Anda di halaman 1dari 20

LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( PEWARNAAN GRAM )

A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

B. Dasar Teori
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat
basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan
karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua
jenis pewarnaan.

a. pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu
di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan
kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol
sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-
4%)
Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap
penisilin
Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh
pewarna basa (VK)
Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif
kompleks
Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh
Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna
tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan
penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan
permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun
oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol
95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan
dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur
pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat
warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang
dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang
mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya
dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh
terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut
tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh
permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap
tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian
dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci
dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3%
(hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit
kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan
dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh
permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air
mengalir (Karuniawati, 2005).


4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur
khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh
pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium,
Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora
dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif,
sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan
fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan
dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat
di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan
transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana,
endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga
sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena
jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga
memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya
dengan cara memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk
DNA (Rudi, 2010).



A. Alat dan Bahan
NO Alat Jumlah Bahan

1

Jarum ose

1
Biakan murni B.
cereus dan E.colipada
medium NA yang
berumur 24 jam
2 Pembakar
spirtus
1 Aquades steril
3 Kaca preparat 1 Larutan huckers
crystal violet
4 Pipet tetes 1 Larutan mordan lugol
iodine
5 Mikroskop 1 Larutan alkohol 96%
6 Gelas kimia 3 Larutan safranin
7 Kaca objek 1
8 Tabung reaksi 1

B.
Kaca Objek
Cara Kerja



Dibersihkan dengan menggunakan alkohol
Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api
Kaca objek yang telah steril
Ditetesi aquades

Jarum ose




Dibakar sampai merah
Dicelupkan pada alkohol
Jarum ose yang steril
Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api

Sampel e.coli dan Bacillus




Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).
Disimpan di atas kaca objek
Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada pada kaca
objek
Kaca objek yang telah berisi sampel
Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.


Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1
menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)
Dicuci dengan air yang mengalir
Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)
Dicuci dengan air yang mengalir
Dikeringkan pada udara terbuka
Hasil
Diamati dibawah mikrosko


A. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Tabel pengamatan
Gambar 1. Fiksasi
Sumber : dokumentasi Pribadi
Bakteri yang telah di ambil kemudian di
simpan pada kaca objek yang dicampur
dengan setetes aquades. Setelah itu
difiksasi di atas api sampai kering.
Pemanasan tidak boleh terlalu panas
karena bisa merusak sel bakteri.
Gambar 2. Pada saat ditetesi violet
Sumber : dokumentasi pribadi
Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet.
Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan
selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Hasilnya terdapat warna
ungu pada kaca objek.
Gambar 3. Penambahan lugol
Sumber : dokumentasi pribadi
Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai
terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di
air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca
objek tetap berwarna ungu akibat dari
tetesan violet.
Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%
Sumber : dokumentasi pribadi
Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri
ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan
selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air
yang mengalir. Setelah dicuci, warna
ungu pada kaca objek menghilang akibat
penambahan dari alkohol.
Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin
Sumber : dokumentasi pribadi
Setelah warna ungu pada bakteri hilang,
kemudian bakteri ditetesi safranin sampai
terendam dan biarkan selama 1 menit.
Kemudian cuci di air yang mengalir.
Hasilnya, bakteri yang dihasilkan
berwarna merah muda.
Gambar 6. Hasil pewarnaan
Sumber : dokumentasi pribadi





Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)
Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar B. cereus pada pembesaran 16x10
Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal
atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram
dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri
gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang
berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam.
Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme
pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau
pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu
pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran
zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1
menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut
kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas
dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik
yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat
mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen
dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.
Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau
bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan
terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga
warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam
sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna
lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna
tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang
lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk
mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan
reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna
ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna
merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.


B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna
merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan
gram positif.



Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11
November 2010

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-
positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :
Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I.
Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok,
Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam
untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html.
11 November 2010.


Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium
Mikrobiologi UNS.



ISOLASI BAKTERI
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Pemanfaatan mikroorganisme dalam bidang teknologi semakin banyak digunakan misalnya
dalam menghasilkan berbagai produk seperti bahan pangan, industri, pertanian, obat-obatan, dan lain
sebagainya. Pemilihan mikroorganisme yang tepat untuk suatu tujuan tertentu dan pemanfaatan
mikroorganisme secara maksimal perlu didukung oleh suatu metode isolasi dan identifikasi yang baik.
Diketahui bahwa mikroba tersebar di alam, terdapat di lingkungan mana saja dalam populasi
campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk
mencirikan dan mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme tertentu, pertama-tama spesies
tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni.
Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme, dilakukan dengan cara yang aseptis untuk
menghindari terjadinya kontaminasi dengan mikroorganisme lain. Kebanyakan mikroorganisme dapat
diisolasi dan diinokulasi dalam biakan murni dengan memindahkan suatu koloni secara cermat,
mensuspensikan kembali dalam cairan dan menanamnya kembali pada medium yang selektif.


