) Bailenger; e v) Ritchie.
Com base nos estudos comparativos realizados, BOUHOUM & SCHWARTZBROD (1989)
testaram uma ampla faixa de solues de flutuao para a concentrao de ovos de helmintos e
chegaram s seguintes concluses principais:
em relao ao mtodo Janeckso & Urbanyi, foi observado que o reagente de flutuao,
iodomercurato de potssio, concentrava uma grande faixa de espcies de ovos de helmintos.
No entanto, concluram que o reagente era muito txico, corrosivo e caro para ser utilizado
em testes de rotina;
o mtodo de Faust, que utilizou para flutuao a soluo de sulfato de zinco a 33%, mostrou-
se completamente inadequado para a concentrao de algumas espcies de Nematdeos, a
exemplo de Trichuris sp. e Capillaria sp.;
o mtodo de Arther, que utiliza a sacarose saturada como soluo de flutuao, era mais
barato, porm deformava os ovos rapidamente.
BOUHOUM & SCHWARTZBROD (1989) concluram que o mtodo de Bailenger, que utiliza
ter e soluo tampo aceto-actica com pH 5 (BAILENGER, 1979), concebido originalmente
para quantificao de ovos de helmintos em fezes, adaptado para amostras de esgotos, se
mostrou o mais adequado, tendo em vista que o mesmo requeria reagentes baratos e era capaz de
concentrar, com sucesso, uma ampla faixa de espcies rotineiramente encontradas em esgotos
sanitrios.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios
73
AYRES et al. (1991) testaram os seguintes mtodos para a quantificao de ovos de helmintos
em efluentes tratados:
mtodo correntemente recomendado pela WHO, mais comumente conhecido como mtodo
de Bailenger modificado, processando 1 L e 10 L, separadamente;
mtodo correntemente utilizado pela Estao Experimental de Tratamentos Biolgicos de
Esgotos Sanitrios (EXTRABES-UFPB), processando 500 mL da amostra;
mtodo desenvolvido especialmente para efluentes de lagoas, conhecido como mtodo Leeds
II, onde 4 L da amostra foram processados em cada ocasio;
mtodo modificado de Janeckso & Urbanyi, processando 25 L da amostra, utilizando o
tiosulfato de sdio (densidade especfica 1,30) como soluo de flutuao.
Com base nos estudos comparativos realizados, AYRES et al. (1991) chegaram s seguintes
concluses principais:
quando foi utilizado o mtodo de Bailenger, processando 1 L da amostra para efluente
tratado, este no foi eficiente, resultando em baixas contagens de ovos de helmintos. Porm,
quando 10 L da amostra foram processados, observou-se taxas de deteco muito maiores,
se comparadas com as taxas do mtodo Leeds II. No mtodo de Bailenger, a preparao da
amostra direta e, em termos de identificao no microscpio, o tempo requerido pequeno,
em torno de 1 a 2 minutos, dependendo da qualidade do efluente. Podem ser feitas duplicatas
e triplicatas, diminuindo assim a margem de erro. Em trabalhos de rotina em laboratrios, o
mtodo de Bailenger, utilizando um volume de amostra de 10 L, parece ser o mais
apropriado para a quantificao de ovos de helmintos em esgotos tratados;
o mtodo da EXTRABES o mais barato e o mais fcil de ser utilizado, sendo, no entanto,
mais especfico para amostras de esgoto bruto, onde a concentrao de ovos geralmente
muito grande. Segundo AYRES et al. (1991), o mtodo inadequado para detectar ovos de
helmintos presentes em baixas concentraes, devido ao fato de que o mesmo utiliza
amostras de pequeno volume e etapa de subamostragem;
o mtodo Leeds II tambm barato e de fcil utilizao, quando a concentrao de slidos
suspensos totais baixa, possibilitando que a contagem com a cmara de Doncaster seja
efetuada em torno de 5 a 10 minutos. No entanto, a qualidade do efluente pode variar muito
e, em algumas situaes, algas e resduos mais pesados no flutuaro em soluo salina,
deixando uma amostra final muito suja, dificultando sobremaneira a identificao e a
contagem dos ovos, uma vez que a anlise torna-se muito cansativa e consome muito tempo.
A principal vantagem dessa tcnica a sua elevada taxa de recuperao, devido ao fato de
que no h nenhuma etapa de subamostragem e todos os ovos de cada amostra individual so
contados diretamente;
no mtodo modificado de Janeckso & Urbanyi, foram identificados ovos com a mesma
freqncia dos mtodos de Bailenger modificado (processando 10 L) e Leeds II. O mtodo
foi considerado ligeiramente mais difcil que os outros, pelo fato de manusear amostras de
maiores volumes (25 L). Alm disso, em sua ltima etapa, a eventual presena de resduos
flutuantes pode dificultar a amostragem do menisco superior que concentra os ovos.
CRISPIM et al. (1995) testaram e avaliaram o desempenho dos mtodos EXTRABES e Leeds I
(citados por AYRES et al., 1989), em comparao ao mtodo de Bailenger modificado.
Observou-se que este ltimo apresentou uma eficincia 1,5 vezes maior que o mtodo
EXTRABES e 7,8 vezes maior que o mtodo de Leeds I, e os autores concluram que o
percentual de recuperao de ovos diminui medida em que se aumenta o valor de slidos
sedimentveis.
As principais caractersticas dos mtodos mais comumente utilizados para quantificao e
identificao de ovos de helmintos so apresentadas na Tabela 1.
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Mtodo de Bailenger modificado
Para a quantificao e identificao de ovos de helmintos em esgotos domsticos, a tcnica mais
utilizada a da sedimentao dos slidos contendo os ovos de helmintos. Dos mtodos
disponveis, destacam-se o descrito em WHO (1989) e o de Bailenger modificado (AYRES &
MARA, 1996).
Embora a percentagem de recuperao do mtodo de Bailenger modificado no seja conhecida
(AYRES & MARA, 1996), e este no seja adequado para a identificao de vrios ovos de
trematdeos operculados e de alguns ovos de cestdeos, estudos desenvolvidos por BOUHOUM
& SCHWARTZBROD (1989) e AYRES et al. (1991) demonstraram que o mtodo se compara
favoravelmente em relao a outras tcnicas, sendo capaz de recuperar uma maior diversidade de
espcies de ovos de helmintos, incluindo Ascaris sp., Trichuris sp., Capillaria sp., Enterobius
vermicularis, Toxocara sp., Taenia sp., Hymenolepis sp e Ancilostomdeos.
Nesse sentido, o presente trabalho descreve o mtodo de BAILENGER (1979), modificado por
AYRES & MARA (1996), que deu origem metodologia atualmente recomendada pela
Organizao Mundial de Sade para a quantificao de ovos de helmintos em esgotos brutos e
tratados, conforme descrito na publicao "Analysis of wastewater for use in agriculture a
laboratory manual for parasitological and bacteriological techniques (AYRES & MARA, 1996).
Este mtodo foi escolhido em funo de sua simplicidade e de seu baixo custo dos reagentes
utilizados, alm do que propicia a recuperao de uma ampla faixa de ovos de helmintos,
particularmente ovos de nematdeos (Ascaris sp., Trichuris sp. e ancilostomdeos), que so
especificados no guia da Organizao Mundial de Sade para o reso na agricultura, conforme
estudo especfico desenvolvido por AYRES et al. (1991).
Descrio do mtodo de Bailenger modificado
As amostras de esgotos a serem processadas passam pelas etapas de sedimentao, centrifugao
e flutuao. Aps sucessivas centrifugaes da amostra, com descarte do sobrenadante, o
sedimento tratado com soluo tampo aceto-actica (pH 4,5) e ter (ou acetato de etila), para a
separao do material gorduroso. Posteriormente, com a adio de uma soluo de sulfato de
zinco de alta densidade (ZnSO
4
densidade 1,18), os ovos flutuam. Os ovos que possuem
densidade relativa menor que este valor so separados do sedimento e, portanto, flutuam. A
contagem realizada utilizando-se uma cmara de McMaster, com observao no microscpio
em objetivas de 10x e 40x.
O tamanho, a densidade relativa e a velocidade de sedimenteo de alguns ovos so mostrados
na Tabela 2. Pode-se observar, que com exceo dos ovos de Schistosoma mansoni , os demais
so ligeiramente menores que os ovos de Ascaris suum e suas densidades relativas so similares,
exceto para os ovos de Taenia saginata, que apresentam densidade bem mais elevada (1,30).
