Anda di halaman 1dari 12

INSTRUMENTASI

LAPORAN PRAKTIKUM SDS-PAGE



TUGAS LAPORAN










Oleh:
David Christianto
136070100011013



PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014





1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah
teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan
protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja. Sodium Dodesil
Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik
yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja
SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan
hidrogen. Metode SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein demi
keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler (Davis et al., 1994).
1.2. Tujuan
1. Mengetahui proses dan teknik pelaksanaan SDS PAGE.
2. Mampu menjelaskan prinsip kerja teknik SDS PAGE.
3. Mampu menghitung berat molekul protein.
2. TINJAUAN PUSTAKA
Protein-protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul. SDS-PAGE
(sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis) adalah teknik
elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium.
Sampel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang
merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu
bermuatan negatif dan protein yang lebih besar menpunyai muatan negatif yang
lebih besar.. Kompleks protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke
arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas
gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide menentukan ukuran pori-pori gel
dan ukuran pori-pori gel menentukan jarak yang ditempuh oleh kompleks protein-
SDS. Jadi berapa faktor harus ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan
protein-protein melalui teknik SDS-PAGE (antara lain: kadar SDS, konsentrasi
gel akrilamide dan ukuran gelnya, kemurnian sampel protein dan jumlah sampel
yang diletakkan pada gel; voltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan
selama medan listrik dihidupkan) (Anam et al., 2009).
Polyacrylamide gel electrophoresis atau disingkat PAGE ini merupakan
suatu kemungkinan dari teknik analisis yang digunakan untuk separasi dan
karakterisasi protein yang banyak digunakan. Solution dari acrylamide dan
bisacrylamide merupakan polymerisasi. Bisacrylamide dimasukkan secara
crosslinks diantara rantai polyacrilamide. Ukuran porinya ditentukan berdasarkan
rasio dari acrilamide untuk bisacrylamid, dan oleh konsentrasi acrilamid. Tinggi
rasio dari bisacrilamid pada acrilamid dan tinggi konsentrasi acrilamid
menyebabkan mobilitas elektroforesis menjadi pelan. Polimerisasi dari akrilamid
dan monomer bisakrilamid merupakan induksi oleh ammonium persulfat (APS)
(Williams, 2001). SDS ini merupakan detergen yang ampipatik yang berikatan
nonkovalen dengan protein, dengan stoikiometri dari sekitar satu molekul SDS
tiap dua asam amino. SDS ini menyebabkan protein terdenaturasi dan
disassociate, dengan keberadaan SDS, muatan dari protein tersembunyi.
Selama SDS PAGE berlangsung, seluruh protein bergerak menuju anoda yang
bermuatan positif (Williams et al., 2001).
3. MATERI DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Jumat, 14 Maret 2014 di Laboratorium Biomedik pukul 15.00-17.00 WIB.