Isolasi dan inokulasi merupakan percobaan yang sangat penting, karena melihat kondisi
lingkungan di sekitar kita yang banyak terdapat mikroorganisme baik yang patogen maupun yang non
patogen, sehingga pemisahan dan identifikasi bakteri yang satu dengan lainnya juga dibutuhkan.

I.2 Maksud dan Tujuan
I.2.1 Maksud Percobaan
Mengetahui dan memahami cara menginokulasi dan mengisolasi mikroorganisme pada
beberapa medium

I.2.2 Tujuan Percobaan
Menginokulasi Bakteri Streptococcus epidermis dan Salmonella typhi dengan metode gores pada
medium NA dan NB serta Candida albicans pada medium PDA dan PDB.
Mengisolasi mikroorganisme pada substrat padat dan substrat cair pada medium TEA.





I.3 Prinsip Percobaan
Penginokulasian Bakteri Streptococus epidermis dan Salmonella typhi dan Jamur Candida
albicans dari biakan murni dengan metode agar tegak, agar miring, metode cair, serta metode gores
pada Cawan Petri, menggunakan medium NA, NB, PDA, dan PDB kemudian diinkubasi pada suhu
37
o
C selama 1 x 24 jam untuk bakteri dan pada suhu 25
o
C selama 3 x 24 jam untuk jamur.
Pengisolasian mikroorganisme dari substrat cair (Mountea, Air Galon dan Air Danau) dan substrat
padat (Biskuit Marie, Jalangkote, dan Roti Buana) dengan menggunakan medium TEA dan
menggunakan Metode Tuang, Metode Sebar dan Metode Gores kemudian diamati bentuk permukaan
mikroba setelah diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 x 24 jam.










BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Teori Umum
Populasi mikroba di alam sekitar kita besar lagi kompleks. Beratus-ratus spesies pelbagai
mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran
pencernaan, dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang luar biasa besarnya. Sebagai contoh, sekali
bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme.
Alam sekitar kita, udara, tanah, dan air juga dihuni kumpulan mikroorganisme. Penelitian
yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisah-
misahkan populasi campuran yang rumit ini, atau biakan campuran menjadi spesies-spesies yang
berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya
berasal dari satu sel induk.(1;85)
Isolasi adalah merupakan cara memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan,
sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni, sehingga biakan tersebut disebut kultur murni.
(2;28).
Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus dilaksanakan
secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang sangkut paut dengan
medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan
kontaminasi, yakni masuknya mikroorgasnisme yang tidak kita inginkan. Beberapa langkah pada
pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah sebagai berikut:

1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah
menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja
tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan di dalam suatu
kotak berkaca (enkas).

2. Pemindahan dengan Kawat Inokulasi
Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung kawat boleh lurus,
boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan,
sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat
itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu juga dipanasi setelah sumbatnya
diambil. Setelah pengambilan inokulum (sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian
disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada
medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.


3. Pemindahan dengan Pipet
Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu. Untuk itu
diambillah 1 ml sampel untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang disterilkan. Dalam
pengenceran ini tergantung dari keadaan air atau susu yang diselidiki. Kemudian diambil 1 ml dari
enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair. Lalu
agar-agar yang masih encer dituangkan di cawan petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan petri
yang berisi piaraan baru itu disimpan dalam tempat yang aman, misalnya dalam inkubator.

4. Teknik biakan murni (Cara Menyendirikan Biakan Murni)
Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain.
Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba (saprobakteri).
Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi
juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakkan
mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari
udara yang mengandung banyak mikroorganisme. (3;64-65)




Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:
a. Cara Pengenceran
Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-
macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian
diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, diambil lagi untuk disebarkan pada suatu medium padat.
Kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi
mungkin juga kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal demikian, kita telah memperoleh satu
koloni murni, dan selanjutnua spesies ini dapat kita jadikan piaraan murni (biakan murni).

b. Cara Penuangan
Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan,
dan sampel itu kemudian disebarkan dalam satu medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium
mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni yang masing-masing dapat
dianggap murni.

c. Cara Penggesekan / Penggoresan
Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan
ketrampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang
terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.
Ada beberapa teknik penggesekkan, yakni :
o Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan Petri
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung
Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan
di daerah II
Pijarkan kembali ose, Prosedur di atas diulangi untuk daerah III

o Goresan kuadran
Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4.