Tabela 2 - Tamanho, densidade e velocidade de sedimentao de
algumas espcies de ovos de helmintos
Espcie tamanho
(m)
Densidade Velocidade de
sedimentao (m/h)
Ascaris suum 65 x 45 1,13 0,95
Ascaris lumbricoides 55 x 40 1,11 0,43
Schistosoma mansoni 50 x 150 1,18 5,23
Trichuris trichiura 22 x 50 1,15 0,48
Taenia saginata 40 x 35 1,30 0,83
Ancilostomdeos 60 x 40 1,06 0,26
Fonte: DUNN (1991)
Aspectos Metodolgicos 76
Equipamentos, materiais e reagentes
Para a preparao das amostras e quantificao de ovos de helmintos, de acordo com o mtodo
de Bailenger modificado, so necessrios os seguintes equipamentos, materiais e reagentes
(AYRES & MARA, 1996):
Microscpio ptico comum, com objetivas de 10x e 40x
Centrfuga para operar a 1.000 g
Tubos de centrfuga
Agitador Vortex
Bomba de suco ou sifo
Cmara de McMaster
Pipetas de Pasteur
Pipetas volumtricas
Densmetro
Bquer de 1 litro
Balde de 10 litros
Garrafes de plstico com tampa de rosca e capacidade para 1 e 10 litros
Soluo tampo aceto-actica (pH 4,5)
Soluo de sulfato de zinco (densidade 1,18)
Soluo Triton X-100 ou Tween 80
ter ou acetato de etila
Preparao de solues
So os seguintes os principais procedimentos para preparao das solues, necessrias
quantificao de ovos de helmintos pelo mtodo de Bailenger modificado:
Soluo de sulfato de zinco: pesar 33 g de ZnSO
4
e diluir em 100 mL de gua destilada
(utilizar um densmetro para verificar se a densidade igual a 1,18).
Soluo tampo aceto-actica (pH 4,5): pesar 5 g de acetato de sdio cristalino, misturar em
3,6 mL de cido actico glacial e completar o volume com gua destilada at 1.000 mL.
Corrigir o pH da soluo para 4,5 com os prprios reagentes.
Soluo detergente Triton X-100 ou Tween 80: pipetar 1 mL da soluo e adicionar em 1
litro de gua de torneira.
Procedimentos para quantificao dos ovos
De acordo com o mtodo de Bailenger modificado, so adotados os seguintes procedimentos
para preparao das amostras e quantificao de ovos de helmintos (AYRES & MARA, 1996):
a) Coletar uma amostra de esgoto de volume conhecido (V litros) - usualmente, 1 litro para
esgoto bruto, ou parcialmente tratado, e 10 litros para esgoto tratado (ver nota 1).
b) Deixar a amostra sedimentar em um bquer (esgoto bruto) ou em um balde (esgoto tratado).
Usualmente, tm sido adotados tempos de sedimentao de cerca de 1 hora para o esgoto
bruto e de 2 horas para o esgoto tratado (ver nota 2).
c) Remover aproximadamente 90% do sobrenadante, usando uma bomba de suco ou um
sifo, garantindo que fique no recipiente um volume de aproximadamente 100 mL para o
esgoto bruto e de 1 L para o esgoto tratado. Inclinar o recipiente, caso necessrio, tendo o
cuidado para no ressuspender o sedimento.
d) Transferir, cuidadosamente, o sedimento para os tubos da centrfuga, enxaguando o bquer
e/ou o balde com soluo Triton (ou Tween). Para qualquer transferncia do sedimento de
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 77
um recipiente para o outro, ou de um tubo para outro tubo, enxaguar com soluo Triton (ou
Tween).
e) Pesar todos os tubos, ajustando-os simetricamente na centrfuga, e proceder a centrifugao a
1.000 g (ver nota 3) por 15 minutos.
f) Aps a primeira centrifugao, descartar o sobrenadante. Transferir todos os sedimentos para
um nico tubo e centrifugar novamente a 1.000 g (ver nota 3) por 15 minutos.
g) Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento contido no tubo utilizando um volume
equivalente de soluo tampo aceto-actica (pH 4,5), ou seja, para um volume do sedimento
igual a 2 mL, adicionar 2 mL da soluo tampo. Caso o volume do sedimento seja inferior a
2 mL, adicionar soluo tampo at completar um volume de 4 mL. Este volume mnimo de
4 mL visa facilitar o descarte do sobrenadante obtido durante a etapa (i), sem provocar a
ressuspenso do sedimento contendo os ovos.
h) Complementar o preenchimento do tubo com a adio de um volume de ter (ou acetato de
etila), correspondente a duas vezes o volume do sedimento, e homogeneizar a amostra com
equipamento tipo Vortex. Exemplo: se o volume do sedimento for 2 ml, adicionar 4 mL de
ter ou acetato de etila.
i) Centrifugar a 1.000 g (ver nota 3) por 15 minutos. Aps a centrifugao, a amostra
apresentar trs fases distintas: i) no fundo do tubo se concentrar todo o material no
gorduroso e fragmentos pesados, incluindo os ovos de helmintos, larvas e protozorios; ii)
uma fase intermediria, contendo a soluo tampo, que dever ser clara (transparente); e iii)
uma fase superior, contendo a gordura e outros materiais, que juntamente com o ter (ou
acetato de etila) formam uma camada tampo espessa e de cor escura.
j) Descartar todo o sobrenadante com um nico movimento firme e rpido, deixando no tubo
apenas o sedimento (anotar o volume do sedimento). Caso seja necessrio, desprender a
camada tampo de cor escura com uma agulha fina, visando facilitar o descarte do
sobrenadante.
k) Adicionar um volume de soluo de sulfato de zinco igual a 5 vezes o volume do sedimento
(ex: se o volume do sedimento for igual a 1 mL, adicionar 5 mL da soluo de sulfato de
zinco). Anotar o volume do produto final, sedimento + sulfato de zinco (X mL) e
homogeneizar a amostra com equipamento tipo Vortex.
l) Remover, rapidamente, uma alquota da amostra final, com o auxlio de uma pipeta de
Pasteur, e transferir para a cmara de McMaster. Deixar a cmara de contagem em repouso
durante 5 minutos, para permitir que os ovos flutuem e atinjam a superfcie do retculo de
contagem.
m) Examinar no microscpio, em objetivas de 10x ou 40x, e contar todos os ovos que esto
dentro do retculo (ver nota 4). Para uma melhor preciso na quantificao dos ovos, deve-se
fazer a leitura de mais de uma cmara, preferencialmente trs, e calcular a mdia aritmtica
das contagens obtidas (ver expresso de clculo no item seguinte).
Notas:
(1) o mtodo muito eficiente quando utilizado para esgotos brutos, os quais usualmente apresentam
uma elevada concentrao de ovos de helmintos. Para esgotos tratados, no entanto, o nmero de ovos
tende a ser muito baixo; nestes casos, o volume da amostra deve ser aumentado pelo menos para 10
litros, objetivando uma melhor recuperao dos ovos. Caso o nmero de ovos de helmintos no esgoto
bruto tambm seja baixo, deve-se aumentar o volume da amostra de 1 para 5 litros.
(2) dependendo da altura do recipiente utilizado, o perodo de sedimentao dos ovos deve ser
aumentado. A lei de Stokes' pode ser utilizada para se estimar as taxas de sedimentao dos ovos de
Aspectos Metodolgicos 78
nematdeos em esgotos, conforme a seguir (taxas usualmente adotadas, para uma temperatura de 20
0
C):
Ascaris lumbricoides: 20 mm/min
Trichuris trichiura: 16 mm/min
Ancilostomdeos: 6 mm/min
Para garantir a recuperao de todos os ovos, recomendado que o tempo de sedimentao adotado
seja pelo menos o dobro do tempo de sedimentao terico (calculado de acordo com a lei de
Stokes'). A experincia do DESA/UFMG tem indicado que tempos de sedimentao ainda maiores
favorecem uma maior recuperao dos ovos.
(3) a expresso que relaciona g com rpm como a seguir:
r
g k
rpm
.