3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Persiapan Gel
Alat : Gel caster
Kaca
Penjepit kaca
Bahan :
Separating gel 12%, yang mengandung (per slap) :
Acrylamide 30% 4ml
1,5 M Tris-HCl pH 8,8
H2O 3,4ml
SDS 10% 0,1ml
APS 10% 50l
TEMED 5l
Stacking gel 4%, yang mengandung (per slap) :
Acrylamide 30% 1,3ml
1 M Tris-HCl pH 6,8
H2O 6,1ml
SDS 10% 0,1ml
APS 10% 50l
TEMED 10l
3.2.2 Persiapan Sampel
Alat : Appendorf 1,5 ml
Bahan :
Sampel protein
Tracking dye / RSB :
Tris HCl pH 6,8 1 ml
Gliserol 0,8 ml
SDS 10% 1,6 ml
mercaptoetanol 0,4 ml
bromophenol blue 1% 0,2 ml
Aquades 4 ml
3.2.3 Elektroforesis Gel
Alat : Alat elektroforesis yang memberikan tegangan listrik 120V
Bahan
Running Buffer (1000 ml) :
Glicyne 14,2 gr
Tris Base 3,03 gr
Aquades steril 1000 ml
SDS 1 gr
3.2.4 Staining dengan Coomasie Briliant Blue
Alat : 1 buah wadah plastik bertutup ukuran 10x10x10 cm
Bahan
Staining Solution (100 ml) :
Coomassie Briliant Blue R250 0,1 gr
Methanol 40 cc
As. Ac. Glacial 10 cc
Aquades 100 cc
3.2.5 Destaining
Alat : 1 buah wadah plastic bertutup ukuran 10x10x10 cm
Bahan
Destaining Solution (100 ml) :
Methanol 20 cc
As. Ac. Glacial 10 cc
Aquades 100 cc
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Persiapan Gel
1. Alat dan bahan pembuatan gel disiapkan. Kaca dipasang pada
penjepitnya.
2. Campuran bahan separating gel disiapkan sesuai dengan resep dan
konsentrasinya.
3. Campuran separating gel dihomogenkan dengan cepat agar tidak segera
mengeras.
4. Campuran separating gel dimasukkan pada gel caster dengan bantuan
pipet, diikuti dengan pemberian aquades agar permukaan gel rata dan
oksigen tidak ada.
5. Ruang disisakan untuk stacking gel.
6. Setelah separating gel mengeras, sisa aquades dibuang.
7. Campuran stacking gel disiapkan.
8. Campuran stacking gel dihomogenkan dengan cepat.
9. Campuran stacking gel dituang di atas separating gel dan sisir (comb)
segera dipasang diatas stacking gel.
10. Gel dibiarkan hingga mengeras.
11. Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari penjepitnya.
12. Gel pada kaca dipasang pada alat elektroforesis dan running buffer
dituang.
3.3.2 Persiapan Sampel
Prosedur
1. Sampel protein dan tracking dye (RSB) disiapkan.
2. 20 l sampel protein dan 20 l tracking dye (RSB) dicampur, dimasukkan
dalam eppendorf.
3. Sampel direbus pada suhu 100C selama 5 menit.
4. Sampel didinginkan pada suhu ruangan.
3.3.3 Elektroforesis Gel
Prosedur
1. Sampel protein dimasukkan ke dalam gel melalui ujung atas stacking gel
sebanyak 2 l / sumur.
2. Power supply dinyalakan.
3. Sampel diproses atau running dengan memberikan tegangan listrik
sebesar 120 V selama 60-90 menit.
4. Gel dilepas dari kacanya.
3.3.4 Staining dengan Chromasie Briliant Blue
Prosedur
1. Gel direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue R - 250.
2. Rendaman gel dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue R 250
diletakkan di dalam shaker selama 20 - 30 menit.



3.3.5 Destaining
Prosedur
1. Pewarna pada gel dihilangkan dalam rendaman destain solution 1 2 jam
sambil tetap di shaker.
2. Lakukan destaining semalam di atas shaker sampai gel kelihatan bersih.
3. Gel siap discan dan dianalisa hasilnya.
4. Hitung BM protein pada band protein yang tampak pada gel menggunakan
grafik regresi linear.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 HASIL
Setelah gel distaining dan discan, didapatkan band protein yang
terbentuk pada tiap sumuran.

Perhitungan berat molekul (BM) dari protein didasarkan pada marker
yang tersedia. Perhitungan dilakukan dengan mengukur total jarak tracking
dari stacking gel ke separating gel, dilanjutkan dengan mengukur jarak
tracking dari stacking gel ke masing masing band protein yang terbentuk,
kemudian dari BM masing masing band marker di log kan, kemudian dicari
retardation factor (RF) dengan membagi jarak tracking masing masing
band dengan jarak tracking total. Setelah itu dibuat kurva marker log BM
sebagai axis (x) dan RF sebagai ordinat (y).
BM log BM trackking RF
40 1.602059991 28 0.451613
35 1.544068044 33 0.532258
x #VALUE! 29 0.467742
note :
BM Berat Molekul
Tracking batas stacking sampai protein berhenti
RF tracking/panjang lintasan (relative migration distance)
x BM sampel protein (10^log BM sampel)
panjang lintasan = 62 mm

