UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO ACADMICO DE MICROBIOLOGA
Y PARASITOLOGA


Eficiencia de la biorremediacin de suelos contaminados con
petrleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel,
departamento de Lambayeque, 2011

TESIS

PARA OPTAR EL TTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN
BIOLOGA MICROBIOLOGA PARASITOLOGA

PRESENTADO POR:

Br. Cinthya Jaqueline Llanos Olivera




LAMBAYEQUE PER
2012




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I. INTRODUCCIN

En el Per, al igual que en varios pases del mundo la extraccin del crudo de
petrleo es una actividad econmica muy importante, que genera divisas y elevadas
ganancias, razn por la cual se le atribuye la denominacin de oro negro. El crudo de
petrleo es utilizado para la elaboracin de diversos combustibles, entre los que se
encuentra el petrleo Diesel, que constituye la principal fuente de energa, tanto
industrial como domstica, habindose registrado en el Per 18,6 millones de barriles
de produccin acumulada hasta abril del presente ao (Sociedad Nacional de Minera,
Petrleo y Energa, 2011).
Para obtener Diesel el petrleo pasa por diversas etapas de refinera y durante el
proceso pueden ocurrir derrames por mala manipulacin o desperfectos mecnicos;
sin embargo, stos son menores si se comparan con los que se producen durante la
extraccin del crudo de pozos petroleros, que se pueden encontrar en mar abierto o
suelo territorial. Inclusive, pueden existir derrames o filtracin cuando el producto es
almacenado en pozos subterrneos, contaminando el suelo adyacente, como sucede
en los grifos.
La contaminacin ambiental por petrleo constituye una amenaza para la salud de
los humanos, as como vegetales y animales. Esta problemtica es un tema que en los
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ltimos aos ha sido preocupacin del Estado y de los involucrados en la industria
hidrocarburfica, por cuanto el uso indiscriminado e inadecuado manejo y disposicin
del petrleo ha generado daos al ambiente y riesgos tecnolgicos. Anteriormente, las
industrias no tenan mayor problema para eliminar sus residuos puesto que eran
vertidos en los cauces de los ros o dejados a la intemperie; sin embargo, cuando la
velocidad de produccin de residuos super la velocidad de degradacin en el
ambiente, surgi la contaminacin, y con ello la prdida de especies animales y
vegetales.
En el suelo los hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmsfera,
iniciando una serie de procesos fsico-qumicos simultneos como evaporacin y
penetracin, que dependiendo del tipo de hidrocarburo, temperatura, humedad, textura
del suelo y cantidad vertida pueden ser ms o menos lentos, ocasionando una mayor
toxicidad, adems de tener una moderada, alta o extrema salinidad, que dificulta su
tratamiento. Altos gradientes de salinidad pueden destruir la estructura terciaria de las
protenas, desnaturalizar enzimas y deshidratar clulas, lo cual es letal para muchos
microorganismos usados para el tratamiento de aguas y suelos contaminados.
Se ha determinado que en el suelo existen microorganismos, en especial las
bacterias, que pueden utilizar el petrleo como fuente de carbono y energa, debido a
que presentan peroxidasas y oxigenasas que permiten la oxidacin de los
hidrocarburos, cambiando las propiedades de los compuestos, hacindolos
susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversin a dixido de carbono
y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a la mineralizacin, sino basta
una oxidacin para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en
agua, incrementando su biodisponibilidad; no obstante, en el departamento de
Lambayeque, se desconocen las caractersticas de las bacterias degradadoras de
petrleo que se encuentran en los suelos contaminados; as como tampoco se ha
investigado su eficiencia en la biorremediacin.

