Anda di halaman 1dari 16

ISOLASI BAKTERI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

GRAM POSITIF



KELOMPOK 1
ANGGOTA :
Rizki N (135130100111009)
Luh Putu Setianti P (135130100111012)
Bima Anggara Putra (135130101111003)
Nuril Insani Aisyah (135130101111005)
Pandu Gumelar S (135130101111012)
Devi Intan D A O (135130101111013)
Dyah Kusumaning W (135130101111021)
Alex Hariyono P (135130107111009)
Miranti Verdiana A (135130107111001)




PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pemanfaatan mikroorganisme dalam bidang teknologi semakin banyak digunakan
misalnya dalam menghasilkan berbagai produk seperti bahan pangan, industri, pertanian,
obat-obatan, dan lain sebagainya. Pemilihan mikroorganisme yang tepat untuk suatu tujuan
tertentu dan pemanfaatan mikroorganisme secara maksimal perlu didukung oleh suatu
metode isolasi dan identifikasi yang baik.
Diketahui bahwa mikroba tersebar di alam, terdapat di lingkungan mana saja dalam
populasi campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies
tunggal di alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme
tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain, lalu
ditumbuhkan menjadi biakan murni.
Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme, dilakukan dengan cara yang aseptis untuk
menghindari terjadinya kontaminasi dengan mikroorganisme lain. Kebanyakan
mikroorganisme dapat diisolasi dan diinokulasi dalam biakan murni dengan memindahkan
suatu koloni secara cermat, mensuspensikan kembali dalam cairan dan menanamnya kembali
pada medium yang selektif.
Isolasi dan inokulasi merupakan percobaan yang sangat penting, karena melihat
kondisi lingkungan di sekitar kita yang banyak terdapat mikroorganisme baik yang patogen
maupun yang non patogen, sehingga pemisahan dan identifikasi bakteri yang satu dengan
lainnya juga dibutuhkan.
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini adalah
Membahas tentang isolasi bakteri
Mengidentifikasi bakteri gram positif

BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
a) Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan
rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
Pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang
dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk
mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.
Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

b) Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan
struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna
basa (VK)
Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif
kompleks
Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson
dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat
warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras
seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan
pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak
digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat
menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang
dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat
dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam.
Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen
oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai
mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit
lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu
larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4
menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang.
Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit
lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

c) Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau
tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus
:Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum,
dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan
mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan
bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora
dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di
bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan
sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan
badan inklusi (Aditya, 2010)
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan
dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar
belakang yang berwana biru gelap.
Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi,
2010).

2.2 Identifikasi Bakteri Gram Positif Melalui Pewarnaan Gram

Alat dan Bahan yang digunakan
NO Alat Jumlah Bahan

1

Jarum ose

1
Biakan murni B.
cereus dan E.colipada
medium NA yang
berumur 24 jam
2 Pembakar 1 Aquades steril
spirtus
3 Kaca preparat 1 Larutan huckers crystal
violet
4 Pipet tetes 1 Larutan mordan lugol
iodine
5 Mikroskop 1 Larutan alkohol 96%
6 Gelas kimia 3 Larutan safranin
7 Kaca objek 1
8 Tabung reaksi 1

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).
Penambahan violet pada bakteri pada pewarnaan gram. Kristal violet merupakan
reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada
bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap
mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung
lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada
dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna
yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk
memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari
sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian
didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya
hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci)
atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya
warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang.
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut,
daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu
pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi
bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi
kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-
masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas
tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan.
Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika
terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk
warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

