Anda di halaman 1dari 26

c.

Kromatograf Pertukaran Ion (Ion-Exchange


Chromatography)
Kromatograf pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan
untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat
dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua
tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan
pertukaran anion(anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner
bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif.
Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan meleati kolom. !ika muatan pada
molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. "amun #ika muatan
pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan
ionik dengan kolom. $ntuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan
penamba%an larutan dengan p& dan kekuatan ionik tertentu. Pemisa%an dengan metode
ini sangat selektif dan karena biaya untuk men#alankan metode ini mura% serta
kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada aal proses keseluru%an.
'erdasarkan (ase stasioner ((ase diam) )
*. Kromatograf Kolom
a. Kromatograf +dsorpsi
Kromatograf +dsorpsi adala% pemisa%an akibat daya tarik fase diam yang kuat
ter%adap komponen yang dipisa%kan adanya interaksi kimiai dan elusi berta%ap.
,yarat fase diam dalam kromatograf +dsorpsi adala% )
*. Tidak larut dalam fase gerak
-. Inert
.. /ukup aktif
0. ,ebaiknya tidak berarna
1. Memungkinkan aliran baik dan teratur fase gerak. Missal ) sukrosa, pati, /a/2
.
, Mg/2
.
,
Mg ,ilikat aktif, alumina aktif, arang aktif, 3orisil
b. Kromatograf Partisi
Prinsip kromatograf partisi dapat di#elaskan dengan %ukum partisi yang dapat
diterapkan pada sistem multikomponen yang diba%as di bagian sebelumnya. 4alam
kromatograf partisi, ekstraksi ter#adi berulang dalam satu kali proses. 4alam percobaan,
5at terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. (asa stationer dalam
banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adala% molekul pelarut
yang mengisi ruang antar partikel yang teradsorbsi.
Kolomnya (tabung gela) diisi dengan ba%an seperti alumina, silika gel atau pati yang
dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. 6arutan sampel
kemudian diisikan kedalam kolom dari atas se%ingga sammpel diasorbsi ole% adsorben.
Kemudian pelarut (fasa mobil; pembaa) ditamba%kan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi 5at terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke baa% (fasa mobil) dan
pelarut yang teradsorbsi ole% adsorben (fasa stationer). ,elama per#alanan turun, 5at
terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang7ulang. 6a#u penurunan
berbeda untuk masing7masing 5at terlarut dan bergantung pada koefsien partisi masing7
masing 5at terlarut. +k%irnya, 5at terlarut akan terpisa%kan membentuk beberapa
lapisan.
c. Kromatograf +dsorpsi dan Partisi
d. Kromatograf pertukaran Ion
e. Kromatograf 8kslusif molekul
f. Kromatograf +fnitas
-. Kromatograf Kertas
Kromatograf kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan
sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam7asam
amino larut dalam air dan tidak muda% menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisa%an
asam amino adala% masala% paling sukar yang di%adapi kimiaan di ak%ir abad *9 dan
aal abad -:. !adi penemuan kromatograf kertas merupakan berita sangat baik bagi
mereka.
Kimiaan Inggris ;ic%ard 6aurence Millington ,ynge (*9*07*990) adala% orang
pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatograf kertas.
,aat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara <ertikal karena ada
fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang
teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang7ulang. Ketika pelarut mencapai u#ung
atas kertas proses di%entikan. ,etiap asam amino bergerak dari titik aal sepan#ang
#arak tertentu. 4ari nilai ;, masing7masing asam amino diidentifkasi.
Kromatograf kertas dua7dimensi (-4) menggunakan kertas yang luas bukan
lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.
Kromatograf kertas %ampir sama dengan kromatograf lapis tipis. Kromatograf
kertas memisa%kan larutan organic air dan larutan anorganik atau komponen polar yang
tinggi seperti asam amino dan gula. Kertas yang digunakan mengandung air yang
merupakan fase diam. (ase gerak umumnya adala% fase pelarut organik polar dan air
(campuran pelarut yang mengandung air sebagai komponen). (ase diam kromatograf
kertas bersifat cair (air) sedangkan fase geraknya #uga cairan (pelarut organic dan air).
/ampuran sampel men#alani partisi atau distribusi di antara dua fase cairan. ,ampel
akan terpisa% dengan nilai koefesien partisi yang berbeda.
Kromatograf kertas merupakan sala% satu conto% kromatograf partisi. Ketika fase
gerak diiletakkan di atas c%amber, teknik dikenal dengan descending. Ketika fase
geraknya diletakkan di baa% maka disebut ascending. !ika %asil kromatograf kertas
kurang berarna, ada dua metode umum yang digunakan untuk mendeteksi lokasi spot,
yaitu menggunakan sinar $= dan reagen pearna. ,inar $= digunakan ketika komponen
mengandung 5at 3uoresens (berpendar). Kation seperti /o, "i, >n, dan Mn menggunakan
reagen pearna difenil karba5id se%ingga meng%asilkan arna masing7masing adala%
ungu, mera%, pink, da pink pucat. ;eagen pearna tersebut disemprotkan pada kertas
dan %asilnya yang terli%at dilingkari ole% pensil (Krupadanamet al -::*). Kromatograf
kertas terdapat distribusi antara air (diadsorbsi ole% kertas saring sekitar -: ?) dan
pelarut bergerak ('ansal -::.).
Mekanisme pemisa%an dengan kromatograf kertas prinsipnya sama dengan
mekanisme pada kromatograf kolom. +dsorben dalam kromatograf kertas adala% kertas
saring, yakni selulosa. ,ampel yang akan dianalisis ditotolkan ke u#ung kertas yang
kemudian digantung dalam ada%. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam
pelarut yang mengisi dasar ada%. (asa mobil (pelarut) dapat sa#a beragam. +ir, etanol,
asam asetat atau campuran 5at75at ini dapat digunakan.
,atu keuntungan utama Kromatogrf Kertas iala% kemuda%an dan
keseder%anaannya pada pelaksanaan pemisa%an, yaitu %anya pada lembaran kertas
saring yang berlaku sebagai medium pemisa%an dan #uga sebagai penyangga.
Keuntungan lain iala% keterulangan bilangan Rp yang besar pada kertas se%ingga
pengukuran Rp merupakan parameter yang ber%arga dalam memaparkan senyaa
tumbu%an baru. Memang, untuk senyaa antosianin yang tidak mempunyai ciri fsika
lain yang#elas, Rjr adala% sarana terpenting dalam memaparkan dan membedakan
pigmen yang satu dengan pigmen yang lain (&arborne, *9@A).
.. Kromatograf 6apis Tipis
Kromatograf digunakan untuk memisa%kan substansi campuran men#adi
komponen7komponennya. ,eluru% bentuk kromatograf berker#a berdasarkan prinsip ini.
,emua kromatograf memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan7padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). (ase gerak mengalir melalui
fase diam dan membaa komponen7komponen yang terdapat dalam campuran.
Komponen7komponen yang berbeda bergerak pada la#u yang berbeda. Kita akan
memba%asnya lebi% lan#ut.
Kromatograf lapis tipis (K6T) merupakan sebua% bentuk dari kromatograf
adsorpsi padat cair yang fase diamnya dilumuri di atas plat. +da perbedaan cara dalam
melapisi plat, yaitu menuangkan, mencelupkan, menyemprotkan, dan melapisi. Plat yang
digunakan dapat berupa plat kaca dan aluminium. +dsorban padat yang sering
digunakan, yaitu silikia dan alumina. 'a%an tersebut dicampur dengan ba%an pengikat
agar tidak terkelupas pada plat yang kering. ,ampel ditamba%kan sebagai larutan di
dalam pelarut yang non polar di u#ung plat dengan membentuk spot yang simetri. Proses
pengulangan penamba%an bertu#uan mendapatkan beberapa miligram sampel.