=
na qual:
k: 89.456
r: o raio da centrfuga (distncia entre o eixo da centrfuga e o centro do recipiente), em cm
(4) se a quantidade de ovos contidos dentro do retculo for zero, ou muito baixa, deve-se contar os
eventuais ovos que podero estar fora do retculo
Expresso de resultados
O nmero final de ovos da amostra de esgotos deve ser calculado por meio da seguinte equao:
V P
X A
N

=
na qual:
N: nmero de ovos (n
o
de ovos/litro)
A: nmero mdio de ovos contados nas cmaras de McMaster (n
o
de ovos)
X: volume do produto final (mL)
P: volume da cmara de McMaster (para cmara de dois retculos P = 0,30 mL; para cmara de um
retculo P = 0,15 mL)
V: volume original da amostra (ver procedimento "a")
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 79
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos
Alguns dos procedimentos para preparao das amostras e quantificao dos ovos de helmintos
so ilustrados a seguir:
Fig. 1 Remoo do sobrenadante aps
o perodo de sedimentao
(procedimentos "b" e "c")
Fig. 2 Etapas de centrifugao
(procedimentos "e", "f" e "i")
Fig. 3 Separao de fases da amostra
(procedimento "i")
Fig. 4 Homogeneizao da amostra com
Vortex (procedimentos "h" e "k")
Fig. 5 Transferncia do sedimento
homogeneizado para a cmara de McMaster
(procedimento "l")
Fig. 6 Observao dos ovos no microscpio,
em objetivas de 10x e 40x
(procedimento "m")
Aspectos Metodolgicos 80
Identificao de ovos de helmintos
Consideraes preliminares
Os esgotos domsticos podem conter uma variedade de ovos de helmintos provenientes das fezes
humanas. Alm disso, podem apresentar, com freqncia, ovos de parasitos de animais, como de
porcos, ratos, cachorros e pssaros, juntamente com os ovos de parasitos intestinais humanos.
Nesse sentido, a correta identificao dos ovos de helmintos deve ser realizada baseando-se,
principalmente, nas suas caractersticas morfolgicas e de tamanho. Para tal, torna-se
indispensvel proceder medio exata dos ovos, utilizando-se um microscpio calibrado, de
forma a se conseguir a correta identificao e diferenciao dos ovos de helmintos presentes na
amostra. Isso porque o tamanho dos ovos um dos principais critrios que diferencia a
classificao das espcies de parasitos.
Critrios para diferenciao de ovos de helmintos
A identificao dos ovos de helmintos baseada, principalmente, no tamanho e na identificao
de caractersticas morfolgicas especficas dos ovos, tais como: forma, contedo do ovo,
espessura da membrana externa (casca) etc. So os seguintes os principais critrios para
identificao dos ovos (STOTT, 1998):
tamanho: os ovos de helmintos variam, em comprimento, de pequenos (18 m) a grandes
(150 m ou maiores) e possuem dimetros to pequenos como 12 a 14 m (como o caso de
alguns ovos de trematdeos) a 90 m ou mais (caso dos maiores ovos de trematdeos);
forma: os ovos de helmintos podem ser de forma esfrica ou oval, embora alguns poucos
possam ser assimtricos;
membrana externa: os ovos de helmintos usualmente apresentam parede externa lisa,
variando na espessura, dependendo da espcie;
contedo interno: os ovos recentemente excretados apresentam estgios de desenvolvimento
que so caractersticos para cada espcie. Em sua maioria, os ovos de nematdeos no
apresentam-se embrionados quando liberados com as fezes;
vrias modificaes da estrutura dos ovos tambm se constituem ferramentas importantes de
identificao, a exemplo de: protuberncias, espinhos, rolhas polares e oprculos.
Um resumo das principais caractersticas que auxiliam na diferenciao de alguns ovos de
helmintos apresentado na Tabela 3. Na Figura 7 so apresentados os tamanhos relativos dos
ovos de helmintos.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 81
Tabela 3 Principais caractersticas de alguns ovos de helmintos usualmente
encontrados em esgotos brutos e tratados
Ovo Tamanho Principais caractersticas
Ascaris lumbricoides (frtil) 55 a 75 m x 35 a 50 m
forma: esfrica ou oval
cor: castanho-amarelada
possui membrana mamilonada (alguns
ovos podem apresentar-se sem essa
membrana ovo descorticado)
casca espessa
Ascaris lumbricoides (infrtil) 85 a 95 m x 43 a 47 m
forma: alongada
membrana mamilonada delgada
Trichuris trichiura 50 a 55 m x 22 a 24 m
forma: aspecto tpico de um pequeno
barril
cor: castanho
possui duas rolhas polares
possui duas membranas
Ancilostomdeo
Ancylostoma duodenale:
em torno de 60 m
Necator americanus: em
torno de 70 m
forma: ovide ou elptica
sem segmentao ou clivagem
entre a casca e a clula-ovo h sempre
um espao claro que diminui medida
que avana a segmentao
membrana fina e transparente envolvida
por uma linha preta
Enterobius vermicularis 50 a 60 m x 20 a 32 m
membrana dupla, lisa e transparente
ligeiramente achatado de um lado
possui no seu interior uma larva j
formada
Hymenolepis diminuta 70 a 80 m de dimetro
forma: aproximadamente esfrica
apresenta dupla casca
no possui filamentos dispostos no
espao que separa a casca interna da
externa
oncosfera tpica, com seus trs pares de
acleos, estando envolvida por duas
membranas
Hymenolepis nana 30 a 47 m de dimetro
forma: ovide ou arredondada
cor: transparente
oncosfera tpica, com seus trs pares de
acleos, estando envolvida por duas
membranas
possui filamentos polares
Taenia sp 30 m de dimetro
forma: esfrica
possui uma casca protetora denominada
embriforo
dentro do embriforo se encontra a
oncosfera ou embrio hexacanto com
dupla membrana e trs pares de acleos
Fonte: REY (1991)
Aspectos Metodolgicos 82
Figura 7 Tamanhos relativos dos ovos de helmintos
Fonte: WHO (1994)
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 83
Ilustrao fotogrfica de ovos de helmintos
Alguns dos ovos de helmintos, usualmente encontrados em esgotos brutos e tratados, so
ilustrados nas Figuras 8 a 15 (Fonte: AYRES & MARA ,1996).
Fig. 8 Ovo frtil de Ascaris lumbricoides Fig. 9 Ovo infrtil de Ascaris lumbricoides
Fig. 10 Ovo de Trichuris trichiura Fig. 11 Ovo de Ancilostomdeo
Aspectos Metodolgicos 84
Fig. 12 Ovo de Hymenolepis nana Fig. 13 Ovo de Hymenolepis diminuta
Fig. 14 Ovo de Taenia sp Fig. 15 Ovo de Enterobius vermicularis
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 85
DETERMINAO DE VIABILIDADE DE OVOS DE HELMINTOS
Consideraes preliminares
Em relao aos ovos de helmintos, no basta apenas avaliar o aspecto quantitativo de sua
presena em esgotos. Tambm o aspecto qualitativo, relativo viabilidade destes, adquire grande
relevncia do ponto de vista epidemiolgico. A viabilidade dos ovos de helmintos uma
caracterstica de primordial importncia, j que, de acordo com o ciclo de vida de grande parte
dos helmintos (notadamente os nematdeos Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e
ancilostomdeos), os ovos fertilizados que so eliminados nas fezes do hospedeiro no sero
infecciosos at que se tornem embries ativos. Ou seja, no sero capazes de causar enfermidade
at que se transformem, dentro do ovo, em larvas infectivas. A etapa de desenvolvimento, desde
o embrio at a larva infectiva, ocorre no solo ou nos cultivos, sendo que esta capacidade
infectiva pode permanecer latente durante anos se as condies ambientais forem adequadas
(GALVN & VICTORICA, 1998).
Os ovos frteis so considerados, tambm, ovos potencialmente viveis, ou seja, que possuem a
capacidade para se desenvolver at a etapa infectiva. considerada viabilidade potencial porque
o desenvolvimento pode ser interrompido, por diferentes causas, e o ovo (larva) pode no chegar
etapa infectiva (ROJAS et al., 1998). Porm, a simples presena do agente infeccioso nos
efluentes utilizados na irrigao, no implica, necessariamente, na imediata transmisso de
doenas, caracterizando apenas um risco potencial. O risco real de um indivduo ser infectado
depende, na verdade, da combinao de uma srie de fatores, dentre os quais (MARA &
CAIRNCROSS, 1989):
dose infectiva;
patogenicidade;
suscetibilidade e grau de imunidade do hospedeiro;
grau de exposio humana aos focos de transmisso;
resistncia dos organismos patognicos ao tratamento de esgotos e s condies ambientais.
