Anda di halaman 1dari 3

PEMBAHASAN

Pada percobaan ini dilakukan fraksinasi dari rotein yang ada pada telur berdasarkan berat
molekulnya. Metode yang digunakan adalah fraksinasi berdasarkan kelarutan dilanjutkan dengan
metode SDS-Page. Penambahan amonium sufat ke dalam putih telur awalnya mengurangi
kekentalan dari telur, kemudian ketika ditambahkan lagi dengan jumlah tertentu, terjadi koagulasi
berupa endapan berwarna putih. Hal ini menunjukkan bahwa ketika amonium sulfat ditambahkan
dalam jumlah yang relatif sedikit, terjadi salting out, kelarutan dari pelarut yang ada pada putih telur
meningkat sehingga kekentalannya berkurang, menunjukkan interakasi antara zat terlarut (protein)
dan pelarut cukup homogen. Kemudian ketika amonium sulfat ditambahkan semakin banyak terjadi
penggumpalan, ini menunjukkan terjadinya proses salting out di mana kelarutan protein berkurang
karena terjadinya kompetisi antara protein dengan ion amonium dalam proses pelarutan oleh air,
sehingga air yang melarutkan atau mengililingi protein terhalang oleh amonium.
Kemudian dilakukan proses sentrifugasi, tahap ini bertujuan untuk memisahkan endapan protein
yang cenderung mempunyai rapat massa yang lebih besar dibandingkan pelarut murni sehingga
endapan protein terkumpul di bawah tabung reaksi. Proses sentrifugasi ini didasari oleh prinsip gaya
gravitasi yang dipengaruhi oleh massa suatu materi. Penambahan buffer pH 5 adalah agar
melindungi protein dari proses denaturasi yang bisa merusak struktur tersier protein dengan
memutuskan interaksi-interaksi yang ada. Analisis setiap fraksi amonium sulfat dengan metode SDS-
Page bertujuan untuk mentukan berat molekul dari protein penyusun dari sampel. Menurut Kenkel
(1994:355-356), fraksinasi dengan menggunakan metode pemisahan berdasarkan filtrasi oleh gel
akan menghasilkan fraksi-fraksi dikarenakan adanya perbedaan ukuran dan berat molekul. Molekul
protein dengan berat dan ukuran molekul paling besar akan berada pada fraksi awal sedangkan
molekul dengan ukuran dan berat terkecil akan berada pada fraksi terakhir. Pada percobaan ini
terbukti bahwa protein dengan berat molekul yang paling besar terdapat pada fraksi 0-20%
amonium sulfat jenuh. Namun masih terdapat sebagian molekul yang berat pada fraksi 20-50%
amonium sulfat jenuh. Hal ini bisa disebabkan proses pengendapan oleh amonium sulfat tidak
mengendapkan protein secara bertahap sesuai berat molekul. Namun faktor ukuran molekul dan
kereaktifan juga dapat menyebabkan adanya molekul yang lebih kecil terdapat pada fraksi awal.
Fraksi-fraksi pada metode SDS-Page terpisah dengan baik terlihat dari jarak antar pita yang tidak
terlalu dekat. Prinsip dasar dari SDS-Page adalah elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu
proses bergeraknya molekul yang bermuatan didalam suatu medan listrik dimana molekul yang
bergerak ini tergantung pada muatan yang dimiliki, bentuk dan ukurannya. Sehingga dengan
elektroforesis ini dapat digunakan untuk separasi makromolekul seperti asam nukleat dan protein.
SDS-PAGE banyak digunakan saat ini untuk memisahkan suatu protein berdasarkan berat molekul
dan muatan yang dimilikinya karena pelaksanaannya mudah dan relatif tidak mahal. Gel pada SDS-
Page terdiri dari dua jenis yaitu Stcaking Gel dan Spearating Gel. Stacking gel digunakan hanya untuk
membentuk sumur (well) tempat sampel diinjeksikan. Separating gel ini berfungsi untuk
memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam
praktikum yaitu akrilamid sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel agar protein dapat
terpisah berdasarkan ukurannya, tris pH 8.8 untuk menstabilkan. pH buffer agar muatan dari protein
tidak berubah , SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi
unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif. Keasaman juga mempengaruhi
struktur protein dalam larutan. Protein merupakan zwitter ion sehingga jika tidak dalam kondisi atau
pH optimal, maka pengukuran yang dihasilkan tidak akurat begitu juga ketika protein berada pada
titik isoelektriknya yang muatannya secara keseluruhan adalah netral. Data dari SDS-PAGE dapat
diolah dengan membuat persamaan regresi linier dari pita marker sebagai standar. Setelah
mendapatkan persamaan regresi linier dari marker, karenatidak dilakukan standarisasi jarak migrasi
atau jarak tempuh marker maka digunakan jarak tempuh yang berada pada referensi. Persamaan
regresi linier dari marker referensi : y = -0.1459x + 2.2873. Y menunjukkan panjang jarak dari bagian
atas gel sampai pita protein yang akan diukur. Sedangkan x menunjukkan berat molekul. Dari
persamaan di atas terlihat bahwa semakin berat suatu molekul maka jarak yang ditempuh akan
semakin pendek. Hal ini juga terbukti dari data yang diperoleh pada percobaan. Ukuran pori poliakril
amid bersifat selektif terhadap ukuran molekul yang melewatinya, jika ukuran ukuran suatu molekul
protein lebih besar dari pada ukuran pori, maka protein tidak akan bisa melewati pori tersebut
secara spontan. Sehingga molekul-molekul protein bisa dipisahkan. Dari data, persentase fraksinasi
amonium sulfat yang besar cenderung mengandung jumlah protein yang lebih sedikit. Ini artinya
pemisahan pada persentase sebelumnya yang lebih kecil berlangsung optimal. Dari data hasil
perhitungan di atas dan data dari marker literatur, terbukti bahwa protein yang terdapat pada telur
adalah albumin yaitu direntang 57-105 kDa.