Pimentel es un distrito turstico por sus playas que atraen visitantes y que a su vez
generan ingresos econmicos para el desarrollo local; sin embargo, existen zonas
contaminadas por hidrocarburos, donde anteriormente se recepcion y almacen
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petrleo para su posterior distribucin. Debido al impacto ambiental negativo, los
derrames de hidrocarburos ocasionan daos econmicos, sociales y de salud pblica
en las zonas aledaas al lugar afectado, lo que hace necesario el uso de tcnicas para
su eliminacin, pero por su elevado costo econmico es necesario, buscar alternativas
viables que sean ambientalmente correctas, simples y econmicas. La biorremediacin
o utilizacin de microorganismos como las bacterias que metabolizan petrleo como
fuente de carbono y energa, constituye una alternativa saludable frente al deterioro
progresivo de la calidad del ambiente por el derramamiento de crudos, permitiendo la
biodegradacin de los hidrocarburos y recuperacin de los suelos contaminados. La
efectividad se incrementa con la bioaumentacin o aplicacin de bacterias propias de
los suelos, adaptadas a las condiciones ecolgicas. El conocimiento de las
caractersticas de las bacterias nativas degradadoras de petrleo permitir
incrementarlas y comercializarlas para la biorremediacin de suelos contaminados con
hidrocarburos en el departamento Lambayeque.
Bajo el enfoque expuesto, se formul el siguiente problema: Cul es la
eficiencia (%) de la biorremediacin de suelos contaminados con petrleo por
bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque? La
hiptesis planteada fue: La eficiencia de la biorremediacin ser mayor de 30 % en
suelos contaminados con petrleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel,
departamento de Lambayeque. El objetivo general del presente estudio fue determinar
la eficiencia de la biorremediacin de suelos contaminados con petrleo por bacterias
nativas seleccionadas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque. Los
objetivos especficos fueron: aislar bacterias hetertrofas en suelos contaminados con
petrleo en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque; caracterizar las
bacterias nativas y seleccionar para la biorremediacin diez de ellas, cinco por requerir
el menor tiempo para la utilizacin de petrleo como fuente de carbono y energa, y
cinco bacterias por alcanzar el mayor nmero de unidades de actividad emulsificante
(UAE); identificar a nivel de gnero las dos bacterias nativas degradadoras de petrleo
con el mayor ndice de germinacin en Lactuca sativa L. lechuga y determinar su
eficiencia en la biorremediacin de suelos contaminados con petrleo.

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II. ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS

2.1. Petrleo
La palabra petrleo proviene de petro (piedra) y oleo (aceite), o sea aceite
de piedra. Es un lquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por
diferentes sustancias orgnicas. Se encuentra en grandes cantidades bajo la
superficie terrestre y se emplea como combustible y materia prima para la industria
qumica. Los alcanos son la familia ms numerosa en el petrleo crudo y se conocen
como parafinas, pueden ser lineales o ramificados y su longitud vara entre 1 a
40 carbonos, aunque se ha logrado detectar cadenas de 60 carbonos. Los ciclos
pueden ser saturados, donde varios carbonos se unen entre s por medio de enlaces
sencillos, o pueden ser aromticos, donde algunos carbonos del ciclo estn unidos
por enlaces dobles. Los ciclosaturados se conocen como ciclo-alcanos, ciclo-parafinas
o naftenos y son un componente minoritario del petrleo crudo. Los compuestos
aromticos son derivados del benceno, un anillo de seis carbonos unidos por tres
enlaces sencillos y tres enlaces dobles alternados. Los anillos pueden encontrarse
fusionados entre ellos o sustituidos con cadenas alifticas. Los hidrocarburos
policclicos aromticos (HAP`s) o polincleoaromticos comprenden entre 10 a 25 %
del petrleo crudo y son las fracciones ms pesadas (Arboleda y Bravo, 2008).

El trmino hidrocarburos totales de petrleo (TPH) se usa para describir a un
grupo extenso de sustancias qumicas derivadas originalmente del petrleo. Algunos
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TPH son lquidos incoloros o de color claro, que se evaporan fcilmente, mientras
que otros son lquidos espesos de color oscuro o semislidos que no se evaporan.
Los TPH que son liberados al suelo pueden movilizarse hacia el agua subterrnea,
donde los componentes individuales pueden separarse de la mezcla original,
dependiendo de las propiedades qumicas de cada uno; algunos de estos
componentes se evaporan en el aire y otros se disuelven en el agua subterrnea
alejndose del rea donde fueron liberados. Otros compuestos se adhieren a
partculas en el suelo y pueden permanecer as mucho tiempo, mientras que otras
sern degradadas por microorganismos (Escorza, 2007).

El petrleo est constituido por distintas fracciones de hidrocarburos. La
fraccin de alifticos (con 18 a 35 tomos de carbono llamados parafinas), aromticos
(con uno o ms anillos como benceno, naftaleno, y fenantreno), los polares, es decir
asfaltenos altamente condensados y las resinas. El petrleo tambin posee
compuestos orgnicos con sulfuro, nitrgeno, oxgeno, y constituyentes metlicos en
poca proporcin. Debido a la complejidad de la composicin del petrleo, la
biodegradacin por parte de las bacterias depender de las proporciones que tenga
cada una de sus fracciones (Acua et al., 2010). Los hidrocarburos son susceptibles a
la biodegradacin dependiendo del tamao y tipo de molcula. Los alcanos de cadena
larga son ms resistentes a la biodegradacin, a medida que la longitud de su cadena
aumenta y cuando alcanzan un peso molecular superior a 500 ya no constituyen una
fuente de carbono para el crecimiento microbiano. En general, la presencia de
ramificaciones reduce la tasa de biorremediacin porque los tomos de carbono
terciario y cuaternario interfieren con los mecanismos de degradacin o los bloquean
totalmente (Elvira, 2009).