Na maioria dos sistemas de tratamento de esgotos, alguns ovos so removidos, enquanto outros,
mais resistentes, como os ovos de Ascaris, Toxocara, Toxascaris e Trichuris, persistem nesses
sistemas. As condies do meio ambiente em torno dos ovos contribuem para o seu
desenvolvimento ou morte, observando-se que, em condies adequadas, os ovos de Ascaris
podem sobreviver por mais de 6 anos, pois estes so altamente resistentes aos agentes fsicos e
qumicos (PAWLOWSKI, 1982). Esses ovos so muito resistentes, sendo vulnerveis quase que
exclusivamente ao calor e dessecao (OGATA, 1924 e FEACHEM et al., 1983).
Em termos de sade pblica, os ovos de helmintos no-viveis so irrelevantes, porm, quando
esses so viveis, os riscos para a sade pblica so muito elevados. Dessa forma, a informao
sobre a quantidade de ovos viveis considerada de grande importncia, quando esses ovos so
isolados do meio ambiente, seja no solo, no lodo ou em efluentes lquidos.
Principais tcnicas disponveis
Existem diversas tcnicas propostas para a avaliao da viabilidade de ovos de helmintos,
podendo-se destacar as seguintes como as mais utilizadas:
Aspectos Metodolgicos 86
a tcnica da incubao, descrita por HASS et al., (1962) e MEYER et al. (1978), modificada
por CARRINGTON & HARMAN (1981), utilizada para quantificar e determinar a
viabilidade de ovos de helmintos em amostras de lodo de esgoto;
a tcnica de critrios morfolgicos, para a diferenciao entre ovos viveis e no-viveis
(KAGEI, 1982; CEMAT, 1987; REIMERS et al., 1989);
a tcnica de flutuao, com a utilizao de n-butanol para separar os ovos frteis dos infrteis
(STIEN & SCHWARTZBROD, 1988);
a tcnica de incluso ou excluso de corantes biolgicos (SHEPHERD, 1962; KAGEI, 1982;
KANESHIRO & STERN, 1985; ZHOU et al., 1985; GALVN et al., 1998).
Tcnica de incubao
Na prtica atual, para determinar se um ovo verdadeiramente vivel, necessrio observar seu
desenvolvimento embrionrio em condies naturais, por meio das seguintes tcnicas de
incubao:
(a) incubao in vivo, que consiste em inocular, em animais de experimentao, os ovos de
helmintos, esperar o tempo requerido para o desenvolvimento dos embries e depois
sacrificar os animais, ao trmino do ciclo biolgico do parasito, para examinar os rgos
afetados pela presena de larvas;
(b) incubao in vitro, que consiste na inoculao dos ovos em um suporte slido ou lquido e
incubao em condies favorveis, para que os embries se desenvolvam at a etapa
infectiva.
Em ambas as tcnicas, o tempo de resposta demanda, no mnimo, 21 dias (dependendo do ciclo
biolgico das distintas espcies de helmintos), o que significa que no so anlises prticas para
a determinao do risco sade para esgotos tratados aplicados na irrigao. Alm disso, essas
tcnicas de incubao so utilizadas, usualmente, para a determinao de viabilidade de ovos de
helmintos em amostras de fezes ou de lodo, onde estes encontram-se presentes em grandes
quantidades. No caso de esgotos brutos ou tratados, a determinao de viabilidade pelo mtodo
da incubao se torna mais difcil, devido aos seguintes aspectos principais:
necessidade de coleta e processamento de grandes volumes de amostra. Por exemplo, o
mtodo de flutuao com n-butanol (STIEN & SCHWARTZBROD, 1988) utiliza uma
amostra com volume inicial de 25 L e processa, por meio de centrifugao, um volume de
2,5 L;
dificuldade em se obter resultados confiveis (representativos), no caso de amostras que
contenham pequenas quantidades de ovos de helmintos.
Tendo em vista estes aspectos, notadamente a necessidade de coleta e processamento de grandes
volumes de amostra, o Laboratrio de Microbiologia do DESA/UFMG implementou uma
tcnica de incubao adaptada, que possibilita a coleta de amostras de pequeno volume (5 L) e o
processamento, por centrifugao, de um volume de 1,0 L. Ressalta-se, no entanto, que essa
tcnica adaptada deve ser utilizada somente para anlises de viabilidade em amostras que
contenham elevadas quantidades de ovos de helmintos (preferencialmente acima de 100 ovos/L).
A tcnica de incubao adaptada foi testada para amostras de efluente tratado, onde foram
inoculados ovos de Ascaris lumbricoides, retirados de uma fmea adulta. O efluente tratado era
proveniente de um filtro biolgico percolador, sendo que, aps a inoculao dos ovos de Ascaris,
o mesmo foi submetido desinfeco em um foto-reator UV operando com diferentes tempos de
deteno hidrulica. A tcnica apresentou excelentes resultados, possibilitando observar as
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 87
alteraes morfolgicas e os diferentes estgios de desenvolvimento dos ovos de Ascaris, quando
os mesmos foram expostos a diferentes doses de radiao ultra violeta. As Figuras 26 a 31
ilustram alguns dos estgios de desenvolvimento de ovos de Ascaris lumbricoides.
Tcnica de critrios morfolgicos
A tcnica de avaliao de viabilidade pelos critrios morfolgicos, para se distinguir entre ovos
viveis e no-viveis de Ascaris, baseada nas mudanas morfolgicas que aparecem nos ovos
mortos ou no-viveis, conforme a seguir (KAGEI, 1982):
descontinuidade e ruptura da membrana ou do revestimento da casca do ovo;
citoplasma vacuolizado, possivelmente devido degenerao da gordura;
encolhimento por inteiro do ovo ou do ncleo;
citlise.
De acordo com o Centro para Estudos Mesoamericano em Tecnologia Apropriada CEMAT
(1987), os critrios bsicos para a determinao da viabilidade de ovos de Ascaris, com base nas
alteraes morfolgicas, so os apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 - Principais critrios morfolgicos para determinao de
ovos viveis e no viveis de Ascaris
Ovos viveis Ovos no-viveis
Estruturas intactas com coberturas
contnuas e simtricas
Continuao do desenvolvimento do
ovo a estgios mais evoludos, como
clulas duplas, mrula, gstrula e larva
Diferenciao entre cada estgio
indicando uma seqncia de maturao
Estruturas mal definidas
Vacuolizao do citoplasma e
condensao celular
Ovo no estgio unicelular, com
citoplasma granulado e vacuolizado
Contrao, ruptura e perda de
continuidade da membrana
Fonte: CEMAT (1987)
REIMERS et al. (1989) encontraram uma boa correlao entre a avaliao de ovos de Ascaris
usando critrios morfolgicos e o mtodo de incubao, enquanto AYRES (1992), observou que
o mtodo de diferenciao dos ovos viveis e no-viveis pelos critrios morfolgicos no foi
to preciso quanto o mtodo da incubao. O mtodo para identificao dos critrios
morfolgicos no microscpio simples, mas falta um padro objetivo e requer habilidade e
experincia, alm de ser difcil para principiantes. No entanto, de acordo com a experincia do
CEMAT, essa tcnica tem sido utilizada h vrios anos para a identificao de ovos de Ascaris
provenientes de fossas secas (CCERES et al., 1987).
Tcnica da flutuao com n-butanol
O mtodo desenvolvido por STIEN & SCHWARTZBROD (1988) utiliza o n-butanol como
parte do procedimento para separar os ovos frteis dos infrteis. Os ovos frteis possuem
alteraes das estruturas da casca que permitem a esterificao de lipdeos pelo lcool. Dessa
forma, verifica-se o aumento da densidade especfica dos ovos frteis, possibilitando a sua
sedimentao, enquanto os ovos infrteis permanecem em suspenso. Os trabalhos
desenvolvidos em laboratrio demonstraram uma elevada correlao entre ovos viveis e frteis,
Aspectos Metodolgicos 88
demonstrando a aplicabilidade dessa tcnica para a quantificao de ovos viveis de Ascaris. No
entanto, no se sabe se o mesmo procedimento se aplica a outras espcies de ovos de helmintos,
alm do que, o reagente utilizado para flutuao dos ovos (Janeckso-urbanyi, densidade
especfica 1,42), apresentou-se muito corrosivo e caro para ser utilizado com rotina. O n-butanol
no pode ser utilizado em amostras de lodo ou de composto, porque esse absorvido pelo
material slido e torna impossvel a verificao final do material, mesmo se a amostra for
completamente lavada.
