CONGRESO FORESTAL ESPAOL - Lourizn 1.993. Ponencias y comunicaciones.

Tomo II
OBTENCION DE PLANTAS A PARTIR DE EMBRIONES SOMATICOS
DE QUERCUS SUBER L.
B. Fernndez Guijarro; C. Celestino & M. Toribio
337
Subdireccin General de Investigacin Agraria. Consejera de Economa. Comunidad de
Madrid. Apdo. 127. 28880-ALCALA DE HENARES (Espaa)
Resumen
En esta comunicacin se ha pretendido establecer un protocolo para la regeneracin
de plantas de alcornoque va embriognesis somtica. Los embriones somticos se obtuvieron
a partir de hojas de plantas de dos meses y de fragmentos cotiledonares de bellotas maduras,
cultivados en tres medios consecutivos con concentraciones decrecientes de reguladores del
crecimiento. Para la germinacin, se someti a los embriones a distintos tratamientos, de
entre los cuales se escogieron la desecacin y el cultivo en medio con bajo contenido en sales
por proporcionar los mejores resultados.
P.C.: Quercus suber, Embriognesis somtica, Regeneracin, Medios de cultivo
Abstract
This paper gives a procedure to regenerate plants of cork oak through somatic
embryogenesis. The somatic embryos were obtained in leaves from young seedlings and
cotyledonary fragments from mature acorns of cork oak. The explants were cultured in three
stage process in wich BA and NAA concentration were decreasing. Different methods were
used to germinate the embryos. Dessication and culture in low salt concentration medium
were chosen to give the best results.
K.W.: adventive embryogenesis, cork oak, secondary embryogenesis, culture media, plant
regeneration
INTRODUCCION
El incremento de la demanda de corcho y la escasa regeneracin del alcornoque como
consecuencia del aprovechamiento combinado de tipo forestal, agrcola y ganadero de las
dehesas, justifican la plantacin intensiva con material mejorado de esta especie. Las
corrientes actuales, dentro del campo de la mejora forestal, ponen especial nfasis en tcnicas
combinadas de mejora y clonacin (PARK & BONGA, 1992). Al ser el alcornoque una
especie claramente recalcitrante a su propagacin vegetativa, la obtencin de embriognesis
somtica, sin duda el mtodo ms eficiente de propagacin vegetativa, abre un prometedor
futuro en la regeneracin de individuos sobresalientes de Quercus suber.
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MATERIAL Y METODOS
,.
Obtencin de lneas embriognicas
Se parti de hojas apicales de plantas de cuatro meses de edad procedentes de semilla,
que se esterilizaron en una disolucin al 10% de NaOCl (7% de cloro activo) y unas gotas
de Tween 20 durante 15 min, y de fragmentos cotiledonares de bellotas maduras que se
esterilizaron en una disolucin al 25 % de NaOCl y unas gotas de Tween 20 durante 15 mino
Los explantos se cultivaron en distintas condiciones, siendo las variaciones principales
el cultivo con fotoperiodo o en oscuridad y la composicin del medio de cultivo
(formulacin de macronutrientes y tipo y concentracin de hormonas vegetales).
Las lneas embriognicas se mantuvieron por embriognesis repetitiva. Los subcultivos
se hicieron mensualmente en un medio con macronutrientes de SH (SCHENK &
HILDEBRANDT, 1972), micronutrientes, Fe-EDTA, cofactores, inositol y sacarosa de MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), agar 6 gIl Y sin reguladores del crecimiento. Los cultivos
se situaron en cmara de cultivo a 25 1 oC y 16 h de fotoperiodo.
Germinacin de embriones
Se aislaron embriones dicotiledonares bien conformados y se cultivaron en medios con
distintas formulaciones de macronutrientes. A los 40 das de cultivo se observ la respuesta
morfognica segn el siguiente criterio: embriones sin respuesta (NR); embriones que
mostraban embriognesis adventicia hubieran germinado o no (AE); embriones con
elongacin de raz o tallo (R/T); embriones con germinacin coordinada de raz y tallo (CG).
Con los datos obtenidos se estableci un periodo de maduracin de 20 das (periodo de
tiempo necesario para que los embriones crezcan y adquieran un color opaco blanco-
amarillento). Los embriones maduros se sometieron, de forma aislada o combinada, a los
siguientes tratamientos: 30 o 15 das a 4 oC y oscuridad; desecacin al aire durante una
semana; maduracin en un medio con bajo contenido en sales (macronutrientes de
GAMBORG, 1966) y germinacin en un medio rico (macronutrientes de SH); germinacin
en un medio con giberalinas (30 J.'M de GA); germinacin en un medio con
bencilaminopurina (0.5 y 1 J.'M de BA). .
La respuesta morfognica de los embriones se midi a los 30 das despues de situarlos
en el medio de germinacin. Se utiliz una media de 30 embriones por tratamiento (lE). Los
datos se analizaron por el test de independencia de Chi-cuadrado.
RESULTADOS Y DISCUSION
Induccin de embriognesis somtica
Entre los reguladores de crecimiento ensayados, el IBA (cido indolbutrico) no u ~
efectivo, el 2,4-D (cido 2,4-Diclorofenoxiactico) indujo callo no embriognico y la
quinetina ms IBA indujo callo y races en los cotiledones. Las lneas embriognicas se
obtuvieron en un medio con macronutrientes de G y el resto de los componentes de MS con
la siguiente secuencia: 30 das en oscuridad en el medio con 10 J.'M de BA y 10 J.'M de
NAA (cido naftalenactico); 30 das en condiciones de fotoperiodo en el medio con 0.5 J.'M
de BA y 0.5 J.'M de NAA . Despues los explantos se sub cultivaron en el medio sin
reguladores de crecimiento y en condiciones de fotoperiodo. A los 120 das desde el inicio
del cultivo aparecieron las primeras estructuras embriognicas. El porcentaje de induccin
fu muy bajo, un 1.3% del callo formado en los cotiledones fu embriognico y un 5.9 % en
hojas, porcentaje muy parecido al obtenido por EL MATAOUI y ESPAGNAC (1987) en
segmento nodal de alcornoque.