PEMBAHASAN
Pada percobaan ini, pengendapan protein yang terdapat pada larutan putih telur dilakukan dengan
penambahan garam ammonium sulfat yang disebut dengan prinsip salting out. Penambahan garam
ammonium sulfat dilakukan secara bertahap yang bertujuan untuk menyeleksi berdasarkan
kelarutan protein dalam air. Semakin banyak gugus polar maka kelarutan protein dalam air akan
semakin tinggi. Protein yang mengendap terlebih dahulu berarti memiliki gugus polar yang lebih
sedikit. Dan apabila pada protein tersebut memiliki gugus polar lebih banyak, maka dibutuhkan
garam yang lebih banyak untuk mengendapkannya. Proses pengendapan protein dipercepat dengan
proses sentrifugasi. Proses sentrifugasi berprinsip bahwa benda diputar secara horizontal pada jarak
tertentu sehingga zat yang memiliki berat molekul lebih besar akan bergerak ke dasar tabung dan zat
yang memiliki berat molekul lebih kecil akan bergerak ke bagian atas tabung. Sehingga endapan
protein akan terpisah dari cairannya. Dari hasil pengamatan, bisa dilihat bahwa pada penambahan
garam hingga 20 % jenuh hanya diperoleh endapan protein yang sangat sedikit yang disebut fraksi 0-
20%. Seiring dengan penambahan garam yang bertambah banyak, dihasilkan pula endapan yang
semakin banyak. Selain dihasilkan endapan, dihasilkan pula supernatant. Supernatan tersebut
kemudian diproses lagi dengan penambahan garam ammonium sulfat sampai 50% jenuh dan sampai
70% jenuh. Endapan yang dihasilkan semakin banyak yaitu. fraksi 20-50% dan yang terakhir adalah
fraksi 50-70% . Setiap fraksi endapan yang telah dilarutkan dalam buffer tris pH 7, kemudian
dianalisis menggunakan SDS-PAGE. SDS PAGE, singkatan dari Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide
Gel Electrophoresis, merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan prinsip elektroforesis.
Pemisahan dilakukan dengan menambahkan medan listrik, dimana terjadi aliran muatan dari
muatan negative ke positif. Terdapat dua layer gel di dalam SDS-PAGE. Layer pertama disebut
stacking gel yang berfungsi untuk peletakan well atau sumur untuk tempat analisi protein dan layer
kedua disebut separating gel yang berfungsi sebagai tempat terjadinya proses pemisahan protein.
Pada stacking gel, pH dibuat 6,8 yang bertujuan untuk membuat protein berada dalam keadaan
zwitter ion. Saat protein memasuki separating gel, yang pH nya dibuat 8,8 , muatan protein akan
menjadi negative sehingga proses elektroforesis bisa berlangsung. Protein yang bermuatan negative
akan menuju ke kutub positif yang berada di bagian bawah gel. Protein dengan ukuran molekul yang
lebih besar akan tertahan di bagian atas gel dan protein dengan ukuran molekul yang lebih kecil
akan lebih mudah masuk menembus gel yang merupakan polimer acrylamide. Proses elektroforesis
sangat bergantung pada tegangan dan waktu analisis. Jika kita memberikan tegangan yang tinggi,
maka proses pemisahan akan berlangsung secara cepat namun hasilnya kurang bagus, oleh karena
itu perlu adanya pengaturan waktu agar proses pemisahan protein berlangsung dengan baik dan
protein berhasil terpisahkan dengan baik pula. Hasil yang didapat melalui proses SDS-PAGE, dapat
dilihat pada gambar, poin B adalah hasil fraksi 20-50% dihasilkan 2 pita tebal, artinya terdapat 2 jenis
protein di dalam fraksi tersebut. Jenis protein pada pita paling atas menunjukkan protein tersebut
lebih berat daripada protein yang lain. Pada fraksi 50-70 % yang terlihat pada gambar, dihasilkan
pula 2 pita tebal, namun dengan intensitas yang berbeda. Artinya jenis protein pada pita A dan B
sama, namun hanya jumlahnya saja yang berbeda.