Tcnica de incluso ou excluso de corantes biolgicos
Vrios autores relatam o uso de mtodos com corantes biolgicos para a determinao da
viabilidade, embora, no passado, esses no tenham sido considerados suficientemente confiveis
para serem utilizados (WHO, 1967; HINDIYEH, 1995 e CCERES et al., 1987). A
determinao da viabilidade com o uso de corantes foi realizada inicialmente por OGATA
(1923) e BROWN (1927b), e ainda utilizada em pequenos laboratrios, apesar de suas
limitaes. Desde o incio da utilizao desses testes, at os dias de hoje, diversos corantes vm
sendo utilizados, podendo-se destacar os seguintes:
soluo de Sudam III em 75% de lcool (OGATA, 1928 e KAGEI, 1982);
soluo sulfato de azul nilo (MEYER et al., 1978);
azul de metileno eosina borax (ZHOU et al., 1985 e GALVN et al., 1998);
soluo de azul de metileno ou azul de Evans a 0,06% (CEMAT, 1984);
Safranina O, azul de Tripan e Eosina Y (GALVN et al., 1998).
Os estudos mais recentes de utilizao da tcnica de incluso ou excluso de corantes biolgicos
foram realizados por GALVN et al. (1998), objetivando o desenvolvimento de metodologias
simples, rpidas e confiveis para a determinao da viabilidade de ovos de helmintos em
esgotos. Nesse sentido, desenvolveram um mtodo rpido para determinar a viabilidade de ovos
de helmintos, utilizando os corantes Azul Tripan, Eosina Y e Safranina O, em uma concentrao
de 0,1% em soluo aquosa.
Este mtodo baseado no uso de corantes biolgicos para detectar as trocas de permeabilidade
da membrana vitelina dos ovos, que est relacionada com o metabolismo embrionrio e a
viabilidade, sendo que um ovo vivel impermevel a certos corantes e, portanto, no se cora,
enquanto um ovo que tenha perdido sua viabilidade permevel e se cora.
Para a realizao do mtodo da colorao, este foi acoplado a dois procedimentos rpidos,
eficientes e baratos, desenvolvidos pelo Instituto de Engenharia Sanitria e Ambiental da
Universidade Nacional Autnoma do Mxico (UNAM), para a quantificao de ovos de
helmintos em esgotos. Os procedimentos envolvem a concentrao da amostra por centrifugao
(esgoto bruto) e filtrao em membrana (esgoto tratado). Para tornar a amostra mais clara,
utilizada soluo salina (NaCl 0,85%) ou soluo de detergente (0,01%). Para a flutuao dos
ovos de helmintos utilizado sulfato de zinco (densidade 1,20) ou sulfato de magnsio
(densidade 1,30).
O mtodo relativamente simples, mas recomenda-se que seja desenvolvido por tcnicos com
conhecimentos prticos e experincia na identificao de ovos de helmintos. O mesmo demanda
um tempo de 2 a 6 horas para se obter os resultados, alm de apresentar baixo custo, se
comparado com outros mtodos. Isto significa que o procedimento da colorao apresenta
vantagens bastante relevantes. No entanto, algumas limitaes do mtodo so apresentadas a
seguir (ROJAS et al., 1998):
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 89
a deteco da viabilidade ocorre apenas no momento do teste. Ou seja, no possibilita o
monitoramento do embrio, sendo por isso considerado um mtodo que avalia a viabilidade
potencial;
o mtodo eficiente para determinar a viabilidade potencial de ovos de Ascaris e de
Trichuris, havendo, porm, a necessidade de estudos mais aprofundados para possibilitar a
avaliao da eficincia da tcnica da colorao em outras espcies de helmintos.
Descrio da tcnica de incubao adaptada
A tcnica de incubao adaptada foi desenvolvida com o intuito de possibilitar a avaliao de
viabilidade de ovos de helmintos em esgotos brutos e tratados, utilizando-se pequenos volumes
de amostras (5 L), desde que estas apresentem grandes quantidades de ovos de helmintos.
As amostras de esgotos passam pelas seguintes etapas: sedimentao, centrifugaes sucessivas
com soluo salina (NaCl 0,85%), flutuao com soluo de sulfato de zinco (densidade 1,18),
filtrao em membrana de 47 mm e 0,45 m de porosidade e incubao a 28
o
C durante 28 dias.
Aps 28 dias de incubao, a contagem realizada utilizando-se uma cmara de Sedgewick
Rafter, com observao no microscpio dos ovos viveis (com larva) e no viveis.
Equipamentos, materiais e reagentes
Centrfuga para operar a 1.000 g
Equipamento de filtrao para membrana de 47 mm de dimetro (Millipore ou equivalente)
Microscpio com objetivas de 10x, 40x e 100x, com bom poder de resoluo
Equipamento tipo Vortex
Sistema de vcuo
Membranas de ster de celulose de 47 mm de dimetro e porosidade de 0,45 m (Millipore
ou equivalente)
Estufa para operar a 28
o
C
Frascos para centrfuga de 250 mL de capacidade
Tubos para centrfuga de 50 mL de capacidade
Placa de Petri
Garrafes de plstico com tampa de rosca e capacidade de 5 litros
Cmara de Sedgewick Rafter
Soluo salina isotnica (NaCl a 0,85% em gua destilada)
Soluo aquosa de sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H2O) a 33,1% (p/v)
Soluo Triton X-100 ou Tween 80
cido sulfrico 0,1 N
Preparao de solues
So os seguintes os principais procedimentos para a preparao das solues necessrias ao
desenvolvimento das anlises de viabilidade em esgotos brutos:
Soluo salina isotnica (NaCl a 0,85%): pesar 0,85 g de NaCl e diluir em gua destilada at
completar o volume de 100 mL de soluo.
Soluo aquosa de sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H
2
O) a 33,1% (p/v): pesar 33,1 g de
ZnSO
4
.7H
2
O e dissolver em gua destilada at completar o volume de 100 mL de soluo.
Soluo de cido sulfrico 0,1 N: adicionar 2,8 mL de cido sulfrico concentrado em 1.000
mL de gua destilada.
Aspectos Metodolgicos 90
Coleta de amostras
Coletar 5 litros da amostra e proceder anlise preferencialmente logo aps a coleta ou,
eventualmente, em um prazo mximo de 48 horas. Caso no seja possvel a anlise neste perodo
(48 horas), as amostras devero ficar armazenadas, sob refrigerao, por um perodo mximo de
15 dias.
Procedimento
a) Coletar uma amostra de esgoto de volume conhecido (V
i
= 5 litros).
b) Deixar a amostra sedimentar em um balde por um perodo de 24 horas. Remover o sobrenadante
usando uma bomba de suco ou um sifo, garantindo que fique no recipiente um volume de
aproximadamente 1L. Inclinar o recipiente, caso necessrio, tendo o cuidado para no ressuspender o
sedimento.
c) Transferir cuidadosamente o sedimento para os tubos da centrfuga, enxaguando o balde com soluo
Triton X-100 ou Tween 80.
d) Distribuir a amostra em frascos de centrfuga e proceder centrifugao a 1.000 g durante 5 minutos.
e) Descartar o sobrenadante, ressuspender os sedimentos em soluo salina (NaCl a 0,85%).
f) Agitar com o equipamento tipo Vortex.
g) Centrifugar novamente a 1.000 g durante 5 minutos e descartar o sobrenadante; repetir o
procedimento at obter um sobrenadante claro.
h) Aps descartar o sobrenadante da ltima etapa de centrifugao, transferir todo o sedimento restante
para um tubo de centrfuga de 50 mL de capacidade. Utilizar soluo de sulfato de zinco para auxiliar
na lavagem do tubo e transferncia do sedimento.
i) Adicionar mais soluo de sulfato de zinco, at completar o volume de 25 mL, e agitar com Vortex.
Completar novamente com sulfato de zinco at obter o volume final de 50 mL e agitar novamente
com Vortex. Centrifugar a 1.000 g durante trs minutos.
j) Transferir o sobrenadante para o recipiente de filtrao a vcuo e proceder filtrao em membrana
de 47 mm e porosidade de 0,45 m.
k) Ao trmino da filtrao, retirar a membrana e raspar o material retido, com o auxlio de uma lamnula,
para uma placa de Petri contendo 10 mL de cido sulfrico a 0,1 N.
l) Envolver a placa com papel alumnio e coloc-la em uma incubadora a 28
o
C, onde dever
permanecer durante 28 dias. necessrio que se proceda uma aerao da placa em dias alternados.
