Catalina Montenegro Salazar, 124922

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, Microbiologa General.

RESULTADOS (Prctica 7)
Se realizaron siembras en tres medios de cultivo diferentes: agar DNAsa, agar Almidn y agar
Casena a partir de tres cultivos patrn: Serratia marcensis, Bacillus subtilis y Staphylococcus
aureus, evaluando los resultados con unas gotas de HCl y lugol para observar la formacin o no
de un halo alrededor de las colonias, obteniendo las imgenes dadas a continuacin.
Fig. 1 Agar DNAsa Fig. 2 Agar Almidn Fig. 3 Agar Casena

Los resultados de las observaciones de cada colonia se recopilan en la tabla 1, positivas segn
la aparicin de una zona claramente definida alrededor de cada punto de crecimiento despus
de la incubacin y adicin de HCl, a la vez que negativas si no se muestran cambios.

Produccin de exoenzimas DNAsa Amilasa Proteasa
Serratia marcensis + - +
Bacillus subtilis - + +
Staphylococcus aureus + - +
Tabla 1. Produccin de exoenzimas segn medios de cultivo
ANLISIS DE RESULTADOS
Con base en la composicin previamente conocida del agar DNAsa, se infiere que los
aminocidos, nitrgeno y nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano estn dados
tanto por la peptona de casena como por la peptona de soya; as mismo el cloruro de sodio
mantiene el equilibrio osmtico. La concentracin de cido desoxirribonucleico (DNA) permite
diferenciar entre bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa) de aquellas que
no, cuya presencia se detecta con HCl, puesto que los microorganismos que degradan el ADN
producen una zona transparente alrededor del rea de crecimiento, ya que la DNAsa hidroliza
al DNA, dando lugar a zonas claras que indican que ste ha sido dividido en fracciones de
nucletidos que no han sido precipitadas por el cido. Este medio se utiliza principalmente en
la identificacin de los estafilococos, pero tambin puede usarse para la deteccin de la
actividad DNAsa en otros microorganismos.
El agar Almidn se basa en la hidrlisis de amilasa, que lo degrada a maltosa y glucosa,
empleados por la bacteria como fuente de carbono y energa; el almidn reacciona
qumicamente con yodo (lugol) para producir una tonalidad azul oscura cuando las molculas
se insertan entre las molculas espiraladas del almidn, coloracin que no se observa si la
molcula est degradada, por lo cual la ausencia de color se asocia con la hidrlisis de almidn.
La hidrlisis de casena (protena de la leche) le permite al microorganismo obtener carbono y
energa a partir de los aminocidos que la conformaban; al mezclar la leche con un medio de
cultivo la casena forma complejos coloidales insolubles con el calcio, pero al ser degradada se
recupera la transparencia inicial alrededor de la colonia. Con relacin a los resultados
observados en los agares, son subjetivos y dependen de la percepcin de color del
investigador, por lo cual se pueden presentar errores en la interpretacin de los resultados,
como lo ocurrido en el agar de almidn del Staphylococcus aureus generando una conclusin
equivocada.
De acuerdo a los datos experimentales de cada microorganismo (Tabla 1), tanto S. marcensis
como S. aureus producen DNAsa, pese a que el primero es bacilo Gram negativo, el segundo
es coco Gram positivo y el B. subtilis es bacilo Gram positivo, por lo cual este procedimiento no
es til para diferenciacin Gram, aunque debe tenerse en cuenta que actividad por
exoenzimas en Gram positivas en Gram negativas puede ocurrir a nivel del periplasma.
La mayora de exoenzimas que digieren macromolculas insolubles estn mediadas por
represin por catabolito son inducibles, es decir, la presencia de sustratos ms eficaz a nivel
metablico inhibe la enzima pero su sntesis se desencadena por los productos de la hidrlisis
que pueden ingresar a la bacteria, por ejemplo, la sntesis de enzimas extracelulares y del ciclo
de Krebs en B. subtilis est mediada por represin metablica por glucosa, cuya transcripcin
se induce durante el proceso de esporulacin para obtener la energa y los intermediarios
necesarios para que sta se lleva a cabo.

CUESTIONARIO 7
1. Cmo se clasifican los organismos como eubacterias y archeobacterias de acuerdo a su
metabolismo?
Fuente de
Carbono
Hetertrofas
Dependen de materia orgnica externa (carbohidratos,
lpidos, protenas) para obtener su energa y molculas
estructurales
Auttrofas
Sintetizan sustancias esenciales a partir de materia
inorgnica: para obtener energa fotolitoauttrofos,
quimiolitotrficos (oxidacin de anhdrido sulfuroso o
compuestos ferrosos)
Fuente de
energa
Fottrofas
Cianobacterias (oxifotobacterias) fotosntesis oxignica
Bacterias prpuras tienen bacterioclorofila a o b y
carotenoides
Bacterias verdes con fotosntesis anoxignica
Quimitrofas
Crecen en medios estrictamente minerales sin luz,
obteniendo ATP (poder reductor) en la respiracin de un
sustrato con H
2
S, S, S
2
O
3
, H
2
, NH
3
, NO
2
-
o Fe
2+
y utilizando
CO
2
como fuente de C
Donadores de
electrones
Littrofas
Necesitan donadores inorgnicos de electrones: hidrgeno,
CO, NH
3
, Fe
2+
y otros iones de metales reducidos, as como
varios compuestos de S reducidos
Organtrofas
Requieren como donadores de electrones, compuestos
orgnicos
Tabla 2. Clasificacin de procariotas segn su metabolismo