Pengamatan pada plat yang menggunakan silikia (mengandung larutan 3uoresens)
dengan menggunakan sinar $= memperli%atkan lokasi spot7spot yang berpendar. Ketika
fase gerak diiletakkan di atas c%amber, teknik dikenal dengan descending. Ketika fase
geraknya diletakkan di baa% maka disebut ascending ('ansal -::.).
'ila K6T dibandingkan dengan KKt, kelebi%an k%as K6T iala% keser7baeunaan,
kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan K6T di7sebabkan ole% kenyataan ba%a di
samping selulosa, se#umla% pen7#erap yang berbeda7beda dapat disaputkan pada pelat
kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatograf. Balau pun silika gel paling
banyak digunakan, lapisan dapat pula dibuat dari alumuni7um oksida, CceliteC, kalsium
%idroksida, damar penukar ion, magnesium fosfat, poliamida, Csep%adeDC, poli<inil
pirolidon, selulosa, dan campuran dua ba%an di atas atau lebi%. Kecepatan K6T yang lebi%
besar disebabkan ole% sifat pen#erap yang lebi% padat bila disaputkan pada pelat dan
merupakan keuntungan bila kita menelaa% senyaa labil. +k%irnya, kepekaan K6T
sedemikian rupa se%ingga bila diper7lukan dapat dipisa%kan ba%an yang #umla%nya lebi%
sedikit dari ukuran g.
,atu kekurangan K6T yang asli iala% ker#a penyaputan pelat kaca dengan
pen#erap. Ker#a ini kemudian agak diringankan dengan ada7nya penyaput otomatis. Meski
pun begitu, dengan menggunakan alat itu pun tetap diperlukan tindakan pencega%an
tertentu. Pelat kaca %arus dibersi%kan %ati7%ati dengan aseton untuk meng%ilangkan
lemak. Kemudian bubur silika gel (atau pen#erap lain) dalam air %arus dikocok kuat7kuat
selama #angka aktu tertentu (misalnya 9: detik) sebelum penyaputan. Tergantung pada
ukuran partikel pen#erap, mungkin %arus ditamba%kan kalsium sulfat %emi%idrat (*1?)
untuk membantu melekatkan pen#erap pada pelat kaca. +k%irnya, setela% penyaputan,
pelat %arus dikeringkan pada su%u kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan
dalam tanur pada *::E**:F/ selama .: menit. Pada beberapa pemisa%an biasanya
akan menguntungkan bila sifat pen#erap diuba% dengan menamba%kan garam anorganik
(misalnya perak nitrat untuk K6T pemerakan), dan %al ini paling balk diker#akan ketika
pelat sedang disaput. +lasan lain masi% digu7nakannya pelat yang disaput sendiri di
laboratorium iala% karena kadar air silika gel dapat dikendalikan. &al ini merupakan
faktor yang kritis untuk beberapa pemisa%an.
Tetapi sekarang menggunakan pelat pralapis niaga dalam kebanyakan pemisa%an
suda% merupakan suatu %al yang biasa karena pelat tersedemikian dengan pen#erap
yang berbeda7beda, disaputkan pada kaca, lembaran alumunium, atau plastik. Pelat
dapat mengandung indikator 3uoresensi atau tidak. Penamba%an indikator ini
memungkinkan pendeteksian semua senya7a yang memadamkan 3uoresensi bila pelat
diamati dengan disinari sinar $= berpan#ang gelombang -10 nm. !enis K6T yang paling
baru iala% K6T yang menggunakan pelat bersaputkan mikropartikel silika %alus yang
biasa digunakan untuk kolom K/KT. Kromatograf yang demikian disebut kromatograf
lapis tipis kiner#a tinggi (K6TKT) dan biasanya meng%asilkan pemisa%an yang lebi% efsien
dan lebi% cepat daripada pemisa%an pada lapisan silika yang biasa.

2.4 Komponen Utama Kromatograf
Kromatograf adala% teknik untuk memisa%kan campuran men#adi komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fsik masing7masing komponen. +lat yang digunakan
terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan).
/ampuran ditamba%kan ke kolom dari u#ung satu dan campuran akan bergerak dengan
bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisa%an dicapai ole% perbedaan la#u
turun masing7masing komponen dalam kolom, yang ditentukan ole% kekuatan adsorpsi
atau koefsien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer).
Komponen utama kromatograf adala% fasa stationer dan fasa mobil.
a. Fase Stationer (Fase diam)
Pelaksanaan kromatograf lapis tipis menggunakan lapis tipis silica atau alumina yang
seragam pada sebua% lempeng gelas atau logam atau plastic yang keras.
!el silica (atau alumina) merupakan fase diam. (ase diam untuk kromatograf lapis
tipis seringkali #uga mengandung substansi yang mana dapat berpendar 3our dalam
sinar ultra <iolet. (ase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
(ase diam lainnya yang biasa digunakan adala% alumina7aluminium oksida. +tom
aluminium pada permukaan #uga memiliki gugus G2&. +pa yang kita sebutkan tentang #el
silica kemudian digunakan serupa untuk alumina.
b. Fase Mobil (Fase gerak)
4alam kromatograf, eluent adal% fase gerak yang berperan penting pada proses
elusi bagi larutan umpan (feed) untuk meleati fase diam (adsorbent). Interaksi antara
adsorbant dengan eluent sangat menentukan ter#adinya pemisa%an komponen. 2le%
sebab itu, pemisa%an komponen gula dalam tetes secara kromatograf dipengaru%i ole%
la#u alir eluent dan #umla% umpan.
8luent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam %al ini yang banyak digunakan
adala% #enis adsorban alumina atau sebua% lapis tipis silica. Penggolongan ini dikenal
sebagai deret eluotropik pelarut. ,uatu pelarut yang bersifat larutan relati<e polar dapat
mengusir pelarut yang relati<e tak polar dari ikatannya dengan alumina (#el silica).
(Kantasubrata,*99.).
Kecepatan gerak senyaa7senyaa ke atas pada lempengan itu, tergantung pada )
'agaimana kelarutan senyaa dalam pelarut. &al ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul7molekul senyaa dengan pelarut.
'agaimana senyaa melekat pada fase diam, misalnya silica. &al ini tergantung pada
bagaimana besar atraksi antara senyaa dengan silica gel.
+nggapla% bercak aal pada alumina mengandung dua senyaa, yang satu dapat
membentuk ikatan %ydrogen, dan yang lainnya %anya dapat mengambil tiap7tiap bagian
interaksi <an der Baals yang lema%.
,enyaa yang dapat membentuk ikatan %ydrogen akan melekat pada #el silica lebi%
kuat disbanding senyaa lainnya. Kita mengatakan ba%a senyaa ini ter#erap lebi%
kuat dari senyaa yang lainnya. Pen#erapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari
satu substansi pada permukaan.
Pen#erapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan tetap dari molekul antara
yang ter#erap pada permukaan #el silica dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.
4engan #elas senyaa %anya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama aktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyaa di#erap pada silica gel untuk sementara aktu
proses pen#erapan ber%enti7dimana pelarut bergerak tanpa senyaa. Itu berarti ba%a
senyaa semakin kuat senyaa di#erap, semakin kurang #arak yang ditempu% ke atas
lempengan.
2.5 Kromatograf dan Aplikasinya pada Bidang lain
a) Pada 'idang 'ioteknologi
4alam bidang bioteknologi, kromatograf mempunyai peranan yang sangat besar.
Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyaa dalam protein.
Protein sering dipili% karena ia sering men#adi obyek molekul yang %arus di7purifed
(dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio7farmasi. Kromatograf #uga bisa
diaplikasikan dalam pemisa%an molekul7molekul penting seperti asam nukleat,
karbo%idrat, lemak, <itamin dan molekul penting lainnya.