Quando da aerao, verificar se ocorreu evaporao parcial do volume do contedo da placa de Petri
e completar com cido sulfrico, caso necessrio.
m) Aps 28 dias, retirar uma alquota bem homogeneizada da amostra final, com o auxlio de uma pipeta
de Pasteur, e transferir para a cmara de Sedgewick Rafter. Examinar no microscpio, em objetivas
de 10x ou 40x, e contar os ovos viveis (com larva) e no viveis. Para uma melhor
representatividade dos resultados, deve-se fazer a leitura de mais de uma cmara, preferencialmente
trs, e calcular a mdia aritmtica das contagens obtidas.
Nota: antes de retirar as alquotas do contedo da placa, para contagem na cmara de Sedgwick
Rafter, medir o volume total do contedo da placa (V
f
).
Expresso dos resultados
O nmero final de ovos viveis e no viveis da amostra de esgotos pode ser calculado por meio
da seguinte equao:
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 91
( )
( )
v i
f c
V V
V N
N

=
na qual:
N: nmero de ovos (ovos/litro)
N
c
: nmero mdio de ovos contados nas cmaras de Sedgewick Rafter (n
o
de ovos)
V
f
: volume do contedo final da placa de Petri (mL)
V
c
: volume da cmara de Sedgewick Rafter (1 mL)
V
i
: volume original da amostra (ver procedimento "a")
Aspectos Metodolgicos 92
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos
Alguns dos procedimentos para preparao da amostra e anlise de viabilidade de ovos de
helmintos so ilustrados nas Figuras 16 a 25.
Fig. 16 - Remoo do sobrenadante aps
o perodo de sedimentao
(procedimentos a e "b")
Fig. 17 Concentrao da amostra
por centrifugao
(procedimentos d e g)
Fig. 18 Adio de Cloreto de Sdio para
clareamento da amostra
(procedimento e)
Fig. 19 - Homogeneizao da amostra
com Vortex
(procedimento f)
Fig. 20 Filtrao do sobrenadante
(procedimento j )
Fig. 21 Membrana de 47 mm e 0,45 de
porosidade contendo os ovos
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 93
Fig. 22 Raspagem do material retido e
transferncia para a placa de Petri
(procedimento k)
Fig. 23 Placas envolvidas em papel
alumnio e incubadas a 28
o
C, durante 28
dias (procedimento l)
Fig. 24 Transferncia do material da
placa de Petri para cmara de Sedgewick
Rafter (procedimento m)
Fig. 25 Observao dos ovos no
microscpio, com objetivas de 10x e 40x
Aspectos Metodolgicos 94
Ilustrao fotogrfica do desenvolvimento de ovos de Ascaris lumbricoides
Alguns estgios de desenvolvimento de ovos de A. lumbricoides so ilustrados nas Fig. 26 a 31.
Fig. 26 Estgio de uma clula
(a)
Fig. 27 Estgio de mrula precoce
(b)
Fig. 28 Estgio de mrula tardia
(c)
Fig. 29 Estgio de gstrula
(d)
Fig. 30 Estgio de larva
(e)
Fig. 31 Ecloso da larva
(a) Estgio de uma clula: esse estgio facilmente reconhecido por uma nica clula grande, ocupando a maior
parte do ovo.
(b) Estgio de mrula precoce: o embrio, dentro do ovo, se divide em 2 a 16 clulas.
(c) Estgio de mrula tardia: ocorre uma rpida clivagem, onde os blastmeros no so claramente definidos e o
embrio denominado blstula, uma esfera compacta de pequenas clulas. A blstula marca o trmino da
proliferao e o incio da morfognese.
(d) Estgio de gstrula: mrula encurvada ao estgio vermiforme precoce, onde o embrio alonga-se e curva-se,
ventralmente, assumindo a forma de um gro de feijo, com a extremidade anterior ligeiramente maior e
normalmente mais escura que a extremidade posterior.
(e) Estgio de larva: a partir do estgio inicial vermiforme, at o de larva completamente formada, a larva comea a
alongar-se e mover-se. A larva completamente formada mais estreita e mais transparente que a larva imatura e
pode mover-se livremente no interior do ovo. As extremidades anterior e posterior so distintas. Nesse estgio,
a larva completamente diferenciada morfologicamente, permanecendo nesse estgio at receber estmulo
adequado para eclodir.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 95
Descrio da tcnica de incluso ou excluso de corantes biolgicos
O mtodo da colorao fundamenta-se nas trocas de permeabilidade da camada externa dos
ovos, provocadas pelas modificaes das estruturas qumicas dos componentes que envolvem o
ovo, quando este perde sua viabilidade. Os ovos que so viveis no permitem a entrada do
corante, permanecendo, portanto, com a sua cor natural (castanho-amarelada). J os ovos no-
viveis permitem a entrada do corante e, portanto, se coram de acordo com o corante utilizado
(MEYER et al., 1978 e ZHOU et al., 1985, citados por GALVN et al., 1998).
Aplicao para esgotos brutos (tcnica da concentrao por centrifugao)
Esta tcnica aplicada a esgotos brutos que contenham slidos suspensos ou turbidez, com
possveis ocorrncias de grandes quantidades de ovos de helmintos. A tcnica tambm aplicada
a anlises de sedimentos.
A tcnica consiste em centrifugaes sucessivas da amostra com soluo salina isotnica,
permitindo, assim, o clareamento do sobrenadante. Aps o descarte do sobrenadante, os ovos que
se encontram no sedimento so recuperados, por flutuao, com soluo de sulfato de zinco a
33,1%, e o sobrenadante filtrado em membrana de 25 mm e 8 m de porosidade.
A contagem realizada por observao microscpica da lmina contendo a membrana tingida
com o corante biolgico.
Equipamentos, materiais e reagentes
Centrfuga para operar a 1.000 g
Equipamento de filtrao para membrana de 25 mm de dimetro (Millipore ou equivalente)
Microscpio com objetivas de 10x, 40x e 100x, com bom poder de resoluo
Equipamento tipo Vortex
Membranas de ster de celulose de 25 mm de dimetro e porosidade de 8 m (Millipore ou
equivalente)
Frascos para centrfuga de 250 mL de capacidade
Tubos para centrfuga de 50 mL de capacidade
Garrafes de plstico com tampa de rosca e capacidade de 5 litros
Lminas e lamnulas
Soluo salina isotnica (NaCl a 0,85% em gua destilada)
Soluo aquosa de 0,1% (p/v) de um dos seguintes corantes biolgicos: Azul de Tripan,
Safranina O, Eosina Y
Soluo aquosa de sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H2O) a 33,1% (p/v)
Glicerol
Preparao de solues
So os seguintes os principais procedimentos para a preparao das solues necessrias ao
desenvolvimento das anlises de viabilidade em esgotos brutos:
Soluo salina isotnica (NaCl a 0,85%): pesar 0,85 g de NaCl e diluir em gua destilada at
completar o volume de 100 mL de soluo.
Soluo aquosa de 0,1% (p/v) de safranina O: pesar 0,1 g do corante safranina e dissolver em
gua destilada at completar o volume de 100 mL de soluo.
Soluo aquosa de sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H
2
O) a 33,1% (p/v): pesar 33,1 g de
ZnSO
4
.7H
2
O e dissolver em gua destilada at completar o volume de 100 mL de soluo.
Aspectos Metodolgicos 96
Coleta de amostras
Coletar 5 litros da amostra no ponto em que se encontra mais homognea (representativa). Caso
o lquido amostrado esteja parado ou com pouco movimento, coletar tambm o sedimento e
process-lo pelo mesmo mtodo.
Tampar os recipientes e transport-los ao laboratrio, se possvel preservados com gelo. As
amostras devero ser analisadas preferencialmente logo aps a coleta ou, eventualmente, em um
prazo mximo de 48 horas. Caso no seja possvel a anlise neste perodo (48 horas), as amostras
devero ficar armazenadas sob refrigerao por um perodo mximo de 15 dias.