Fig. 4 Resumen de clasificacin de procariotas
2. Cmo define un medio de cultivo simple y uno compuesto?
Es un medio empleado para aislamiento de microorganismos comunes y poco exigentes a nivel
nutritivo como el Agar nutritivo; para microrganismos cuyas necesidades metablicas sean
ms exigentes se emplean medios diferenciales y/o selectivos.
3. Qu son las enzimas constitutivas e inducibles?
Enzima constitutiva es aquella que la clula sintetiza constantemente con o sin sustrato y se
encuentra en niveles basales (enzimas de gliclisis); las enzimas inducibles generalmente son
sintetizadas como respuesta a la presencia del sustrato (inductor) como la lactosa es inductora
de la -galactosidasa.
4. En qu consisten los mecanismos de represin enzimtica?
Las enzimas que catalizan la sntesis de un producto especfico no se sintetizan si dicha
sustancia est presente en el medio. La represin enzimtica es un mecanismo muy extendido
en bacterias que ocurre durante la sntesis de una amplia variedad de enzimas que intervienen
en la sntesis de aminocidos y bases nitrogenadas, en los cuales el producto inhibe la enzima
de la va de sntesis, controlando de manera efectiva las sntesis innecesarias.
5. En qu consisten los mecanismos de inhibicin enzimtica?
Fenmeno complementario a la represin en el cual la sntesis de una enzima slo se lleva
acabo cuando est presente el sustrato. Las enzimas que participan en la degradacin de las
fuentes de carbono y energa frecuentemente son inducibles. Estas sustancias que
generalmente son molculas pequeas, se denominan colectivamente como efectores. No
todos los inductores y correpresores son sustratos de las enzimas involucradas
(Tiometilgalactsido (TMG) inductor de la -galactosidasa). La represin o la induccin
enzimtica actan a nivel de la transcripcin; la sntesis de enzimas est controlada por la
produccin de RNAm, por lo cual, cuando un inductor se aade, se inicia la sntesis de RNAm
que codifica para la enzima en particular; cuando una sustancia (correpresor), que causa la
represin de la enzima se aade, causa la inhibicin de la formacin de RNAm.
6. Cules son los mecanismos por los cuales se sintetizan macromolculas transmisoras de
informacin gentica?
El control gnico se lleva a cabo mediante la induccin y represin enzimticas. Los
correpresores se unen al represor formando un complejo activo capaz de actuar sobre el gen
operador y bloquear la sntess del RNAm o unirse al inductor y formar un complejo inactivo
que no puede unirse al gen operador llevando a cabo la sntesis de RNAm. La secuencia de
aminocidos est determinada por los genes estructurales y la velocidad de sntesis de genes
reguladores. Opern es la zona del DNA que constituye una unidad de expresin gnica
compuesto por varios genes y por secuencias promotoras y reguladoras que comparten. Al
aadir inductores (lactosa) se incrementa la velocidad de sntesis de -galactosidasa, -
galactsido permeasa y tiogalactsido transcetilasa, cuyos genes se representan como z, y, a y
la velocidad de sntesis como i, p, o. Tanto la represin como la induccin representan
sistemas de control negativo, ya que la sntesis de enzima solo puede tener lugar cuando el
represor se separa del operador. Tiene un control positivo cuando se requiere una asociacin
entre una protena y una parte de la regin regulatoria de un opern, para la expresin de
genes estructurales asociados.
CONCLUSIONES
Serratia marcensis degrada DNA y protenas como casena
Bacillus subtilis produce exoenzimas que hidrolizan carbohidratos y protenas (almidn y
casena, respectivamente)
Staphylococcus aureus sintetiza DNAsa y proteasa para obtener aminocidos, carbono y
energa
Se debe tener en cuenta la maquinaria enzimtica asociada a un microorganismo para su
identificacin, complementando la informacin obtenida en una batera bioqumica,
medios de cultivo diferenciales/selectivos, entre otros procesos.
BIBLIOGRAFA
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Cuernavaca, Mxico, 2005, pg. 20
RESULTADOS (Prctica 8)
Se realizaron siembras en cuatro medios de cultivo diferentes: agar MRS, MM1, MM2 y MM3 a
partir de cultivos patrn de Escherichia coli y Lactobacillus sp, observando crecimiento de
cultivos segn siguientes las imgenes.
Fig. 5 Cultivo en MRS Fig. 6 Cultivo en MM1 Fig. 7 Cultivo en MM2 Fig. 8 Cultivo en MM3