4engan data7data yang didapatkan dengan menggunakan kromatograf ini,
selan#utnya sebua% produk obat7obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai
sebagai data aal untuk meng%asilkan #enis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk
mengontrol kond isi obat tersebut se%ingga bisa berta%an lama.
b) Pada 'idang Klinik
4alam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam
mengin<estigasi 3uida badan seperti air liur. 4ari air liur seorang pasien, dokter dapat
mengeta%ui #enis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. ,eorang perokok dapat
diketa%ui apaka% dia termasuk perokok berat atau ringan %anya dengan mengeta%ui
konsentrasi /"7 (sianida) dari sampel air liurnya. 4emikian %alnya air kencing, dara% dan
3uida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat se%ingga keberadaan
suatu penyakit dalam tubu% manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
,ekarang ini, deteksi senyaa oksalat dalam air kencing men#adi sangat penting
terutama bagi pasien kidney stones (batu gin#al). 'anyak metode analisis seperti
spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutu%kan
ker#a ekstra dan aktu yang cukup lama untuk mendapatkan %asil analisis dibandingkan
dengan teknik kromatograf.
4engan alasan7alasan inila%, kromatograf kemudian men#adi pili%an utama
dalam membantu mengatasi permasala%an dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan
ke%idupan manusia secara umum.
c) Pada 'idang (orensik
+plikasi kromatograf pada bidang forensik pun sangat membantu, terutama
dili%at dari segi keamanan. Masi% lekat dalam ingatan kita, sebua% peristia 'lack
,eptember Tragedy mengguncang +merika pada tanggal ** ,eptember -::* yang
ditandai dengan runtu%nya dua gedung kesayangan pemerinta% +merika ,erikat.
4emikian %alnya di Indonesia yang marak dengan aksi peledakan bom yang ter#adi di
mana7mana. Per%atian dunia pun ak%irnya mulai berali% dengan adanya peristia7
peristia pengebomanHpeledakan tersebut ke ba%aya eDplosi<e (ba%an peledak) dengan
peningkatan yang cukup ta#am.
Kini kromatrograf men#adi %al yang sangat penting dalam menganalisis berbagai
ba%an7ba%an kimia yang terkandung dalam ba%an peledak. &al ini didorong karena
dengan semakin cepat diketa%uinya ba%an7ba%an dasar apa sa#a ba%an peledak, maka
akan makin mempercepat diambilnya tindakan ole% bagian keamanan untuk mengatasi
daera%7daera% yang terkena ledakan serta antisipasi meluasnya efek radiasi yang
kemungkinan akan mengena tubu% manusia di sekitar lokasi ledakan. 6ebi% #au% lagi,
efek negatifnya ter%adap lingkungan #uga bisa segera diketa%ui.
Pada dasarnya setiap ba%an peledak, baru akan meledak #ika ter#adi benturan,
gesekan, getaran atau adanya peruba%an su%u yang meningkat. 4engan ter#adinya %al7
%al seperti ini, memberikan peluang ba%an peledak tersebut beruba% man#adi 5at lain
yang lebi% stabil yang diikuti dengan tekanan yang tinggi, yang bisa meng%asilkan
ledakan da%syat atau ba%kan munculnya percikan api.
+da banyak ba%an kimia yang biasa digunakan dalam ba%an peledak, baik ba%an
peledak yang kerkekuatan tinggi maupun renda%, beberapa diantaranya adala% -,0,@7
trinitrotoluene (T"T), siklonit (;4I), tetril, pentaeritritol tetranitrat (P8T") dan tetritol
serta beberapa anion lain seperti perklorat, klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfate dan
tiosianat.'isa dikatakan ba%a analisis organic ion (ion organik) dan inorganic ion (ion
anorganik) memainkan peranan yang sangat penting pada saat in<estigasi lokasi ledakan
bom berlangsung. Pendeteksian ion7ion anorganik misalnya, setela% pengeboman
berlangsung, akan memberikan %arapan karena tidak semua material dari ba%an peledak
tersebut ikut meledak pada saat ter#adi ledakan.
'a%an7ba%an anorganik seperti klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfate, tiosianat, dan
perklorat adala% ba%an7ba%an kimia yang biasa digunakan sebagai oksidator untuk lo
eDplosi<e (ba%an peledak berkekuatan renda%).
d) 4alam bidang lingkungan
4alam masala% lingkungan, sebagai konsekuensi ma#unya peradaban manusia,
berarti permasala%an pun semakin Jma#uK. ,ala% satu permasala%an serius yang
di%adapi ole% negara7negara berkembang dan utamanya negara ma#u adala% persoalan
global arming (pemanasan global). Menurut sur<ei "ational Institute for 8n<ironmental
,tudies, !apan, ta%un -::@ lalu, ba%a masyarakat di !epang memperkirakan tingkat
pemanasan global merupakan masala% lingkungan paling serius dan tingkatannya
%ampir A kali lipat dari satu dekade yang lalu saat polling kali pertama dilakukan pada
ta%un *99A-). ,eiring dengan %al itu, permasala%an lingkungan pun semakin meningkat.
4isinila%, teknik kromatograf mengambil peran paling penting dalam en<ironmental
analysis (analisis lingkungan) ini.
Pada dasarnya permasala%an lingkungan bisa dibagi ke dalam . bagian ) ater
%ygiene, soil %ygiene dan air %ygiene. ,ebagai conto%, kualitas air (misal ) air ledeng, air
sungai, air danau, air permukaan) dapat diketa%ui sala% satunya dengan mengeta%ui
#enis anion dan kation yang terkandung dalam sampel air tersebut sekaligus #umla%nya.
+paka% mengandung logam7logam berba%aya atau tidak.
4emikian %alnya pada daera% yang terkena acid rain (%u#an asam). +ntisipasi dini
dapat dilakukan dengan mengeta%ui secara dini kandungan sulfate ion, ,20-7 (ion sulfat)
dan nitrogen trioDide ion, "2.7 (nitrogen trioksida) yang terdapat dalam air %u#an
tersebut. Terbentuknya %u#an asam disebabkan gas sulfur oDide, ,2D dengan uap air dan
membentuk asam sulfat (&-,20), demikian pula nitrogen oDide "2D dapat membentuk
asam nitrat (&"2.) di udara. ;eaksi7rekasi ini mengambil aktu ber#am7#am atau ba%kan
ber%ari7%ari di udara %ingga ak%irnya #atu% ke bumi dalam bentuk %u#an asam.
4i beberapa negara ma#u seperti !epang, +merika, 8ropa, Kanada, dan beberapa negara
lainnya, monitoring udara dan air %u#an men#adi sangat penting tidak %anya untuk
memperkirakan efek dari polusi itu tapi yang lebi% penting lagi adala% memonitor
progress (perkembangan) control polusi dari global ecology (ekologi global).
Kontrol kondisi air %u#an ini men#adi penting karena beberapa efek yang fatal
yang mungkin bisa ter#adi, di antaranya #atu%nya %u#an asam dapat meningkatkan
keasaman danau, sungai, bendungan yang pada ak%irnya mungin dapat menyebabkan
kematian pada ke%idupan air. 4emikian pula keasaman pada tana% dapat meningkat dan
merembes ke air permukaan tana% yaitu sumber air minum se%ari7%ari. +plikasi pada
bidang yang lain
,ebenarnya masi% sangat banyak aplikasi kromatograf dalam bidang7bidang keilmuan
lainnya. 'eberapa aplikasi tersebut misalnya dalam industri kertas, pertambangan,
proses logam, petrokimia, pertanian, kedokteran dan lain7lain.
"amun karena keterbatasan ruang, dalam tulisan ini penulis %anya menampilkan
beberapa conto% peran serta kromatograf dalam memuda%kan dan mempercepat
perole%an Jtarget dataK dalam beberapa bidang yang tersebut di atas.