Procedimento
Para amostras contendo grandes quantidades de detritos/slidos grosseiros, homogeneizar a
mesma com um basto de vidro e filtrar atravs de uma gaze. Lavar perfeitamente os slidos que
ficarem aderidos gaze, e processar 1 litro da amostra de acordo com os seguintes passos:
a) Distribuir a amostra em frascos de centrfuga e proceder a centrifugao a 1.000 g durante 5
minutos; descartar o sobrenadante, ressuspender os sedimentos em soluo salina isotnica e
agitar com o equipamento tipo Vortex. Transferir o sedimento para um ou dois tubos de
centrfuga. Centrifugar novamente a 1.000 g durante 5 minutos e descartar o sobrenadante;
repetir o procedimento at obter um sobrenadante claro (geralmente, so necessrias de duas
a trs centrifugaes).
b) Aps descartar o sobrenadante da ltima etapa de centrifugao, transferir todo o sedimento
restante para um tubo de centrfuga de 50 mL de capacidade. Utilizar soluo de sulfato de
zinco para auxiliar na lavagem do tubo e transferncia do sedimento.
c) Adicionar mais soluo de sulfato de zinco at completar o volume de 25 mL e agitar com
Vortex. Completar novamente com sulfato de zinco at obter o volume final de 50 mL e
agitar novamente com Vortex. Centrifugar a 1.000 g durante trs minutos.
d) Transferir o sobrenadante para o recipiente de filtrao a vcuo e proceder filtrao em
membrana de 25 mm e porosidade de 8 m.
Nota: Tendo em vista a eventual dificuldade de filtrao (devido porosidade, ao tamanho da
membrana e ao teor de slidos presentes na amostra, pode-se tornar necessria a filtrao de
alquotas menores, utilizando-se vrias membranas).
e) Ao trmino da filtrao, adicionar 5 mL do corante selecionado e filtrar lentamente. Retirar a
membrana e coloc-la sobre um papel filtro para perder o excesso de umidade (no mximo
por dois minutos).
f) Colocar uma gota de glicerol na lmina e espalhar sobre uma rea correspondente ao
tamanho da membrana (aproximadamente 25 mm de dimetro). Colocar a membrana, com
cuidado, sobre o glicerol, para que no apaream bolhas de ar. Adicionar outra gota de
glicerol sobre a membrana, colocar a lamnula e esperar at que a visualizao dos ovos se
torne possvel. Caso se deseje acelerar este processo, deve-se colocar a lmina na incubadora
a 37
0
C.
g) Observar no microscpio, usando objetivas de 10x e 40x de aumento. Se desejar um maior
aumento, observar com objetiva de 100x, aplicando uma gota de leo de imerso.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 97
Expresso dos resultados
Para cada lmina, contar o nmero de ovos corados (ovos no-viveis) e no corados (ovos
viveis) e expressar o percentual de ovos viveis, por litro de amostra.
Nmero de ovos
(N
o
/L)
Percentual de ovos no
corados (viveis) Lmina
(a)
Corados (1) No corados (2) Total (3) (2)/(3)
1 -
2 -
3 -
Total
Mdia
Notas:
a) O nmero de lminas pode ser bastante varivel, dependendo das caractersticas de filtrabilidade do
esgoto.
b) Os resultados obtidos por meio da tcnica de colorao devem ser usados apenas para expressar a
frao de ovos viveis e no-viveis. Para a quantificao de ovos de helmintos, deve-se utilizar o
mtodo de Bailenger modificado.
c) Para se saber o nmero de ovos viveis na amostra processada, deve-se aplicar o percentual de ovos
viveis (obtido pela tcnica da colorao) sobre o nmero total de ovos da amostra (obtido pelo
mtodo de Bailenger modificado).
Aspectos Metodolgicos 98
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos
Alguns dos procedimentos para preparao das amostras, visando a anlise/quantificao de
ovos de helmintos viveis, em esgoto bruto, so ilustrados nas Figuras 32 a 37.
Fig. 32 Concentrao da amostra por
centrifugao
(procedimento a)
Fig. 33 Homogeneizao da amostra
com Vortex
(procedimentos a e c)
Fig. 34 Nova centrifugao
(procedimentos a e c)
Fig. 35 Filtrao do sobrenadante em
membrana de 25 mm e 8 m
(procedimento d)
Fig. 36 Adio de 5 mL do corante
safranina
(procedimento e)
Fig. 37 Lmina contendo a membrana
para visualizao no microscpio
(procedimento f)
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 99
Aplicao para esgotos tratados (tcnica da concentrao por filtrao)
Esta tcnica foi desenvolvida e validada originalmente para ser aplicada em guas naturais e de
abastecimento, entretanto foi comprovado que pode ser aplicada tambm para esgotos tratados,
que contenham pouca turbidez e slidos suspensos, e baixas concentraes de ovos de helmintos.
A tcnica baseada na concentrao da amostra por filtrao a vcuo, atravs de uma membrana
de ster de celulose de 47 mm, com porosidade de 8 m. Os ovos aderidos membrana so
recuperados, por flutuao, com soluo de sulfato de zinco a 33,1%, e a contagem realizada
por observao microscpica direta da membrana tingida com o corante biolgico.
Equipamentos, materiais e reagentes
Equipamento de filtrao para membrana de 47 mm de dimetro
Equipamento de filtrao para membrana de 25 mm de dimetro
Sistema de vcuo (para operar at 40 cm Hg)
Centrfuga para operar a 1.000 g
Microscpio com objetivas de 10x, 40x e 100x, com um bom poder de resoluo
Membranas de ster de celulose de 47 mm de dimetro e 8 m de porosidade (Millipore ou
equivalente)
Membranas de ster de celulose de 25 mm de dimetro e 8 m de porosidade (Millipore ou
equivalente)
Tubos para centrfuga de 50 mL de capacidade
Garrafes de plstico com tampa de rosca e capacidade de 5 e 10 litros
Lminas e lamnulas
Soluo salina isotnica (NaCl a 0,85% em gua destilada)
Soluo aquosa a 0,1% (p/v) de um dos seguintes corantes biolgicos: Azul de Tripan,
Safranina O, Eosina Y
Soluo aquosa de sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H
2
O) a 33,1% (p/v)
Glicerol
Preparao de solues
So os seguintes os principais procedimentos para a preparao das solues necessrias ao
desenvolvimento das anlises de viabilidade em efluentes tratados:
Soluo salina isotnica (NaCl a 0,85%): pesar 0,85 g de NaCl e diluir em gua destilada at
completar o volume de 100 mL de soluo.
Soluo aquosa de 0,1% (p/v) de safranina O: pesar 0,1 g do corante safranina e dissolver em
gua destilada at completar o volume de 100 mL de soluo.
Soluo aquosa de sulfato de zinco (ZnSO
4
.7H
2
O) a 33,1% (p/v): pesar 33,1 g de
ZnSO
4
.7H
2
O e dissolver em gua destilada at completar o volume de 100 mL de soluo.
Coleta de amostras
Para fontes de abastecimento pblico, poos, mananciais e guas com baixos teores de turbidez e
slidos suspensos, coletar uma amostra com volume de 10 litros. Para esgotos tratados, coletar
uma amostra com volume de 5 litros.
Tampar os recipientes e transport-los ao laboratrio, se possvel preservados com gelo. As
amostras devero ser analisadas preferencialmente logo aps a coleta ou, eventualmente, em um
prazo mximo de 48 horas. Caso no seja possvel a anlise neste perodo (48 horas), as amostras
devero ficar armazenadas sob refrigerao por um perodo mximo de 15 dias.
Aspectos Metodolgicos 100
Procedimento
Para amostras contendo grandes quantidades de detritos/slidos grosseiros, misturar a mesma
com um basto de vidro e filtrar atravs de uma gaze. Lavar perfeitamente os slidos que ficarem
aderidos gaze e processar 1 litro da amostra de acordo com os seguintes passos:
Nota: Para os casos de amostras que contenham teores elevados de slidos, pode-se tornar necessrio
centrifugar a mesma algumas vezes, com soluo salina e com descartes sucessivos do sobrenadante.