2.2. Bacterias degradadoras de petrleo
Se ha detectado una variedad de bacterias que crecen en n- alcanos de
cadena lineal de 11-19 carbonos del petrleo entre las que se encuentran
Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Nocardia y Mycobacterium. Los
n- alcanos largos ( 20 C) generalmente son slidos a temperatura ambiental, y no
estn fcilmente disponibles para la microbiota degradadora. Los alcanos cclicos y
ramificados son oxigenados por cepas especializadas de Mycobacterium,
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Pseudomonas, siendo estas ltimas objeto de estudios intensos en virtud a su
capacidad para oxidar compuestos aromticos (Grant y Long, 1981).
En muestras de agua de una poza de oxidacin del Dren 1000, se aislaron
bacterias degradadoras de petrleo, siendo identificadas como Pseudomonas: 40 %,
Acinetobacter: 29,67 %, Xanthomonas: 16,67 %, Alcaligenes: 13,33 % y
Enterobacter: 3,33 % (Mendoza e Izusqui, 1999). Asimismo, en muestras de agua
contaminadas por petrleo se identificaron Acinetobacter, Corynebacterium,
Pseudomonas, Aeromonas, Neisseria y Streptomyces (Merino et al., 2002). Por su
parte, Mendoza e Yzusqui (1999) y Escalante (2002), identificaron como
degradadoras de petrleo Pseudomonas aeruginosa, P. acidovorans, P. mallei,
P. cepacia y P. pseudomallei.