Kromatograf afnitas
Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer
dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap
biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibodi
terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya
Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam
kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik
2)
.
Tujuan dari afinitas kromatografi adalah untuk memisahkan semua molekul dari kekhususan tertentu
dari keseluruhan seluruh molekul dalam ampuran
Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step purification)
!alam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik
antara protein rekombinan dengan suatu ligan.
!alam kasus ini. pemisahan terjadi karena interaksi"interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. #ase
diam mengandung gugus"gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi"kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam
interaksi antara antigen dan antibodi).
$romatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari ampuran yang sangat
kompleks%2%.
&kema yang paling urnum untuk melakukan krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap
elusi gradien &kema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya fase gerak
(dengan p' yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut"ligan. Pelarut ini, yang
menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi. &elama fase
aplikasi pemisahan, senyawa"senyawa yang komplemen dengan ligan afinitas akan berikatan karena
sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi. (eskipun demikian, karena selektifitas interaksi
solut")igan yang tinggi, sampel"sampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa tertahan.
&etelah komponen"komponen yang tidak t%ertahan telah terui seara sempurna dari kolom, solut
yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yang mampu mengeluarkannya dari kolom
atau yang mampu memeah kompleks ligan"solut. Pelarut ini merupakan fase gerak yang kuat dan
seringkali dikenal sebagai bufer elusi. *egitu solut yang dikehendaki keluar dari kolom, maka solut
dapat diukur atau dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. $olom selanjutnya diiregenerasi
dengan ara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut
$omplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama ko+alen digabungkan ke larut matriks, seperti
keil agarosa manik"manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom. &uatu ampuran tidak murni
mengandung protein untuk diisolasi ini kemudian diterapkan pada kolom dan memungkinkan untuk
berinteraksi dengan ligan amobil Pada tahap ini, protein yang akan diisolasi mengikat seara khusus
untuk ligan amobil sementara sisa molekul dalam aliran ampuran melalui kolom. Protein kepentingan
kemudian dapat dielusi dari kolom di bawah kondisi yang mengganggu interaksinya dengan ligan
bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk memutuskan ikatan antara protein yang akan
diambil dengan lingannya. Jadi, buffer pengelusi ini dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat,
sehingga protein lepas dan selanjutnya keluar bersama eluen.
(unulnya punak pada grafik serapan fraksi"fraksi protein hasil pemurnian tergantung pada bufer
pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara ligan dengan protein,
maka akan terjadi tailing, yaitu punak yang melebar. &elain itu, +olume matriks juga mempengaruhi
lebarnya punak, karena ligan yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar +olume matriks
semakin lebar punak serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak
Bahan terisolasi oleh Kromatografi Affinity dan Ligan komplementer
Zat Terisolasi oleh Afinitas Ligan
Chromatography Kromatografi
,nzim &ubstrat, kofaktor
-ntibodi -ntigen, .irus, /ell
Polisakarida, glikoprotein 0ektin
(engikat protein asam nukleat -sam 1ukleat
'ormon reseptor 'ormon
$eterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi seara
spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi seara spesifik
maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap. 1amun $eterbatasan ini sekarang dapat diatasi
dengan adanya teknologi fusi protein. )denya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari
protein yang akan dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan ligan
tertentu.
Afinitas Kromatografi Metode
$romatografi afinitas diranang untuk memurnikan protein tertentu dari sampel ampuran.
!i siapkan kolom afinitas dengan matriks dan ligan yang sesuai
&ampel Protein dimasukkan k kolom dan protein akan melalui saringan matriks afinitas manik"manik.
Protein berinteraksi dengan afinitas ligan dengan beberapa protein yang mengikat dengan erat,
longgar dan tak berikatan
Protein yang tidak mengikat akan terui oleh buffer aplikasi.
protein yang mengikat di ui dengan buffer elusi.
protein elusi yang mengikat erat ligan dan mengumpulkan protein murni penting
Kromatograf fltrasi gel
4efnisi Teknologi
"ama /ina) kromatograf fltrasi Lel
"ama Inggris) kromatograf fltrasi gel; L(/
"ama lain) kromatograf gel (kromatograf gel), kromatograf molecular sie<e
(kromatograf saringan molekuler), kromatograf permeasi gel (gel perembesan)
kromatograf4efnisi) LP/) M
+tas isi ole% Komite Persetu#uan Teknologi ,ains "asional dan diumumkan
Kromatograf gel fltrasi (kromatograf fltrasi gel) metode, kromatograf eksklusi #uga
dikenal atau metode ayakan molekul terutama didasarkan pada ukuran dan bentuk
protein, kualitas protein diisolasi dan dimurnikan. Kolom pengisi inert dalam struktur
berpori 5at tertentu, polisakarida sebagian silang (seperti dekstran atau agarosa) 5at,
5at dalam campuran protein dengan pemisa%an ukuran molekul yang berbeda. !uga
disebut kromatograf eksklusi molekul (kromatograf molekul7eDclusion). ,ebua%
penggunaan manik7manik gel berlubang sebagai substrat, dipisa%kan menurut
ukuran molekul protein atau molekul lain dalam campuran teknik kromatograf.
$mumnya mengalir keluar makromolekul pertama, molekul kecil mengalir keluar.
Mendasar
!uga dikenal sebagai saringan molekul kromatograf, kromatograf fltrasi gel,
kromatograf eksklusi ukuran. Memiliki struktur #aringan adala% penggunaan efek gel
saringan molekuler, menurut 5at molekul dipisa%kan dengan pemisa%an ukuran yang
berbeda. Kolom pengisi inert dalam struktur berpori 5at tertentu, polisakarida
sebagian silang (seperti dekstran atau agarosa) 5at, molekul kecil bisa masuk interior,
#arak aliran lebi% pan#ang, makromolekul dikeluarkan dari luar, turun #arak pendek,
ketika larutan campuran melalui kolom fltrasi gel, solusi 5at dibuka ole% skrining
dengan berat molekul yang berbeda.
Keuntungan
Keuntungannya adala% penggunaan kromatograf gel pada pembaa inert
bermuatan, adsorpsi lema%, kondisi operasi yang relatif ringan, dalam kisaran relatif
su%u yang luas, ada pelarut organik, dan sifat7sifat fsik dan kimia dari komponen
terpisa% tetap unik. 4ari ba%an polimer memiliki efek pemisa%an yang baik.
Menggunakan
gel dipili% sesuai dengan tu#uan percobaan pili%an yang berbeda untuk berbagai
#enis gel. !ika tu#uan dari penelitian ini adala% untuk makromolekul dalam sampel dan
untuk memisa%kan molekul kecil, karena koefsien distribusi mereka dalam perbedaan
yang signifkan, pemisa%an ini #uga dikenal sebagai kelompok pemisa%an, dan dapat
digunakan ,ep%adeDL7-1 dan L71:, peptida kecil dan 5at dengan berat molekul
renda% (*:::71:::) bisa digunakan untuk desalinasi ,ep%adeDL7*:, L7*1 dan 'io7
Lel7p7- atau 0, #ika tu#uan dari penelitian ini adala% untuk sampel beberapa berat
molekul lebi% mirip dengan pemisa%an 5at, seperti Pemisa%an yang disebut
fraksinasi. ,edikit lebi% besar dari batas pengecualian umumnya digunakan dalam
tertinggi 5at berat molekul dalam sampel gel, proses kromatograf dapat dera#at yang
berbeda 5at ini #au% ke bagian dalam gel, sebagai Kd yang berbeda, ak%irnya
dipisa%kan.
diameter dan pan#ang kolom menurut pengalaman, kelompok pemisa%an, mereka
menggunakan -7.:cm pan#ang kolom, fraksinasi, umumnya membutu%kan sekitar
kolom pan#ang *::cm, *71cm dengan diameter dalam kisaran kurang dari * cm
meng%asilkan efek dinding, lebi% dari 1cm kemudian diencerkan serius. Pan#ang 6 dan
diameter 4 rasio 6 H 4 secara umum %arus antara A7*:, tapi gerakan lambat material
%arus antara .: dan 0:.
gel preparatif Model kolom gel yang dipili%, partikel perekat tersuspensi dalam air
suling atau 17*: kali #umla% eluen sepenu%nya bengkak, pembengkakan partikel
%alus kecil setela% mengalir keluar. Pembengkakan aktu yang lebi% lama alami,
panas dapat mempercepat pembengkakan, yaitu dalam bak air mendidi% selama
bubur gel basa% dipanaskan secara berta%ap ke dekat mendidi%, *7- #am untuk
mencapai ekspansi gel terlarut cukup. Metode pemanasan, mendapatkan aktu dan
desinfeksi.
