Principio De La Microscopia Electrnica

Dentro de los microscopios electrnicos tenemos el de barrido y el de transmisin.

La ventaja de los microscopios electrnicos frente a los pticos esta en que la longitud
de onda del haz de luz es aproximadamente 1/!!" lo cual aumenta la resolucin.
#icroscopio electrnico de transmisin $ La ptica es muy similar al ptico pero se
diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible.
Este microscopio se basa en los siguientes principios:
% &na fuente" un filamento de tungsteno calentado que emite electrones 'c(todo)
&n (nodo" hacia el cual son atra*dos los electrones
&na diferencia de potencial entre el c(todo y el (nodo imparte un voltaje de
aceleracin entre !.!!! y !!.!!! voltios a los electrones" que crea la haz
+l haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que
las lentes de vidrio de un microscopio ptico
+l condensador forma el haz y modifica el di(metro del haz que incide en el plano del
esp,cimen. +l haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio
de un objetivo y se aumenta aun m(s con una o m(s lentes proyectoras. La imagen final
se visualiza sobre una planilla cubierta por fsforo. Las porciones de la muestra que han
sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes" las porciones que absorvieron o
esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales
pesados durante la preparacin del esp,cimen aparecen oscuras. -e coloca una placa
fotogr(fica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor" con
la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla.
Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio ptico pero
requieren m,todos m(s finos.
Los preparados la restriccin que tienen es que en cada paso se trabaja con especimenes
de magnitud .%/ rdenes menores o m(s finos que los utilizados para el microscopio
ptico. Debido a la gran resolucin de estos microscopios electrnicos la calidad de la
fijacin" es decir el grado de preservacin de la estructura subcelular debe ser la mejor
posible.
La preparacin de rutina de los especimenes para la microscopia electrnica de
transmisin comienza con la fijacin con glutaraldeh*do" seguida de un lavado con un
buffer y de una fijacin con tetrxido de osmio.
0or lo general" se fijan para el microscopio electrnico de transmisin piezas de tejido
no mayores de 1 mm
+l proceso de deshidratacin es id,ntico al empleado en la microscopia ptica
+l tejido incluido en material pl(stico se secciona por medio de micrtomos
especialmente dise1ados" que usan cuchillas de diamante.
Debido al limitado poder de penetracin de los electrones" el espesor de los cortes
preparados para el microscopio electrnico de transmisin varia entre 2! nm y 12! nm.
+stos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados3 se los hace flotar desde
el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de l*quido" se recuperan y se
colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por pl(stico. +stas rejillas tienen 2!%
/!! orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados.
0or lo general" la coloracin de los cortes para microscopio electrnico de transmisin
se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad" tales
.
como iones de metales pesados. +stos iones de metales pesados se unen a los tejidos
durante la fijacin o la deshidratacin o al sumergir las muestras en soluciones de tales
iones despu,s del corte. +l terxido de osmio que se emplea de rutina en el fijador se
une a los componentes fosfolip*dicos de las membranas" lo cual agraga densidad a la
membrana.
4 menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohlicas usadas en la
deshidratacin" con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones
celulares y a otros sitios. La inmersin secuencial en soluciones de acetato de uranilo y
citrato de plomo se usa rutinariamente para te1ir los cortes antes de observarlos con
microscopio electrnico de transmisin.
La congelacin%fractura es un m,todo especial de preparacin de la muestra para
microscopia electrnica de transmisin" de gran importancia en el estudio de
membranas.
+l material a examinar puede estar fijado o no3 en el primer caso se elimina el fijador
del tejido por medio de lavados" antes de procesarlo. -e infiltra el tejido con un
crioprotector" como el glicerol y se congela r(pidamente a unos $15! grados
cent*grados.
#icroscopio electrnico de barrido -e asemeja m(s que al microscopio electrnico de
transmisin a los tubos de televisin de donde deriva la microscopia electrnica. 0ara
analizar la mayor*a de los tejidos se deja la muestra" se deshidrata por desecacin de
punto cr*tico" se cubre con una pel*cula evaporada de oro%carbn" se monta en un taco
de aluminio y se coloca en la c(mara de muestras del microscopio. +n los tejidos
mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lej*a y analizar las
caracter*sticas estructurales del mineral.
-e logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a
trav,s de la superficie un tubo de televisin. Los electrones reflejados desde la
superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por
uno o m(s detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en un
televisin.
-e pueden tomar fotograf*as para registrar los datos o la imagen en una cinta de video.
-e pueden usar otros detectores para medir los rayos 6 emitidos desde la superficie" la
catodoluminiscencia de las mol,culas del tejido por debajo de la superficie y los
electrones de 4uger emitidos en la superficie.
#uchos microscopios combinan las caracter*sticas de un microscopio electrnico de
transmisin y de barrido" el cual permite microan(lisis por rayos 6 con sonda
electrnica.
-e pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos 6 emitidos cuando el
haz de bombardea el corte histolgico" y mediante analizadores apropiados se construye
un mapa que muestra la distribucin en los cortes de los elementos que tienen n7mero
atmico mayor de 1" en concentracin suficiente para producir rayos 6 en cantidad tal
que se pueda analizar.
/
Principio Del Microscopio Contraste De Fases
Las c,lulas vivas son transparentes a la luz visible" por lo tanto los rayos de luz pasan a
trav,s sin sufrir p,rdidas en intensidad.
La luz transmitida a trav,s de las c,lulas vivientes" sin embargo" encuentra a su paso"
regiones de *ndices de refraccin diferentes" y diferentes grosores y/o densidades" lo que
es capaz de alterar su velocidad y su direccin. +n la 8igura se da la representacin
esquem(tica en donde dos regiones adyacentes de una misma c,lula" 4 y 9" de un
diferente grosor" t
1
y t

