Aula de

Termodinmica de Sistemas Biomoleculares

Tema:
Espectroscopia de absoro: princpios
bsicos
Aplicao na determinao da concentrao de protenas

Prof. Dr. Jlio Csar Borges
Depto. de Qumica e Fsica Molecular DQFM
Instituto de Qumica de So Carlos IQSC
Universidade de So Paulo USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
Introduo
Importncia
Quantidade de protena na amostra;
Quantidade versus AFINIDADE/TERMODINMICA
M + L ML
S T H K RT G
A
A A = = A ln
] [
] ][ [
ML
L M
K
A
=
Introduo
Importncia
Quantidade de protena na amostra;
Quantidade versus ATIVIDADE/CINTICA
Equao de Michaelis-Menten
E + S ES E + P
] [
] [
1
] [ ] [
] [
] [ ] [
] [
] [
max
S
K
I
K
S E k
S K
S E k
S K
S V
R
I
M
T cat
M
T cat
M
t
+
|
|
.
|

\
|
+
=
+
=
+
=
Introduo
Qualquer trabalho com protena deve envolver a quantificao da amostra

Metodologias
Principais: ESPECTROFOTOMTRICAS
Tipos de Amostras versus Mtodo
Colorimtricos Amostras impuras
- Fenmeno de quantificao indireto
Reao entre corante-protena proporciona cor especfica
Absoro Amostras puras
- Fenmeno de quantificao direto ponto nico!!!
Protena absorve luz
- Importante mtodo de acompanhamento de purificao de protenas
Espectro Eletro-Magntico
Colorimtricos
Visible light
300 nm 200 nm
Ultravioleta
Near UV Far UV
Absoro
Fenmeno da Absoro
Mensurao da Absoro
0
I
I
T =
I
I
Abs
0
log =
Transmitncia versus Absorbncia

Concentrao
A
b
s
o
r
b

n
c
i
a

Concentrao
T
r
a
n
s
m
i
t

n
c
i
a

0
I
I
T =
I
I
Abs
0
log =
Transmitncia versus Absorbncia

Lei de Beer-Lambert


Abs = log I
0
/I = Absorbncia (UA)
= Coeficiente de absortividade molar (mol/L
-1
.cm
-1
)

C = Concentrao Molar (mol/L)
l = Passo ptico (cm)
c l Abs . . c =
Desvio da Lei de Beer-Lambert
Altas concentraes do soluto provoca o bloqueio da passagem de Luz
Existe uma faixa tima para as medidas de Absorbncia
T =I/I
0
Abs =logI
0
/I
95 0.022
90 0,046
50 0,301
10 1,000
5 1,301
2 1,700
1 2,000
Medidas > 90% T e < 10%
Erros altos
Ideal 90% < T > 10%
Mtodos de Determinao da Concentrao de Protenas
Colorimtricos
Biuret Protein Assay: 1949
Cobre em NaOH Complexo Quadrado planar com a ligao peptdica



Desvantagem presena de interferentes que reagem com o Cobre
Lowry assay: 1951
Molibdato, tungstato e H
3
PO
4
xido-reduo na presena de Cu
2+
= 750 nm
- Vantagem Alta sensibilidade
- Desvantagens Muitos interferentes;
- Absortividade muito varivel para diferentes protenas;
- Obedece a lei de Beer-Lambert numa pequena faixa de concentrao.
= 270 nm
- 6 x mais sensibilidade
- Muitos interferentes
= 540 nm
- Banda de escolha para testes analticos
- Menor nmero de interferentes
Mtodos de Determinao da Concentrao de Protenas
Colorimtricos
Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay: 1990
Cu
2+
+ protenas Cu
1+
Complexao com o BCA

= 560 nm
Vantagens: Facilidade, rapidez e alta sensibilidade (= Lowry)
Desvantagens: Dependncia da temperatura reacional e em funo do tempo
- Absortividade muito varivel para diferentes protenas;
- Muitos interferentes (reaes com o Cu
2+
).

Bradford method: 1976
Comassie brilliant blue BG-250 Resduos Aromticos e Bsicos;
Interao com protenas ioniza o corante;
= 595 nm
Vantagens: Sensibilidade; Rapidez; Menor nmero de interferentes.
Desvantagens: Variao da absortividade especfica dependente da solubilidade e
tamanho da protena;
CURVA PADRO
Equao da reta






b = branco da medida
b P a Abs + = ] [
a
b Abs
P

= ] [
Mtodos de Determinao da Concentrao de Protenas
Colorimtricos
Necessitam de Curva Padro com BSA ou a Protena alvo
Erros de 10 a 20%
Cys Cys Tyr Tyr Trp Trp
n n n c c c c . . . ) ( + + =
Mtodos de Determinao da Concentrao de Protenas
Absorbncia no UV (mtodo direto)
Depende do clculo do () Presena de Aminocidos aromticos







Clculo do () a partir dos valores de () dos respectivos aminocidos
Erros de medidas de Absorbncia direta
Medidas de ponto nico
> 80% T e < 20% Abs < 0.1 e > 0.7
Erros altos Linearidade pode ser Comprometida!!!

Ideal 80% < T > 20% 0.1 < Abs > 0.7
Depende do valor de !!!
T =I/I
0
Abs =logI
0
/I
90 0.046
80 ~0,100
50 0,301
20 ~0,700
10 1,000
Mtodos de Determinao da Concentrao de Protenas
Absorbncia no UV (mtodo direto)
Mtodo de Pace: 1995
= 270-280 nm Resduos de Tirosina, Triptofano e cistenas
Usa valores de () dos aminocidos aromticos determinados a partir de vrias
protenas enoveladas
Erros de < 5% (maiores do que os do Mtodo de Edelhoch)
ESTIMATIVA DO COEFICIENTE DE EXTINSO MOLAR
A partir da seqncia de aminocidos
Programa SEDNTERP
Usar valores de () e
leituras de Abs em:
276 nm
278 nm
280 nm
282 nm
Calcular a concentrao
nestes e achar a mdia
Desvio padro da mdia < 5%
ESTIMATIVA DO COEFICIENTE DE EXTINSO MOLAR
A partir da seqncia de aminocidos
Programa SEDNTERP
c l Abs . . c =
l
Abs
c
. c
=
c l Abs . . c =
l
Abs
c
. c
=
ESTIMATIVA DO COEFICIENTE DE EXTINSO MOLAR
A partir da sequncia de aminocidos
Programa ProtParam Tool
Amostrais
- Sais na soluo;
- Pureza da amostra;
- Absoro do tampo.

Erros no Relacionados ao
aparelho ou amostra
- Pipetagens;
- Diluies;
- Reflexo da luz;
- Espalhamento da luz.
PRINCIPAIS FONTES DE ERROS
Aparelho
- Disperso de luz;
- Exatido da absoro/Rudo;
- Exatido do comprimento de onda.