Lel pemuatan) kolom <ertikal tetap ke tana% di rak, outlet baa% dengan klip pen#epit
ibukota dapat menginstal sebua% ada% besar yang dilengkapi dengan pengaduk,
kolom diisi dengan L86 8luan bubur relatif tipis yang pertama diisi ada% cairan di
bagian atas kolom, maka gel diaduk sedikit tenggelam dalam kolom, se%ingga gel
partikel naik tingkat, naik ke ketinggian yang diinginkan, meng%apus atas aparat
kolom, dengan flter yang sesuai sepotong ringan menutupi permukaan tidur gel.
Tempat kecil untuk beberapa aktu, dan kemudian mulai mengalir keseimbangan,
la#u alir %arus lebi% renda% daripada la#u aliran yang dibutu%kan untuk kromatograf.
,ecara berta%ap meningkat selama kromatograf aliran keseimbangan, tidak melebi%i
la#u aliran ak%ir. Menyeimbangkan tidur gel semalam sebelum digunakan untuk
memeriksa kromatograf tidur adala% seragam, apaka% MgarisM atau gelembung, atau
menamba%kan beberapa ba%an arna untuk mengamati pergerakan pita, seperti
dengan, kolom mulus sempit seragam baik kiner#a kromatograf di#elaskan, pita
muncul terdistorsi, tersebar, kolom yang lebi% luas %arus diinstal ulang.
gel, dimuat dan dielusi melalui tidur keseimbangan, meninggalkan di atas #umla%
tempat tidur dari gel tidur #enu% ml eluat, dan kemudian menamba%kan penetes
sampel. $mumnya <olume total sampel tidak lebi% besar dari <olume tidur gel 1?
7*:?. Independen konsentrasi sampel dan koefsien distribusi, konsentrasi sampel
dapat ditingkatkan, tetapi semakin besar ba%an berat molekul, <iskositas larutan
meningkat dengan konsentrasi, gerakan molekul terbatas, <iskositas relatif dari
sampel dan eluen tidak melebi%i *,17 (-) sampel setela% bergabung open outlet
sungai, se%ingga sampel menembus tidur gel, %anya saat permukaan sampel dengan
permukaan tidur gel normal, dan kemudian menamba%kan ml elusi beberapa mencuci
dinding untuk membuatnya men#adi tempat tidur gel setela% semua tempat tidur
kromatograf dengan eluen penyimpanan botol, dan kolektor di%ubungkan ke la#u alir
pra7desain, kemudian ,egmen eluat, dan setiap fraksi untuk penentuan kualitatif dan
kuantitatif.
gel kolom kembali, daur ulang dan pelestarian gel setela% kolom dikemas dapat
digunakan berulang kali, tanpa perlakuan k%usus, tidak mempengaru%i efek
pemisa%an. $ntuk mencega% kontaminasi gel, kromatograf dapat ditamba%kan
setela% pertama :,:-? sodium a5ide, sebelum agen bakteriostatik kromatograf
berikutnya %arus di%apus untuk meng%indari gangguan dengan penentuan eluen.
Metode pemuli%an
!ika +nda gunakan tidak lagi dapat didaur ulang, pendekatan umum adala% untuk
membilas gel terkuras, dicuci dengan A:?, 9:?, 91? etanol de%idrasi
kesetimbangan men#adi etanol lebi% dari 9:?, dikeringkan, dicuci dengan eter etanol,
dikeringkan, tempat yang kering. Metode pengaetan negara basa% bubur gel
ditamba%kan ke agen antimikroba atau air bilas autocla<e disegel netral disimpan.
Penerapan kromatograf gel
desalinasi) polimer (seperti protein, asam nukleat, polisakarida, dll) solusi dari
kotoran berat molekul renda% dapat di%ilangkan dengan kromatograf gel, operasi ini
disebut desalinasi. &ukum desalinasi seder%ana, cepat, dan en5im dan protein lain
dalam proses desalinasi tidak degenerasi muda%. Lel diterapkan ,ep%adeDL7*:,
*1,-1, atau 'io7Lel7p7-, 0,@. Pan#ang kolom untuk rasio diameter 17*1, <olume tidur
dari <olume sampel sampai dengan -1? 7.:? $ntuk mencega% penurunan kelarutan
endapan protein di%ilangkan garamnya akan membentuk teradsorpsi pada kolom,
garam umumnya muda% menguap seperti buNer amonium asetat untuk
menyeimbangkan kolom dan kemudian ditamba%kan ke sampel, menggunakan buNer
elusi yang sama, eluat tersebut dikumpulkan garam =olatile di%apus ole% lioflisasi.
untuk Pemurnian) kromatograf Lel tela% banyak digunakan en5im, protein, asam
amino, polisakarida, %ormon, dan 5at alkaloid lain dari pemisa%an dan pemurnian. Lel
untuk memanaskan tepi penyerapan asli yang kuat, dapat digunakan untuk
meng%apus non7ionik persiapan air pirogenik air untuk in#eksi.
Penentuan berat molekul ba%an polimer ) serangkaian standar berat molekul yang
dikenal ke dalam kolom gel yang sama dan dikromatograf baa% kondisi yang sama,
<olume rekaman komponen elusi per menit, dan elusi =olume ter%adap berat molekul
Plot logaritmik, dalam rentang berat molekul adala% garis lurus, yaitu kur<a standar
berat molekul. Penentuan berat molekul dari 5at yang tidak diketa%ui, sampel ini
dapat ditamba%kan ke kur<a standard yang ditentukan kolom gel bengkak dicuci,
sesuai dengan <olume elusi substansi dalam kur<a standar berat molekulnya.
terkonsentrasi larutan polimer) biasanya ,ep%adeDL7-1 atau 1: ke encer larutan
polimer perekat, maka air dan 5at berat molekul renda% akan memasuki pori7pori gel
di dalam partikel, ba%an polimer peringkat resistensi dari partikel gel, dan kemudian
disentrifugasi atau disaring, dan gel bengkak dipisa%kan, larutan polimer yang
diperole% dipekatkan
Pengertian kromatografi Ion
Exchange
*2 2""O +P;IO+&+"4+ 3
Kromatograf merupakan sebua% metode untuk memisa%kan
campuran men#adi komponen7komponen penyusunnya. ,ala%
satu bentuk campuran yang biasa dikromatograf yaitu senyaa7
senyaa yang memiliki molekul saling berikatan ion. Pemisa%an
sala% satu ion penyusun molekul tersebut, membutu%kan metode
k%usus yakni kromatograf pertukaran ion.
Ion exchange #ika diartikan ke dalam 'a%asa Indonesia berarti
pertukaran ion. "amun #ika diartikan lebi% dalam lagi,
kromatografion exchange adala% sebua% proses kromatograf
untuk memisa%kan molekul ion suatu senyaa berdasarkan
perbedaan nilai muatan permukaan antar senyaa.