= ( (( ))/(( )) x
(log BM besar-log BM kecil))+log BM kecil
Log BM sampel = 1.590461602
BM sampel = 38.94589 kDa
4.2 PEMBAHASAN
Pada elektroforesis vertical ini digunakan metode SDS PAGE dengan
gel berbahan dasar polikrilamida karena sampel yang digunakan adalah
sampel protein. Pemilihan komposisi stacking gel dan separating gel
didasarkan pada berat molekul protein yang akan di running, bila sampel
protein yang akan di running belum diketahui berat molekulnya, maka
digunakan gel dengan komposisi 12% terlebih dahulu, jika kemudian saat
running terjadi loss protein, maka komposisi gel dinaikkan menjadi 25% dan
seterusnya.
Komposisi gel berpengaruh terhadap hasil running sampel protein. Gel
berperan sebagai pori atau saringan yang akan menyaring protein
berdasarkan ukuran molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan turun
terlebih dahulu dengan cepat menuju ke dasar gel dan protein dengan berat
molekul besar akan tertahan di gel bagian atas. Jika komposisi gel yang
digunakan tidak sesuai, jika komposisi gel terlalu kecil maka pori dari gel
menjadi longgar sehingga protein dengan berat molekul kecil akan terus
turun, sedangkan jika komposisi gel terlalu besar maka pori dari gel menjadi
rapat sehingg protein dengan berat molekul besar akan tertahan di atas.
Penggunaan RSB sebagai tracking dye berfungsi untuk menandai
protein yang tersangkut di pori gel sebagai band. Pemanasan protein
dilakukan sebelum pemberian RSB dengan tujuan untuk melepaskan ikatan
protein yang rumit menjadi sebuah ikatan sederhana yang akan lebih mudah
untuk dilakukan proses running elektroforesis. Pemanasan dilakukan selama
5 menit di air mendidih dan tidak lebih dari 7 menit karena akan
menyebabkan denaturasi protein.
Aliran listrik yang digunakan sebesar 90 120 V berfungsi untuk
memberi muatan pada protein untuk bergerak melewati pori gel dan
bergerak dari atas ke bawah gel sesuai dengan berat molekul sampel protein
tersebut. Protein dengan berat molekul kecil akan bergerak terlebih dahulu
dengan cepat melewati pori sampai batas di mana pori tidak cukup besar
untuk melewati pori gel. Batas tersebut lah yang terlihat sebagai band pada
gel. Aliran muatan listrik mengalir ke protein lewat running buffer yang
diisikan pada kit elektroforesis yang berisi gel yang di running. Setelah itu
dilakukan staining dengan menggunakan Coomasie Brilliant Blue dalam
waterbath agar band yang timbul tampak jelas. Setelah itu dilakukan
destaining agar band dapat diamati.
Berat molekul protein diidentifikasi dengan menentukan kurva baku dari
marker protein dengan menggunakan Log dari berat molekul dan RF (hasil
bagi tracking band dan tracking total). Setelah diketahui persamaan dari
kurva baku, maka persamaan tersebut dapat digunakan untuk menghitung
berat molekul dari sampel protein yang kita running.

DAFTAR PUSTAKA
1. Davis L,et al. 1994. Basic Methods: Molecular Biology. Jilid 2.
Norwola:Appletn&Lange. Page 68
2. Williams. 2001. SDS PAGE Gel Elektrophoresis. http://web. chemistry
.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/pa
ge_protein.html.
3. Anam, Khairul. 2009. SDS PAGE dengan Silver Staining dan Zimogram.
Bioteknologi Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.