339
Genninacin de los embriones
La germinacin de embriones aislados cultivados sin ningn tratamiento especfico fu
nula o muy escasa (3.7% CG y 3.7% R/T en 1/2 MS).
Aunque el tratamiento en frio de los embriones somticos ha resultado ser infectivo
en algunos casos (GINGAS & LINEBERGER, 1989), nuestros resultados (Tabla 1) indicaron
que en el caso del alcornoque un periodo de frio es necesario para romper la dormicin,
aunque no es suficiente para cambiar el "patron" de embriognesis repetitiva de los
embriones hacia la germinacin de los mismos en un porcentaje satisfactorio.
La adicin de giberelinas al medio de germinacin, despus del tratamiento en frio,
no aument la germinacin coordinada. Igualmente, la adicin de BA no aumenta la
germinacin de manera significativa respecto al blanco en ningn caso, adems de tener un
efecto negativo en cuanto a la conformacin de los brotes.
Los mejores resultados se obtuvieron con los tratamientos de desecacin al aire
durante 7 das, previo al periodo de 30 das en frio, el cual se confirma como tratamiento
necesario para la obtencin de altos porcentajes de germinacin (Tabla 2). Se obtienen los
mismos porcentajes en el caso de realizar la maduracin de los embriones en un medio pobre
en sales (1/2 G) y la germinacin, despues de un periodo de 30 das en frio, en un medio
rico (SH) (Tabla 3).
CONCLUSIONES
La obtencin de embriones somticos de alcornoque a partir de tejidos tan variados
como embriones inmaduros (BUENO et al., 1992), segmentos nodales (EL MATAOUI &
ESPAGNAC, 1987) y hojas, demuestran la viabilidad de su propagacin va embriognesis
somtica. Por otra parte, el haber conseguido embriognesis en tejidos de hoja de rbol
maduro en algunas especies como Quercus ilex (FRAUD-KELLER & ESPAGNAC, 1989)
abre la posibilidad de clonar rboles selectos de alcornoque en el futuro.
Esta comunicacin proporciona un protocolo para la obtencin de embriones
somticos de Quercus suber a partir de tejidos no embrinicos y su ulterior germinacin en
altos porcentajes. En el cambio de proceso embriognico a proceso germinativo parece jugar
un papel importante el stress por falta de nutrientes, yen la posterior ruptura de la dormicin
el almacenamiento en frio.
BIBLIOGRAFIA
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TABLA 1. Efecto del periodo en fria sobre la embriognesis adventicia
y la germinacin.Los embriones inmaduros fueron aislados y madurados en cmara
de cultivo. Despus de un periodo de 15 (C15) y 30 (C30) das en fria se situaron
en la cmara de cultivo para la germinacin. Todos los subcultivos se hicieron
en medio con macronutrientes de SH. Algunos tratamientos incluyeron 0.05 ~ de
BA en el medio de germinacin. El control (Ca) no tuvo tratamiento en fria. Los
datos se recogieron a los 30 das en condiciones de germinacin y se dan en % de
respuesta sobre los embriones iniciales (lE).
rE NR AE CG R/T
*** C15 35 40 34 03 23
* C15+BA 18 56 17 11 17
* C30 40 20. 30 15 35
*** C30+BA 40 40 32 18 10
* Ca 30 33 57 00 10
Chi-cuadrado=21.15 (01=0.05)
341
TABLA 2. Efecto de la desecacin al aire sobre la Los
embriones inmaduros fueron aislados y madurados en cmara de cultivo. Todos los
subcultivos se hicieron en medio con macronutrientes de SH. El tratamiento 1
tuvo, despues de la maduracin, un periodo de desecacin de 7 dfas y un periodo
posterior de frio de 3 O dfas. El tratamiento 11 tuvo nicamente 7 dfas de
desecacin. En el control (Co) no hubo desecacin y si el periodo de frio de 30
das. Los datos se recogieron a los 30 dfas en condiciones de germinacin y se
dan en % de respuesta sobre los embriones iniciales (lE) ..
lE NR AE CG R/T
*
1 33 09 03 70 18
*
111 21 67 19 00 14
*
Co 40 20 30 15 35
Chi-cuadrado=56.98 (a=O . 05)
TABLA 3. Efecto de la maduracin en un medio pobre y de la presencia de
BA (0.5 J.LM) sobre la germinacin. Los embriones inmaduros fueron aislados y
madurados en cmara de cultivo. En todos los casos hubo un periodo,de frio de 30
das y la se efectu en cmara de cultivo en un medio con
macronutrientes de SH con o sin citoquinina (0.05 J.LM de BA). En los dos primeros
casos la maduracin tuvo lugar en un medio pobre (macronutrientes de 1/2G). En
el control la maduracin se realiz en un medio rico en sales (macronutrientes
de SH) . Los datos se recogieron a los 30 das en condiciones de germinacin y se
dan en % porcentaje de respuesta sobre los embriones iniciales (lE).
lE NR AE CG R/T
*
1/2 S 34 09 09 62 20
*
1/2 S+BA 18 00 13 81 06
*
Co 40 20 30 15 35
Chi-cuadrado=12.81 (a=0.05)