2.3 Isolasi Bakteri

Populasi mikroba di alam sekitar kita besar lagi kompleks. Beratus-ratus spesies
pelbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut,
saluran pencernaan, dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang luar biasa besarnya.
Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme.
Alam sekitar kita, udara, tanah, dan air juga dihuni kumpulan mikroorganisme.
Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan
teknik untuk memisah-misahkan populasi campuran yang rumit ini, atau biakan campuran
menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari
suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk.(1;85)
Isolasi adalah merupakan cara memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan,
sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni, sehingga biakan tersebut disebut kultur
murni. (2;28).
Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus
dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang
sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal
ini untuk menghindarkan kontaminasi, yakni masuknya mikroorgasnisme yang tidak kita
inginkan. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah sebagai
berikut:
1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah
menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila
meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan di
dalam suatu kotak berkaca (enkas).
2. Pemindahan dengan Kawat Inokulasi
Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung kawat boleh
lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini
dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin
kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu juga
dipanasi setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (sampel bakteri) selesai,
mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang
membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda,
kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.
3. Pemindahan dengan Pipet
Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu.
Untuk itu diambillah 1 ml sampel untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang disterilkan.
Dalam pengenceran ini tergantung dari keadaan air atau susu yang diselidiki. Kemudian
diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agar-agar yang masih
dalam keadaan cair. Lalu agar-agar yang masih encer dituangkan di cawan petri. Setelah
agar-agar membeku, maka cawan petri yang berisi piaraan baru itu disimpan dalam tempat
yang aman, misalnya dalam inkubator.
4. Teknik biakan murni (Cara Menyendirikan Biakan Murni)
Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain.
Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba
(saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh
suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar.
Medium untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran
(kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak
mikroorganisme. (3;64-65)
Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:
a. Cara Pengenceran
Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran
bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari
pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, diambil lagi untuk disebarkan
pada suatu medium padat. Kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni
tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita memperoleh satu koloni saja.
Dalam hal demikian, kita telah memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnua spesies ini
dapat kita jadikan piaraan murni (biakan murni).
b. Cara Penuangan
Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah
diencerkan, dan sampel itu kemudian disebarkan dalam satu medium dari kaldu dan gelatin
encer. Setelah medium mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni
yang masing-masing dapat dianggap murni.
c. Cara Penggesekan / Penggoresan
Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob
tidak dapat tumbuh.
1) Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan
Petri
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung
Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan
teruskan goresan di daerah II
Pijarkan kembali ose, Prosedur di atas diulangi untuk daerah III
2) Goresan kuadran
Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4, yaitu
3) Goresan radian
Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan
Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali
Putar lempengan agar 90
0
dan buat goresan terputus dimulai dari
bagian pinggir lempengan
Putar lempengan agar 90
0
dan buat goresan terputus di atas goresan
sebelumnya
Pijarkan ose
4) Goresan sinambung
Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan
lempengan agar
Jangan pijarkan ose,putar lempengan 180
0
,gunakan sisi mata ose yang
sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar
2.3.1 Cara penyebaran
Pengenceran sampel seperti pada cara penuangan.,Dengan memipet sebanyak 0,1 ml
cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.Cairan
sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkas. Pada teknik ini sterilisasi
penyebar dilakukan dengan mencelupkan alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkan
dahulu sebelum digunakan untuk menyebarkan cairan sampel pada permukaan
agar. Penyebaran cairan contoh(sampel)dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut.