'utir ;esin Pada Ion Exchange
(Sumber)
Pertukaran ion melibatkan butiran7butiran resin dengan
permukaan yang bermuatan positif (kation) atau negatif (anion).
'iasanya resin7resin tersebut memiliki pori7pori kecil untuk
menamba% luas permukaan kontak. ,ebagai conto% gambaran,
sala% satu #enis resinion exchange adala% berupa molekul ikatan
%idrokarbon kompleks yang sangat pan#ang dengan u#ung rantai
mengikat ion &
P
untuk resin kation, dan 2&
7
untuk resin anion.
/onto% Molekul ;esin Ion Exchange
(Sumber)
Pada proses ekstraksi protein, resin ion exchange dikemas ke
dalam sebua% ada% kolom, dan diisi dengan larutan
penyetimbang (equilibration buer). 6arutan penyetimbang ini
mengisi sela7sela kosong antara butiran resin serta menyelimuti
permukaan pori tiap7tiap butirannya. Kekuatan ion dan p& larutan
penyetimbang di#aga pada angka k%usus, se%ingga pada saat
sampel campuran dimasukan ke dalam kolom resin, %anya ion7ion
molekul protein sasaran yang terikat ole% molekul resin.
Pengontrolan nilai p& ini sangat penting karena molekul7molekul
protein tersusun atas ion7ion asam amino yang kekuatan
muatannya sangat bergantung ter%adap p& lingkungannya
(per%atikan kur<a berikut).
Kur<a Pengaru% p& 6ingkungan Ter%adap Muatan Permukaan
Protein
(Sumber)
/onto% penggunaan ion exchange lain yaitu pada
proses so!tening(pelunakan) air dan #uga demineralisasi air.
Proses so!tening air adala% proses meng%ilangkan 5at75at kimia
pengeras air yakni ion kalsium dan magnesium. ,edangkan
proses demineralisasi adala% proses meng%ilangkan seluru%
kandungan ion7ion mineral yang terlarut di dalam air.
Pertukaran Kation Pada Proses ,oftening +ir
(Sumber)
!ika R adala% senyaa resin, maka reaksi pertukaran ion kalsium
yang ter#adi pada proses so!tening air adala% sebagai berikut)
- ;"a P /a
PP
Q ;-/a P - "a
P
Pada proses so!tening air, pertukaran ion ter#adi pada saat air
dengan kandungan ion kalsium (/a
-P
) dan magnesium (Mg
-P
)
meleati gugusan resin kation. Pada aalnya molekul resin
mengikat lema% ion sodium ("a
P
), dan karena ion molekul resin
memiliki gaya tarik7menarik yang lebi% kuat dengan ion kalsium
dan magnesium, maka ter#adila% proses pertukaran ion. Molekul
resin melepas ion sodium ke dalam air, diikuti dengan pengikatan
ion kalsium dan magnesium ke molekul resin.
Pertukaran Ion Pada Proses 4emineralisasi +ir
(Sumber)
,edikit berbeda dengan proses demineralisasi air, pada u#ung
rangkaian, molekul resin berikatan dengan ion &
P
dan 2&
7
. Pada
saat air meleati gugusan resin, akan ter#adi pengikatan ion7ion
mineral yang terlarut di dalam air karena molekul resin memiliki
gaya tarik7menarik lebi% besar dengan ion molekul daripada ion
&
P
dan 2&
7
. !ika R" #
$%
" dan &
$-
adala% berturut7turut molekul ion
resin, ion mineral positif, dan ion mineral negatif, maka reaksi ion
exchangeyang ter#adi pada proses demineralisasi air yakni
sebagai berikut)
- ;7& P K
-P
Q ;-K P - &
P
- ;72& P +
-7
Q ;-+ P - 2&
7
"ampak pada reaksi di atas ba%a pada proses demineralisasi
air, resin akan mengikat ion7ion mineral dan melepas ion7ion
&
P
dan 2&
7
. ,elan#utnya ion7ion tersebut akan salin berikatan
untuk membentuk molekul &-2 baru.
&
P
P 2&
7
Q &-2
Pada tiap proses pertukaran ion, dilakukan regenerasi resin #ika
resin suda% #enu%. !enu% berarti keseluru%an molekul resin tela%
berikatan dengan ion7ion sasaran. Pada proses so!tening air, resin
dikatakan #eni% #ika keseluru%an molekul resin tela% berikatan
dengan ion kalsium atau magnesium. !enu%nya resin ditandai
dengan air output dari kolom resin masi% mengandung ion7ion
kalsium dan magnesium.
$ntuk melakukan regenerasi, pada proses so!tening air
dibutu%kan larutan garam "a/l pekat yang dialirkan meleati
resin. 6arutan "a/l ini biasanya *::: kali lebi% pekat dari larutan
"a/l biasa.
;-/a P - "a/l Q - ;"a P /a/l-
,edangkan pada proses demineralisasi digunakan larutan asam
kuat seperti &-,20 dan #uga larutan basa kuat seperti "a2& untuk
meregenerasi resin demineralisasi air. $ntuk lebi% dalam
memba%as proses demineralisasi
HPLC (High Performance Liqid Chromatography!
44.56 0-1&)!- 57 omments
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1!"#an dan a$a% tahun 1&"#an' (aat ini) HPLC merupakan
teknik pemisahan yang diterima secara %uas untuk ana%isis bahan obat) baik da%am bu%k atau da%am sediaan
farmasetik'
SISTEM PERALATAN HPLC
*nstrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas+ $adah fase gerak) pompa) a%at untuk memasukkan sampe%
(tempat injeksi)) ko%om) detektor) $adah penampung buangan fase gerak) dan suatu komputer atau integrator
atau perekam'
,iagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini +
1' -adah .ase gerak dan .ase gerak
-adah fase gerak harus bersih dan %embam (inert)' -adah pe%arut kosong ataupun %abu %aboratorium dapat
digunakan sebagai $adah fase gerak' -adah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai / %iter
pe%arut(1)'
.ase gerak atau e%uen biasanya terdiri atas campuran pe%arut yang dapat bercampur yang secara kese%uruhan
berperan da%am daya e%usi dan reso%usi' ,aya e%usi dan reso%usi ini ditentukan o%eh po%aritas kese%uruhan
pe%arut) po%aritas fase diam) dan sifat komponen#komponen sampe%' 0ntuk fase norma% (fase diam %ebih po%ar
daripada fase gerak)) kemampuan e%usi meningkat dengan meningkatnya po%aritas pe%arut' (ementara untuk
fase terba%ik (fase diam kurang po%ar daripada fase gerak)) kemampuan e%usi menurun dengan meningkatnya
po%aritas pe%arut'
.ase gerak sebe%um digunakan harus disaring ter%ebih dahu%u untuk menghindari partike%#partike% keci% ini'
(e%ain itu) adanya gas da%am fase gerak juga harus dihi%angkan) sebab adanya gas akan berkumpu% dengan
komponen %ain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan ana%isis'
1%usi dapat di%akukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap se%ama e%usi) atau dengan cara
bergradien (komposisi fase gerak berubah#ubah se%ama e%usi) yang ana%og dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas' 1%usi bergradien digunakan untuk meningkatkan reso%usi campuran yang komp%eks terutama
jika sampe% mempunyai kisaran po%aritas yang %uas'2)

.ase gerak yang pa%ing sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terba%ik ada%ah campuran %arutan bufer
dengan metano% atau campuran air dengan asetonitri%' 0ntuk pemisahan dengan fase norma%) fase gerak yang
pa%ing sering digunakan ada%ah campuran pe%arut#pe%arut hidrokarbon dengan pe%arut yang terk%orisasi atau
menggunakan pe%arut#pe%arut jenis a%koho%' Pemisahan dengan fase norma% ini kurang umum dibanding dengan
fase terba%ik'/)
/' Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC ada%ah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat $adah
pe%arut yakni+ pompa harus inert terhadap fase gerak' 3ahan yang umum dipakai untuk pompa ada%ah ge%as)
baja tahan karat) Tef%on) dan batu ni%am' Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 4""" psi dan mampu menga%irkan fase gerak dengan kecepatan a%ir 5 mL6menit' 0ntuk tujuan
preparatif) pompa yang digunakan harus mampu menga%irkan fase gerak dengan kecepatan /" mL6menit'
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak ada%ah untuk menjamin proses penghantaran
fase gerak ber%angsung secara tepat) reprodusibe%) konstan) dan bebas dari gangguan' 7da / jenis pompa
da%am HPLC yaitu+ pompa dengan tekanan konstan) dan pompa dengan a%iran fase gerak yang konstan' Tipe
pompa dengan a%iran fase gerak yang konstan sejauh ini %ebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan
tekanan konstan'!)