En suelo contaminado con agua de produccin o residuo generado por la
industria petrolera, sometido a biorremediacin microbiana durante 1 ao y despus
a fitorremediacin, se tomaron muestras y fueron aisladas las especies bacterianas
P. vesicularis, Sphingomonas paucimobilis, Micrococcus sp., M. varians, M. roseus y
M. sedentarius (Altamirano y Pozzo, 2000). A su vez, en muestras slidas y lquidas,
consistentes de borras y aguas de pozas de sedimentacin y decantacin
(purificacin secundaria) se aislaron e identificaron Pseudomonas, Bacillus,
Beijerinckia, Xanthobacter, Derxia y otros especmenes con caractersticas similares
al gnero Azotobacter (Guerra et al., 1997).
2.3. Biorremediacin de petrleo
El trmino biorremediacin hace referencia a la eliminacin del petrleo u otros
contaminantes mediante el uso de entes biolgicos. En la eliminacin de petrleo
ste es oxidado hasta dixido de carbono. Cuando se producen grandes vertidos, las
fracciones de hidrocarburo voltiles se evaporan rpidamente quedando los
compuestos aromticos y alifticos que sern eliminados por los organismos. En
condiciones ideales hasta un 80 % de los componentes no voltiles son oxidados por
bacterias en los 6 primeros meses; sin embargo, determinadas fracciones como los
hidrocarburos con cadenas laterales y los hidrocarburos policclicos permanecen en
el ambiente por ms tiempo. El petrleo que alcanza los sedimentos es degradado
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muy lentamente y causa un impacto significativo a largo plazo en la pesca y en otras
actividades que dependen de aguas no contaminadas (Madigan et al., 2004).
La biorremediacin puede ser clasificada de acuerdo al organismo que
efecta la degradacin del contaminante. La fitorremediacin es el uso de plantas
para la remocin de metales pesados. Tambin se pueden utilizar animales como
Lumbricus terrestris lombriz de tierra, que absorbe metales pesados a travs de los
tejidos y los acumula en las vas digestivas. A su vez, las bacterias son las ms
empleadas en el proceso de biorremediacin, aunque tambin se emplean hongos,
algas y cianobacterias. La biorremediacin del suelo puede ser in situ y ex situ. In situ
corresponde a los tratamientos que no requieren excavaciones del suelo
contaminado. Por su parte, ex situ implica la excavacin del suelo o el material a
tratar y el manejo en un sistema controlado como una celda de landfarming o algn
tipo de biorreactor (Benavides et al., 2006).
Entre 1993 y 1998 se llevaron a cabo trabajos de investigacin, con la finalidad
de crear y adoptar una tecnologa para la recuperacin de reas afectadas por la
actividad petrolera en la cuenca del golfo San Jorge en Patagonia, Argentina.
Inmediatamente despus de producido el derrame por ruptura de un oleoducto se
recuper la mayor cantidad de petrleo mediante bombeo con camiones cisterna.
Luego se delimitaron doce parcelas de 8 x 3 m, equivalentes a cuatro tratamientos
ubicados al azar con tres repeticiones cada uno; y consistentes en T1= testigo (sin
fertilizante); T2= 30 unidades de nitrgeno y 30 de fsforo (59 kg ha
-1
de rea, 46 %
de N y 65 kg ha
-1
de fosfato diamnico; 18:46:0); T3= 60 unidades de N y 60 de P;
T4= 90 unidades de nitrgeno y 90 de fsforo. Las dosis fueron divididas en cuatro
aplicaciones que fueron incorporadas en un laboreo con cincel hasta una profundidad
de 20 o 30 cm cada 30 das. Segn los resultados; antes de efectuar la primera
fertilizacin y utilizar el cincel en la remocin, los hidrocarburos iniciales oscilaron
entre 12,8 a 15,3 %, pero a medida que transcurrieron los meses el porcentaje
disminuy hasta 5-7 %. Cuando finalizaron las evaluaciones, despus de 1 ao los
tratamientos con 60 y 90 unidades de N y P biodegradaron el petrleo un 60 % ms
que el testigo y 30 unidades de N y P (Luque et al., 2000).
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Se llev a cabo la recuperacin de suelos de una playa utilizando
Pseudomonas sp., aislada de agua contaminada con petrleo. Con el uso del
software Statgraphies v 6,0 se determin que con la concentracin de carbonato de
calcio 0,01 M se obtuvo la mayor eficiencia de biodegradacin con un mximo de
101,14 % y un mnimo de 75,66 %. Asimismo, para la concentracin de sustrato
1,45 ppm se tuvo una eficiencia mxima de 101,34 % y un mnimo de 82,21 % y para
la concentracin de inculo 10
8
un mximo de 101,78 % y un mnimo de 73,57 %
(Morales, 2003). Por su parte, Prudencio (2001), evalu seis cepas bacterianas en
suelo contaminado con petrleo crudo agregando 1 L m
-2
del consorcio bacteriano
biorremediador. Para oxigenar el sistema, realiz la mezcla con posterior arado y
finalmente el trillado diariamente durante el primer mes del tratamiento y
semanalmente durante los meses siguientes. Los anlisis efectuados en campo
demostraron la disminucin en la concentracin de hidrocarburos totales de petrleo
(TPH) desde 7,45 hasta 4,09 %, lo que signific un 40 % de reduccin del
contaminante con 16 das de tratamiento, cumplindose con la legislacin peruana
que denota para lugares contaminados una concentracin de TPH menor de 5 %.
Para el tratamiento biolgico de lodos de refinera se utiliz la tcnica de
Landfarming, que consiste en un vertido controlado de hidrocarburos sobre una
superficie de terreno, el cual se somete a un proceso de remocin mediante arado y
riego superficial con agregado de fertilizantes, con o sin incorporacin de
microorganismos. Los ensayos se realizaron en ocho parcelas de 2,5 por 4 m con un
promedio de 0,06 % de nitrgeno total; 1,95 ppm de fsforo; 0,03 % de materia
orgnica y un pH de 7,2. Las parcelas fueron sometidas a remocin a una
profundidad de 20 cm. Utilizando palas se distribuyeron sobre ellas los residuos
slidos (10 kg m
-2
), que posteriormente fueron cubiertos con una capa fina de tierra.
Dos de las parcelas se utilizaron como testigo (sin inoculacin) y las seis restantes
fueron inoculadas con tres cultivos bacterianos en la cantidad de 170 L, distribuidos
uniformemente mediante riegos con manguera. El laboreo superficial se realiz con
una frecuencia mensual a una profundidad de 20 a 25 cm y la frecuencia de riego fue
semanal. Para un perodo de 6 meses el porcentaje de hidrocarburos consumidos fue
41,16 en las parcelas testigo y entre 61,83 a 72,80 % en las parcelas tratadas.
10

El contenido de hidrocarburos mostr en la parcela testigo un perodo de latencia de
2 meses, el cual no se observ en las parcelas inoculadas donde se inici la
degradacin inmediatamente. Asimismo, para obtener una depuracin de
aproximadamente un tercio del residuo se requirieron 5,4 meses en la parcela no
inoculada y 2 meses en las inoculadas, lo que signific una eficiencia depurativa
2,7 meses mayor con la aplicacin de microorganismos (Ercoli et al., 1995a).