2.3.2 Cara pengucilan satu sel(sinle cell isolation)
Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari
sekian banyak bakteri,dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.,Alat semacam ini tidak mudah
untuk menggunakannya.Alat iu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu
mikromanipulator
Flora mikroba di lingkungan mana saja pada umumnya terdapat dalam populasi
campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di
alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies tersebut harus dapat dipisahkan
dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan
murni. Sesungguhnya ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu
biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan yaitu: Metode cawan gores
dan Metode cawan tuang.
Suspensi mikrobmikroba digoreskan pada agar lempengan, agar miring atau media
cair. Sifat biakan dari suatu mikroorganisme tergantung pada penampilannya pada berbagai
media. Ciri berikut ini digunakan untuk mengevaluasi biakan:
Agar Miring
Sifat pertumbuhan pada agar miring terlihat sebagai tidak ada, sedikit, atau subur.
Pengamatan pembentukan warna koloni. Mikroba yang tumbuh dengan subur diatas
permukaan suatu media akan telihat lebih buram dibanding dengan pertumbuhan yang tidak
subur.
Media Cair
Sifat pertumbuhan pada bagian permukaan, dibawah permukaan dan dasar tabung
dapt terlihat dengan jelas. Pada beberapa mikreoba terlihat pembentukan partikelyang tebal
pada lapisan pemukaan. Dibawah lapisan permukaan dapat terlihat pertumbuhan yang
keruh,bergranula, atau flokulen, sedangkan pada bagian dasar kadangkala terlihat
sedimenberupa granula kental atau terdiri dari partikel besar.
Agar lempengan
Koloni yang tumbuh diatas lempeng perlu diperhatikan warna, sifat tembus cahaya,
pinggiran, sifat permukaan dan bentuknya.
Kunci pokok dalam mempelajari identifikasi mikroorganisme termasuk bakteri adalah
adanya kultur murni hasil isolasi mikroorganisme, sehingga identifikasi dapat berhasil
dengan baik, apabila diperoleh isolat yang telah murni. Kultur murni adalah suatu koloni
yang berasal dari satu sel mikroorganisme atau bakteri. Kebanyakan identifikasi sangat
tergantung dari raksi-reaksi positif atau negatif yang spesifik yang disebabkan oleh suatu
kultur murni. Adanya pencemaran mikroorganisme lain, akan menyebabkan hasil uji dapat
positif atau negatif palsu. Sehingga dalam mikrobiologi klinik akan memperoleh hasil
diagnosa salah atau palsu. (6;322)
Begitu pentingnya kultur murni dalam identifikasi mikroorganisme (bakteri), maka
cara-cara untuk memperoleh kultur menjadi sangat fundamental bagi bidang mikrobiologi.
Cara termudah untuk memperoleh kultur murni adalah dengan cara penanaman dalam plat
agar secara goresan atau dengan taburan. Sel inokulum akan tersebar diatas media agar
sedemikian rupa, sehingga koloni yang tumbuh merupakan koloni yang berasal dari satu sel.
Koloni-koloni tersebut selanjutnya digoreskan kembali pada medium agar yang lainnya untuk
mengecek kemurniannya.
Cara lain untuk mempermudah mengenal kultur murni adalah dengan menggunakan
media differensial. Suatu reaksi dengan medium memungkinkan differensiasi antara dua atau
lebih mikroorganisme. Mikroorganisme yang diinginkan mungkin tidak terbedakan, tetapi
kemungkinan-kemungkinan akan memperkecil kelompok yang dicari.
Bacillus Subtilis diasosiasikan dengan keracunan makanan dan bermacam infeksi,
seperti septicemia, Panophthalmitis, Pneumonia, infeksi luka dan seritonitis. Koloni bacillus
subtilis adalah besar dan biasanya berpigmen kuning atau merah jambu sampai oranye atau
coklat.
Bacillus merupakan sel berbentuk batang dengan ukuran 0,3-2,2 m x 1,27-7,0 m.
sebagian besar motif flagellum khas lateral membentuk endospora; tidak lebih dari satu
dalam satu sel sporangium. Gram positif. Metabolism dengan respirasi sejati-Fermentasi
sejati atau kedua-duanya yaitu respirasi dan fermentasi. Aerobik sejati atau anaerobic
fakultatif. Umum dijumpai dalam tanah.
















BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan
berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
Isolasi dan inokulasi merupakan percobaan yang sangat penting, karena melihat
kondisi lingkungan di sekitar kita yang banyak terdapat mikroorganisme baik yang patogen
maupun yang non patogen, sehingga pemisahan dan identifikasi bakteri yang satu dengan
lainnya juga dibutuhkan.

3.2 Saran
Diharapkan mahasiswa kedokteran hewan, mampu membedakan bakteri gram positif
dan negatif serta mahasiswa dapat memahami tentang isolasi atau inokulasi bakteri secara
lebih detail.













DAFTAR PUSTAKA

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.(http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/
1/teknik-pewarnaan bakteri.html. 11 November 2010)

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
(http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan
gram-negatif. 11 November 2010).

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia
Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan
Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan
Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
(http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk bakteri.html. 11
November 2010).

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi
UNS.