5' Tempat penyuntikan sampe%
(ampe%#sampe% cair dan %arutan disuntikkan secara %angsung ke da%am fase gerak yang menga%ir di ba$ah
tekanan menuju ko%om menggunakan a%at penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup tef%on
yang di%engkapi dengan ke%uk sampe% (samp%e %oop) interna% atau eksterna%'
Posisi pada saat memuat sampe% Posisi pada saat menyuntik sampe%
2' Ko%om dan .ase diam
7da / jenis ko%om pada HPLC yaitu ko%om kon8ensiona% dan ko%om mikrobor' Ko%om merupakan bagian HPLC
yang mana terdapat fase diam untuk ber%angsungnya proses pemisahan so%ut6ana%it'
Ko%om mikrobor mempunyai 5 keuntungan yang utama dibanding dengan ko%om kon8ensiona%) yakni+
Konsumsi fase gerak ko%om mikrobor hanya 9": atau %ebih keci% dibanding dengan ko%om kon8ensiona%
karena pada ko%om mikrobor kecepatan a%ir fase gerak %ebih %ambat (1" #1"" ;%6menit)'
7danya a%iran fase gerak yang %ebih %ambat membuat ko%om mikrobor %ebih idea% jika digabung dengan
spektrometer massa'
(ensiti8itas ko%om mikrobor ditingkatkan karena so%ut %ebih pekat) karenanya jenis ko%om ini sangat
bermanfaat jika jum%ah sampe% terbatas misa% sampe% k%inis'
<eskipun demikian) da%am prakteknya) ko%om mikrobor ini tidak setahan ko%om kon8ensiona% dan kurang
bermanfaat untuk ana%isis rutin'5=
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa si%ika yang dimodifikasi secara kimia$i) si%ika yang tidak dimodifikasi)
atau po%imer#po%imer stiren dan di8ini% ben>en' Permukaan si%ika ada%ah po%ar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus si%ano% ((i#?H)'
(i%ika dapat dimodifikasi secara kimia$i dengan menggunakan reagen#reagen seperti k%orosi%an' @eagen#reagen
ini akan bereaksi dengan gugus si%ano% dan menggantinya dengan gugus#gugus fungsiona% yang %ain'
?ktadesi% si%ika (?,( atau C19) merupakan fase diam yang pa%ing banyak digunakan karena mampu
memisahkan senya$a#senya$a dengan kepo%aran yang rendah) sedang) maupun tinggi' ?kti% atau rantai a%ki%
yang %ebih pendek %agi %ebih sesuai untuk so%ut yang po%ar' (i%ika#si%ika aminopropi% dan sianopropi% (nitri%) %ebih
cocok sebagai pengganti si%ika yang tidak dimodifikasi' (i%ika yang tidak dimodifikasi akan memberikan $aktu
retensi yang ber8ariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan'
4' ,etektor HPLC
,etektor pada HPLC dike%ompokkan menjadi / go%ongan yaitu+ detektor uni8ersa% (yang mampu mendeteksi >at
secara umum) tidak bersifat spesifik) dan tidak bersifat se%ektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massaA dan go%ongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi ana%it secara spesifik
dan se%ektif) seperti detektor 0B#Bis) detektor f%uoresensi) dan e%ektrokimia'
*dea%nya) suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut+
8. <empunyai respon terhadap so%ut yang cepat dan reprodusibe%'
2. <empunyai sensitifitas yang tinggi) yakni mampu mendeteksi so%ut pada kadar yang sangat keci%'
9. (tabi% da%am pengopersiannya'
5. <empunyai se% 8o%ume yang keci% sehingga mampu meminima%kan pe%ebaran pita'
7. (igna% yang dihasi%kan berbanding %urus dengan konsentrasi so%ut pada kisaran yang %uas (kisaran
dinamis %inier)'
:. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan a%ir fase gerak'/)
3eberapa detektor yang pa%ing sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut +
4etektor ,ensitiftas Kisaran Karakteristik
(gHml) linier
Absorbansi Uv-
vis
(otometer flter
,pektrofotometer
spektrometer ph
oto7diode array
1 D *:
7*:
1 D *:
7*:
R - D *:
7*:
*:
0
*:
1
*:
1
,ensiti<itas bagus, paling
sering digunakan, selektif
ter%adap gugus7gugus dan
struktur7struktur yang tidak
#enu%.
(luoresensi *:
7*-
*:
0
,ensitiftas sangat bagus,
selektif, Tidak peka ter%adap
peruba%an su%u dan
kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias 1 D *:
7A
*:
0
&ampir bersifat uni<ersal akan
tetapi sensiti<itasnya sedang.
,angat sensitif ter%adap su%u,
dan tidak dapat digunakan
pada elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri
+mperometri
*:
7S
*:
7*-
*:
0
*:
1
Peka ter%adap peruba%an
su%u dan kecepatan alir fase
gerak, tidak dapat digunakan
pada elusi bergradien. &anya
mendeteksi solut7solut ionik.
,ensitiftas sangat bagus,
selektif tetapi timbul masala%
dengan adanya kontaminasi
elektroda.