o Goresan radian
Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan
Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali
Putar lempengan agar 90
0
dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan
Putar lempengan agar 90
0
dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya
Pijarkan ose


o Goresan sinambung
Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar
Jangan pijarkan ose,putar lempengan 180
0
,gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa
permukaan lempengan agar

d. Cara penyebaran
Pengenceran sampel seperti pada cara penuangan.,Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan
dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.Cairan sampel disebarkan
dengan penyebar yang terbuat dari gelkas. Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan
mencelupkan alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkan dahulu sebelum digunakan untuk
menyebarkan cairan sampel pada permukaan agar. Penyebaran cairan contoh(sampel)dilakukan
dengan memutar agar lempengan tersebut.

e. Cara pengucilan satu sel(sinle cell isolation)
Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian
banyak bakteri,dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.,Alat semacam ini tidak mudah untuk
menggunakannya.Alat iu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu mikromanipulator.(3;65-
69)

Flora mikroba di lingkungan mana saja pada umumnya terdapat dalam populasi campuran.
Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk
mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain
yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Sesungguhnya ada
beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang
paling sering digunakan yaitu: Metode cawan gores dan Metode cawan tuang (4;62-69)
Suspensi mikrobmikroba digoreskan pada agar lempengan, agar miring atau media cair. Sifat
biakan dari suatu mikroorganisme tergantung pada penampilannya pada berbagai media. Ciri berikut
ini digunakan untuk mengevaluasi biakan:
Agar Miring
Sifat pertumbuhan pada agar miring terlihat sebagai tidak ada, sedikit, atau subur.
Pengamatan pembentukan warna koloni. Mikroba yang tumbuh dengan subur diatas permukaan suatu
media akan telihat lebih buram dibanding dengan pertumbuhan yang tidak subur.





Media Cair
Sifat pertumbuhan pada bagian permukaan, dibawah permukaan dan dasar tabung dapt
terlihat dengan jelas. Pada beberapa mikreoba terlihat pembentukan partikelyang tebal pada lapisan
pemukaan. Dibawah lapisan permukaan dapat terlihat pertumbuhan yang keruh,bergranula, atau
flokulen, sedangkan pada bagian dasar kadangkala terlihat sedimenberupa granula kental atau terdiri
dari partikel besar.
Agar lempengan
Koloni yang tumbuh diatas lempeng perlu diperhatikan warna, sifat tembus cahaya, pinggiran,
sifat permukaan dan bentuknya. (5;78-79)
Kunci pokok dalam mempelajari identifikasi mikroorganisme termasuk bakteri adalah adanya
kultur murni hasil isolasi mikroorganisme, sehingga identifikasi dapat berhasil dengan baik, apabila
diperoleh isolat yang telah murni. Kultur murni adalah suatu koloni yang berasal dari satu sel
mikroorganisme atau bakteri. Kebanyakan identifikasi sangat tergantung dari raksi-reaksi positif atau
negatif yang spesifik yang disebabkan oleh suatu kultur murni. Adanya pencemaran mikroorganisme
lain, akan menyebabkan hasil uji dapat positif atau negatif palsu. Sehingga dalam mikrobiologi klinik
akan memperoleh hasil diagnosa salah atau palsu. (6;322)



Begitu pentingnya kultur murni dalam identifikasi mikroorganisme (bakteri), maka cara-cara
untuk memperoleh kultur menjadi sangat fundamental bagi bidang mikrobiologi. Cara termudah
untuk memperoleh kultur murni adalah dengan cara penanaman dalam plat agar secara goresan atau
dengan taburan. Sel inokulum akan tersebar diatas media agar sedemikian rupa, sehingga koloni yang
tumbuh merupakan koloni yang berasal dari satu sel. Koloni-koloni tersebut selanjutnya digoreskan
kembali pada medium agar yang lainnya untuk mengecek kemurniannya. (6;323)
Cara lain untuk mempermudah mengenal kultur murni adalah dengan menggunakan media
differensial. Suatu reaksi dengan medium memungkinkan differensiasi antara dua atau lebih
mikroorganisme. Mikroorganisme yang diinginkan mungkin tidak terbedakan, tetapi kemungkinan-
kemungkinan akan memperkecil kelompok yang dicari. (6;325)
Bacillus Subtilis diasosiasikan dengan keracunan makanan dan bermacam infeksi, seperti
septicemia, Panophthalmitis, Pneumonia, infeksi luka dan seritonitis. Koloni bacillus subtilis adalah
besar dan biasanya berpigmen kuning atau merah jambu sampai oranye atau coklat.
Bacillus merupakan sel berbentuk batang dengan ukuran 0,3-2,2 m x 1,27-7,0 m. sebagian
besar motif flagellum khas lateral membentuk endospora; tidak lebih dari satu dalam satu sel
sporangium. Gram positif. Metabolism dengan respirasi sejati-Fermentasi sejati atau kedua-duanya
yaitu respirasi dan fermentasi. Aerobik sejati atau anaerobic fakultatif. Umum dijumpai dalam tanah.