Los datos de crecimiento de cultivos se recopilan en la siguiente tabla.
Evaluacin del crecimiento en agar Lactobacillus sp E. coli
MRS + -
MM1 - +
MM2 - +
MM3 - +
Tabla 3. Crecimiento de Lactobacillus sp y E. coli
ANLISIS DE RESULTADOS
Teniendo en cuenta que los Lactobacillus son bacilos Gram positivos anaerobios facultativos o
anaerobios estrictos y que E. coli son bacilos Gram negativos aerobios, bsicamente se
esperaran comportamientos muy diferentes en cada medio de cultivo dados por las
necesidades nutricionales de cada especie. Segn esto, el medio MRS siendo selectivo para
lactobacilos, asegura todas las condiciones requeridas para su crecimiento, especialmente
cofactores inicos como magnesio y manganeso que adems de asegurar la aerotolerancia
durante la fermentacin homolctica, inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas
mediante el citrato de amonio y el polisorbato 80, que adems de suministrar derivados de
cidos grasos necesarios para los lactobacilos, inhiba selectivamente bacterias Gram
negativas, razn por la cual no se observ ninguna colonia de Escherichia coli en el medio.
Con respecto a los medios mnimos MM1, MM2 y MM3 cuya composicin slo se diferencia
por el amonio, nitrato y metilamina (crece en metilamina, metaboliza N y lo libera)
respectivos, se esperaba mayor contraste en el desarrollo de las colonias en los tres cultivos
principalmente por la presencia de nitratos en el agar MM2, ya que la Escherichia coli es
positivo para la reduccin de nitratos debido a la produccin de nitrato reductasa, pero eso se
debe a que el inculo no era del mismo tamao, por lo cual el crecimiento no poda ser
proporcional.
Lactobacillus no reducen nitratos y debido a su alta complejidad nutricional y a la necesidad de
factores de crecimiento especiales y especficos, no ocurre el crecimiento de colonias en
ninguno de los medios mnimos, igualmente el crecimiento ptimo no se alcanza en pH
neutros ni alcalinos, ya que todas las condiciones favorecen el crecimiento selectivo de E. coli.
Por otra parte, E. coli en presencia de sustrato incrementa hasta mil veces la hidrlisis por
activacin de la enzima, indicando claramente que es un sistema inducible por el opern
lactosa (opern lac), similar al proceso catablico en Lactobacillus sp; dicho opern es
regulado disponibilidad de glucosa y lactosa en los medio de cultivo (Fig. 9)

Fig. 9 Control positivo y negativo de la transcripcin del opern lac
CUESTIONARIO 8
1. De acuerdo con los resultados obtenidos, qu significa un microorganismo altamente
eficiente metablicamente?
Las bacterias son metablicamente eficientes ya que la mayora de sus enzimas son inducidas,
por lo cual ningn intermediario es sintetizado en exceso o sin necesidad.
2. Cules son las rutas centrales del metabolismo bacteriano?
Las rutas anablicas y catablicas: sntesis de macromolculas necesarias para la clula como
protenas, lpidos, polisacridos y cidos nucleicos a partir de los nutrientes del medio de
cultivo que sea capaz de digerir y reutilizar en s misma; degradacin de macromolculas para
obtener energa necesaria para todos sus procesos vitales como crecimiento, respiracin,
reproduccin, motilidad, entre otros.
3. Cmo se define un compuesto intermediario del metabolismo?
Es una molcula orgnica que permite el traslado de grupos qumicos funcionales entre
reacciones (coenzimas). Cada tipo de transferencia de un grupo es llevada a cabo por una
coenzima particular, que es el sustrato para un grupo de enzimas que lo producen, y un grupo
de enzimas que lo requieren, y por lo tanto son continuamente sintetizadas, consumidas y
luego recicladas; generalmente son derivados de vitaminas y entre ellas se encuentran el ATP y
el NAD.
4. Cundo una ruta metablica se considera biosinttica y catablica de manera simultnea?
Una ruta se considera anfiblica cuando participa en procesos de degradacin y sntesis de
macromolculas al mismo tiempo, es decir, cuando los metabolitos de una va son sustratos de
otras rutas y as mismo, los productos de esas otras rutas participan en la va inicial, como en el
caso del Ciclo de Krebs, dependiendo de las reacciones anaplerticas para mantener
cantidades adecuadas de los intermediarios para que la ruta anfiblica se lleve a cabo
adecuadamente.

BIBLIOGRAFA
1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaer MA, Microbiologa Mdica, Elsevier Inc, Madrid, Espaa,
2006, pg. 420.
2. ATCC Medium: 2 Marine Agar / Broth 2216. Consultado 27.10.13.
http://www.atcc.org/~/media/B5025AB990724A91B4491C391E054448.ashx
3. Samaniego LM, Sosa del Castillo M, Lactobacillus spp: Importantes promotores e actividad
probitica, antimicrobiana y bioconservadora, Resea. Universidad de Matanzas, Facultad
de Agronoma, Centro de Estudios Biotecnolgicos, Matanzas, Cuba ,1998.