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat di%akukan dengan fase norma% (jika fase diamnya %ebih po%ar dibanding dengan
fase geraknya) atau fase terba%ik (jika fase diamnya kurang non po%ar dibanding dengan fase geraknya)'
3erdasarkan pada kedua pemisahan ini) sering ka%i HPLC dike%ompokkan menjadi HPLC fase norma% dan HPLC
fase terba%ik'
(e%ain k%asifikasi di atas) HPLC juga dapat dike%ompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi so%ut) dengan jenis#jenis HPLC sebagai berikut+
1' Kromatografi 7dsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi te%ah diketahui sebagaimana da%am kromatografi ko%om dan kromatografi %apis
tipis' Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase norma% dengan menggunakan fase diam
si%ika ge% dan a%umina) meskipun demikian sekitar ": kromatografi ini memakai si%ika sebagai fase diamnya'
Pada si%ika dan a%umina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan so%ut' Cugus si%ano% pada si%ika
mempunyai reaktifitas yang berbeda) karenanya so%ut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan
puncak yang berekor'5)
/' Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini ada%ah si%ika yang dimodifikasi secara kimia$i atau fase terikat' (ejauh
ini yang digunakan untuk memodifikasi si%ika ada%ah hidrokarbon#hidrokarbon non#po%ar seperti dengan
oktadesi%si%ana) oktasi%ana) atau dengan feni%' .ase diam yang pa%ing popu%er digunakan ada%ah oktadesi%si%an
(?,( atau C19) dan kebanyakan pemisahannya ada%ah fase terba%ik'
(ebagai fase gerak ada%ah campuran metano% atau asetonitri% dengan air atau dengan %arutan bufer' 0ntuk
so%ut yang bersifat asam %emah atau basa %emah) peranan pH sangat krusia% karena ka%au pH fase gerak tidak
diatur maka so%ut akan menga%ami ionisasi atau protonasi' Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi %ebih %emah dibanding jika so%ut da%am bentuk spesies yang
tidak terionisasi karenanya spesies yang menga%ami ionisasi akan tere%usi %ebih cepat'5)
5' Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak' 7da
banyak penukar ion yang beredar di pasaran) meskipun demikian yang pa%ing %uas penggunaannya ada%ah
po%istiren resin'
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion di%akukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya'
,a%am beberapa ha% digunakan pe%arut campuran misa%nya air#a%koho% dan juga pe%arut organik' Kromatografi
penukar ion dengan fase gerak air) retensi puncak dipengaruhi o%eh kadar garam tota% atau kekuatan ionik
serta o%eh pH fase gerak' Kenaikan kadar garam da%am fase gerak menurunkan retensi so%ut' Ha% ini disebabkan
o%eh penurunan kemampuan ion sampe% bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin'
2' Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampe%#sampe% ionik dan mengatasi
masa%ah#masa%ah yang me%ekat pada metode penukaran ion' (ampe% ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang ber%a$anan'/)
4' Kromatografi 1ksk%usi 0kuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi ge% dan dapat digunakan untuk memisahkan atau
mengana%isis senya$a dengan berat mo%eku% D /""" da%ton'
.ase diam yang digunakan dapat berupa si%ika atau po%imer yang bersifat porus sehingga so%ut dapat me%e$ati
porus (%e$at diantara partike%)) atau berdifusi %e$at fase diam' <o%eku% so%ut yang mempunyai 3< yang jauh
%ebih besar) akan tere%usi ter%ebih dahu%u) kemudian mo%eku%#mo%eku% yang ukuran medium) dan terakhir
ada%ah mo%eku% yang jauh %ebih keci%' Ha% ini disebabkan so%ut dengan 3< yang besar tidak me%e$ati porus)
akan tetapi %e$at diantara partike% fase diam' ,engan demikian) da%am pemisahan dengan eksk%usi ukuran ini
tidak terjadi interaksi kimia antara so%ut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang %ain'
!' Kromatografi 7finitas
,a%am kasus ini) pemisahan terjadi karena interaksi#interaksi biokimia$i yang sangat spesifik' .ase diam
mengandung gugus#gugus mo%eku% yang hanya dapat menyerap sampe% jika ada kondisi#kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada sampe% yang sesuai (sebagaimana da%am interaksi antara antigen dan
antibodi)'
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengiso%asi protein (en>im) dari campuran yang sangat
komp%eks'/)
DERIVATISASI PADA HPLC
,eri8atisasi me%ibatkan suatu reaksi kimia antara suatu ana%it dengan suatu reagen untuk mengubah sifat
fisika#kimia suatu ana%it' Tujuan utama penggunaan deri8atisasi pada HPLC ada%ah untuk+
8. <eningkatkan deteksi
2. <erubah struktur mo%eku% atau po%aritas ana%it sehingga akan menghasi%kan puncak kromatografi yang
%ebih baik
9. <erubah matriks sehingga dipero%eh pemisahan yang %ebih baik
5. <enstabi%kan ana%it yang sensitif'4)
,etektor yang pa%ing banyak digunakan da%am HPLC ada%ah detektor 0B#Bis sehingga banyak metode yang
dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang
ge%ombang tertentu' ,i samping itu) juga dikembangkan suatu metode untuk menghasi%kan f%uorofor (senya$a
yang mamapu berf%uoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan f%uorometri'&)
(uatu reaksi deri8atisasi harus mempunyai syarat#syarat sebagai berikut) yakni+ produk yang dihasi%kan harus
mampu menyerap baik sinar u%tra8io%et atau sinar tampak atau dapat membentuk senya$a berf%uoresen
sehingga dapat dideteksi dengan spektrof%uorometriA proses deri8atisasi harus cepat dan menghasi%kan produk
yang sebesar mungkin (1"" :)A produk hasi% deri8atisasi harus stabi% se%ama proses deri8atisasi dan deteksiA
serta sisa pereaksi untuk deri8atisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi'&)
3erbagai macam bahan penderi8at te%ah tersedia antara %ain +
Lugus fungsional ;eagen untuk dapat dideteksi
dengan $=7=is
;eagen untuk dapat
dideteksi dengan
(luoresen
+sam7asam
kaboksilat; asam7
asam
lemak;asam7
asam fosfat
p7nitroben5il7'"'(7
diisopropilisourea (P"'4I); .,17
dinitroben5il7","T7
diisopropilisourea (4"'4I); p7
bromofenasil bromida (P'P')
07bromometil7A7
asetoksikumarin;
07bromometil7A7
metoksikumarin;
+lko%ol .,17dinitroben5il klorida
(4"'/); 07
dimetilaminia5oben5en707
sulfnil (4absyl7/l); *7
naftilisosianat ("I/7*).
+lde%id; keton p7nitroben5iloksiamin
%idroklorida (P"'+); .,17
dinitroben5iloksiamin
%idroklorida (4"'+);
4ansil %idra5in
+min primer (luoresamin
o7ftalalde%id (2P+)
+min primer (*
o
)
dan sekunder
(-
o
)
.,17dinitroben5il klorida
(4"'/); '-suksinimidil7p7
nitrofenilasetat (,"P+); '-
suksinimidil7)"*7
dinitrofenilasetat (,4"P+); 07
dimetilaminia5oben5en707
sulfnil (4absyl7/l); *7
naftilisosianat ("I/7*).
A7kloro707nitroben5o7-7
oksa7*,.7dia5ol ("'47/l);
A73uoro707nitroben5o7-7
oksa7*,.7dia5ol ("'47();
4ansil klorida
+sam7asam
amino (peptida)
07dimetilaminia5oben5en707
sulfnil (4absil7/l)
(luoresamin
o7ftalalde%id (2P+)
A7kloro707nitroben5o7-7
oksa7*,.7dia5ol ("'47/l);
A73uoro707nitroben5o7-7
oksa7*,.7dia5ol ("'47();
,eri8atisasi ini dapat di%akukan sebe%um ana%it memasuki ko%om (pre#co%umn deri8ati>ation) atau sete%ah ana%it
ke%uar dari ko%om (post#co%umn deri8ati>ation)'
Kromatografi Interaksi Hidrofobik
$romatografi interaksi hidrofobik merupakan
metode pemisahan berdasarkan perbedaan
hidrofobisitas pada permukaan protein. 'al ini
bergantung pada interaksi hidrofobik antara permukaan
protein dengan gugus hidrofobik yang terikat seara
ko+alen pada matriks (&tandburry dan ;hitaker, 86<5).
Pada kondisi kekuatan ion yang tinggi, protein
atau enzim akan terikat kuat pada matriks melalui
interaksi hidrofobik, hal seperti ini dapat terlihat pada
gambar 6. (atriks yang umum digunakan bersifat
nonpolar, turunan jenis sefarosa yakni fenil sefarosa
atau butil sefarosa (=oe, 86<6> &uhartono, 86<6).

?ambar 6. Prinsip kerja $romatografi interaksi
hidrofobik($oelman dan =oehm, 2447)
&uatu ampuran protein dimasukkan ke dalam
kolom interaksi hidrofobik dalam kondisi ionik yang
tinggi. Pada kekuatan ion yang tinggi protein terikat kuat
pada matriks melalui interaksi hidrofobik. &emakin
hidrofobik suatu protein, maka semakin kuat ikatannya.
Protein yang terikat pada matriks dapat terlepas jika
dielusi dengan eluen yang kekuatan ionnya semakin
menurun yaitu dengan konsentrasi garam dari tinggi ke
yang lebih rendah (=oe, 86<6).