Nesses casos, deve-se eliminar os procedimentos (a) e (b) e iniciar pelo (c).
a) Homogeneizar a amostra e filtrar 1 litro em membrana de 47 mm de dimetro e porosidade
de 8 m, aplicando um vcuo mximo de 40 cm de Hg. Ao trmino da filtrao, lavar as
paredes dos recipientes de filtrao com soluo salina isotnica e filtrar essa gua de
lavagem na mesma membrana.
b) Aps a filtrao, retirar a membrana e coloc-la sobre a parede interna de um tubo de
centrfuga e raspar com uma esptula; lavar a membrana e a esptula com soluo de sulfato
de zinco.
c) Adicionar sulfato de zinco gradativamente (agitando perfeitamente em cada adio) at
completar o volume de 50 mL. Centrifugar a 1.000 g durante trs minutos.
d) Transferir o sobrenadante para o recipiente de filtrao, com uma membrana de 25 mm de
dimetro e 8 m de porosidade. Filtrar aplicando pouca presso.
e) Ao trmino da filtrao, adicionar 5 mL do corante selecionado e filtrar lentamente. Retirar a
membrana e coloc-la sobre um papel filtro para perder o excesso de umidade (no mximo
por dois minutos).
h) Colocar uma gota de glicerol na lmina e espalhar sobre uma rea correspondente ao
tamanho da membrana (aproximadamente 25 mm de dimetro). Colocar a membrana, com
cuidado, sobre o glicerol, para que no apaream bolhas de ar. Adicionar outra gota de
glicerol sobre a membrana, colocar a lamnula e esperar at que a visualizao dos ovos se
torne possvel. Caso se deseje acelerar este processo, deve-se colocar a lmina na incubadora
a 37
0
C.
i) Observar no microscpio, usando objetivas de 10x e 40x de aumento. Se desejar um maior
aumento, observar com objetiva de 100x, aplicando uma gota de leo de imerso.
Expresso dos resultados
Para cada lmina, contar o nmero de ovos corados (ovos no-viveis) e no corados (ovos
viveis) e expressar o percentual de ovos viveis, por litro de amostra.
Nmero de ovos
(N
o
/L)
Percentual de ovos no
corados (viveis) Lmina
(a)
Corados (1) No corados (2) Total (3) (2)/(3)
1 -
2 -
3 -
Total
Mdia
Notas:
a) O nmero de lminas pode ser bastante varivel, dependendo das caractersticas de filtrabilidade do
esgoto.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 101
b) Os resultados obtidos por meio da tcnica de colorao devem ser usados apenas para expressar a
frao de ovos viveis e no-viveis. Para a quantificao de ovos de helmintos, deve-se utilizar o
mtodo de Bailenger modificado.
c) Para se saber o nmero de ovos viveis na amostra processada, deve-se aplicar o percentual de
ovos viveis (obtido pela tcnica da colorao) sobre o nmero total de ovos da amostra (obtido pelo
mtodo de Bailenger modificado).
Aspectos Metodolgicos 102
Ilustrao fotogrfica dos procedimentos
Alguns dos procedimentos para preparao das amostras, visando a anlise/quantificao de
ovos de helmintos viveis, em esgoto tratado, so ilustrados nas Figuras 38 a 43.
Fig. 38 Filtrao de 1 L da amostra em
membrana de 47 mm e 8 m.
(procedimento a)
Fig. 39 Membrana contendo material
filtrado (ovos)
Fig. 40 Transferncia do material (ovos)
para o tubo da centrfuga
(procedimento b )
Fig. 41 Filtrao do sobrenadante em
membrana de 25 mm e 8 m
(procedimento d )
Fig. 42 Adio de 5 mL do corante
safranina, seguida de filtrao
(procedimento e )
Fig. 43 Lmina contendo a membrana
para visualizao no microscpio
(procedimento f ).
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 103
Ilustrao fotogrfica de ovos de helmintos pela tcnica da colorao
Ilustraes de ovos viveis e no-viveis, identificados de acordo com a tcnica da colorao,
so apresentados nas Figuras 44 a 47 (Fonte: ROJAS et al., 1998).
Fig. 44 Ovo vivel de Trichuris trichiura
corado com Azul de Tripan
Fig. 45 Ovo no vivel de Trichuris trichiura
corado com Azul de Tripan
Fig. 46 Ovo vivel de Ascaris lumbricoides
corado com Azul de Tripan
Fig. 47 Ovo no-vivel de Ascaris lumbricoides
corado com Eosina Y
Aspectos Metodolgicos 104
CONCLUSES
Metodologia de quantificao e identificao de ovos de helmintos
A partir de estudos e pesquisas desenvolvidos no mbito do PROSAB, onde foi utilizado o
mtodo de Bailenger modificado para quantificao e identificao de ovos de helmintos em
esgotos brutos e tratados, foi possvel concluir:
O mtodo de Bailenger modificado mostrou-se adequado para a quantificao e identificao
de ovos de helmintos em esgotos brutos e tratados. O mtodo simples, utiliza equipamentos
e material de baixo custo e demanda poucos reagentes qumicos. O tempo requerido para a
leitura final relativamente rpido, dependendo das caractersticas do esgoto.
Foi possvel a recuperao de vrias espcies de ovos de helmintos usualmente encontrados
em esgotos brutos e tratados, a exemplo de ovos de Ascaris lumbricoides, Trichuris
trichiura, ancilostomdeos, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Enterobius
vermicularis.
De acordo com a experincia na utilizao do mtodo, e com o nmero muito grande de
anlises processadas no decorrer desse trabalho, foi adotado um tempo de 24 horas para a
etapa de sedimentao de amostras brutas e tratadas (ao invs do tempo de 1 a 2 h,
usualmente empregado), o que resultou em uma melhora sensvel da recuperao de ovos.
KNIG (2000) investigando o tempo de sedimentao como fator determinante da
concentrao final de ovos de helmintos (Ascaris) em esgoto bruto, observou claramente a
influncia do tempo de sedimentao sobre a concentrao final de ovos de helmintos. Esses
resultados preliminares sugerem a introduo desta modificao (incremento no tempo de
sedimentao) no protocolo de rotina do mtodo, visando a obteno de maiores taxas de
recuperao.
Em algumas amostras de efluentes de reatores anaerbios, o sobrenadante resultante do
processamento da amostra apresentou-se muito escuro, dificultando a leitura na cmara de
McMaster. A cor escura pareceu estar mais relacionada com a rotina operacional do reator
anaerbio e com a qualidade do efluente do mesmo, do que com o mtodo utilizado.
Metodologias de viabilidade de ovos de helmintos
A partir de estudos e pesquisas desenvolvidos no mbito do PROSAB, onde foram testadas as
tcnicas de incubao adaptada e de corantes biolgicos para a avaliao de viabilidade de ovos
de helmintos em esgotos brutos e tratados, foi possvel concluir:
A tcnica de incubao adaptada se mostrou muito favorvel para a avaliao de viabilidade
de ovos de Ascaris lumbricoides, em esgotos com elevadas concentraes de ovos de
helmintos e baixos teores de slidos suspensos. A tcnica possibilitou a identificao de
todos os estgios de desenvolvimento de ovos de Ascaris lumbricoides.
O mtodo da colorao possibilitou a observao tanto de ovos viveis (no corados), quanto
de ovos no viveis (corados). No entanto, algumas incertezas relativamente cor dos ovos
expostos ao corante indicam que o mtodo se apresenta, em alguns momentos, muito
subjetivo, onde realmente no h um padro de cor tanto para os ovos viveis e quanto dos
no viveis.
As tcnicas de concentrao por filtrao e por centrifugao podem ser aplicadas para vrios
tipos de amostras (esgotos brutos e tratados). A tcnica de concentrao por centrifugao
apresenta menores custos iniciais de equipamento e pode ser aplicada para efluentes tratados.
Ps-tratamento de efluentes de reatores anaerbios 105
Porm, um volume maior de amostra deve ser processado para se obter um volume adequado
de sedimento para a recuperao dos ovos (por exemplo 5 L).
Para amostras com turbidez elevada, a tcnica de concentrao por filtrao no a mais
adequada, devido ao entupimento dos filtros e necessidade de constantes trocas dos
mesmos, conferindo, assim, um aumento do tempo e dos custos para as anlises. Essa uma
forte desvantagem da tcnica, mas a eficincia de recuperao bem maior do que a tcnica
de concentrao por centrifugao.
Foram observadas interferncias com a utilizao da tcnica da colorao para o efluente de
reatores anaerbios, possivelmente, devido presena de cidos orgnicos.
As amostras com elevados teores de slidos apresentaram, geralmente, uma cor mais intensa,
aps a filtrao com o corante, interferindo, por vezes, na observao. Nesse sentido, o uso
de um menor volume de corante (ex. 1 mL) pode minimizar esse problema.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem FINEP, ao CNPq, aos bolsistas Eduardo Sales Marchado Borges,
Reginaldo Vieira de Souza, Roseli Bernardo Bittencourt, Srgio Ferreira Ribeiro e Valria
Martins Godinho, e ao pesquisador Cristiano Lara Massara, pelo apoio na realizao desse
trabalho.
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