Para el tratamiento de los residuos semislidos de oleoductos, se propuso la
biodegradacin ex situ, en suelos especialmente acondicionados con agregados de
microorganismos. Se seleccion una parcela de 100 m
2
, donde se acondicionaron
900 m
2
y se efectu el ensayo sobre 300 m
2
. Para evitar contaminacin de acuferos
se coloc una lmina de polietileno de 200 micrones de espesor a 50 cm de
profundidad, se incorporaron 50 kg ha
-1
de fsforo as como 250 kg ha
-1
de nitrgeno
y la parcela fue sometida a remocin hasta una profundidad de 20 a 25 cm por medio
de arado desde el comienzo del ensayo, con una frecuencia de dos veces por mes.
El residuo oleoso fue distribuido en dos partes: 1500 kg en un inicio y una vez seco
despus de un mes se incorpor el 50 % restante totalizando 3000 kg en 300 m
2

(10 kg m
-2
), a continuacin se agreg el cultivo microbiano a razn de 0,5 L m
-2
y
despus de 8 meses se logr una degradacin de 70 % de los hidrocarburos con una
tasa mensual de 8,7 % (Ercoli et al., 1995b).
Suelos contaminados con agua que acompaa al petrleo en su extraccin,
con un contenido promedio de 19,56 % de hidrocarburos totales de petrleo (TPH),
con sitios de acumulacin superficial y costras salinas fueron sometidos a
biorremediacin. Se inici al tratamiento con laboreo agrcola programado, alternando
trabajo en profundidad (labranza profunda con cincel, subsolador y arado de discos)
para descompactar y airear los estratos subsuperficiales con trabajo en superficie
(rastra de discos) para particular, airear y homogenizar la carga contaminante,
asegurando su biodisponibilidad como sustrato degradable por la biota nativa.
Transcurrido 1 ao el contenido promedio de hidrocarburos se redujo a 3,25 %
expresado como TPH residual, con un incremento de la poblacin microbiana
hidrocarburoltica nativa desde 3,2 x 10
2
a 3,5 x 10
5
UFC g
-1
de suelo seco
(Altamirano y Pozzo, 2000).
11

Se realiz un estudio para evaluar el desempeo de un biorreactor agitado y
aireado (CSTR) en la biodegradacin de lodo aceitoso proveniente del tanque de
almacenaje de residuos de una refinera. Se utiliz un consorcio constituido por
microorganismos aislados del propio lodo que fueron cultivados en una concentracin
de 5 % (v/v) de lodo, como nica fuente de carbono y energa. El efluente acuoso fue
reciclado, aumentando la eficiencia del proceso medida por el consumo de
n-parafinas, pristano, fitano, hidrocarburos poliaromticos, aceites y grasas. Las
bacterias fueron predominantes en el proceso, siendo identificadas especies del
gnero Pseudomonas y comprobndose la potencialidad de la utilizacin de
biorreactores para el tratamiento de lodo aceitoso hasta antes considerado xenobitico
(Ururaky et al., 1998).

Se aplic la tcnica de biorremediacin en un rea impactada con 58 barriles
de petrleo crudo de 14 API (petrleo pesado). El rea fue humectada y aireada
peridicamente mediante un tractor con arado de disco e independientemente de las
cantidades iniciales de nutrientes existentes en el suelo se adicionaron urea y diamino
fosfato en las relaciones C:N=60 y C:P=800; correspondientes a 0,22 y 0,047 kg m
-2

de nitrgeno y fsforo, respectivamente. A los 369 das se obtuvo una reduccin de
78,08 % con niveles inferiores a 10 000 mg kg
-1
de TPH (1%), valor recomendado para
suelos contaminados por hidrocarburos por las normas internacionales. Tambin se
observ despus de 265 das un perodo estacionario o de meseta, donde la
disminucin de la concentracin fue inapreciable en lo que se conoce como un perodo
de saturacin. La concentracin de microorganismos hetertrofos se mantuvo durante
todo el proceso entre 10
6
y 10
8
, valores favorables para que se efecte la
biodegradacin. A partir de los 265 das comenz el decrecimiento, coincidiendo con el
perodo de saturacin alcanzado en el nivel de hidrocarburos. Los niveles de
microorganismos degradadores de hidrocarburos oscilaron entre 10
5
y 10
6
hasta los
229 das, superior al rango entre 10
3
y 10
4
recomendado en la literatura para que se
efecte la biorremediacin. Asimismo, el anlisis econmico del proceso de
biorremediacin demostr un valor dentro del rango internacional para estos
tratamientos: 51,10 USD m
-3
(Alfonso, 2005).