y con diferentes *ndices de refraccin" n

1
y n

" son atravesadas por

un rayo luminoso.
Las variaciones en grosor e *ndices de refraccin son capaces de producir una
diferencia en el curso ptico de la luz transmitida por las dos regiones. +n este caso
espec*fico" le toma m(s tiempo pasar a la luz a trav,s de la fraccin 9" cuyo *ndice de
refraccin es mayor 'n

) y por lo tanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con

respecto al que es capaz de atravesar la porcin 4" cuyo *ndice de refraccin es m(s bajo.
-i la diferencia de los *ndices de refraccin es peque1a" la magnitud del cambio de
fase inducido igualmente es muy peque1a y se mide en t,rminos de longitudes de onda
' ). 4s*" en la representacin de la 8igura 1" el rayo que pasa a trav,s de la parte 9 se
muestra retrasado 1// de longitud de onda ' //) y emerge fuera de fase. con respecto a
la transmisin que nos muestra la parte 4.
Diseo del instrumento ptico
+l sistema ptico del microscopio de contraste de fases difiere del microscopio ordinario
'de luz) solamente en la adicin de un diafragma anular colocado debajo de la platina
para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una placa de difraccin montada en
el objetivo" un diagrama representado en la 8igura " muestra el dise1o de un microscopio
de contraste de fase y el curso que siguen los rayos que pasan a trav,s de una estructura
celular.
2
La fase relativa de luz desviada" saldra 1// de longitud de onda retrasado" s* es
capturada y cambiada con la introduccin de un material retrasador de fase" en aquella
parte de la placa de difraccin que sea cubierta por cualquiera de los dos rayos"
aumentando a7n m(s" otro 1// de longitud de onda y logrando retrasar en rayo luminoso
en total 1/ longitud de onda" con lo que se logra que este rayo quede totalmente fuera de
fase con respecto a la luz no desviada.

:uando la diferencia se presenta es por que los *ndices de refraccin son diferentes y el
microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones en brillo o intensidad. Las
estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son objetos pticamente no
homog,neos3 as*" la luz que ;choca; con el objeto se presenta desviada.

Contraste de fase oscuro o positivo:
:uando los rayos de luz" la desviada y la no desviada tienden a cancelarse creando una
interferencia destructiva y hacer que el objeto aparezca mucho m(s oscuro que los
alrededores.
Contraste de fase brillante o negativo:
-e presenta cuando retrasamos la luz no desviada y la hacemos 1// de longitud de onda
menor" lo que hace que salga al tiempo con la luz desviada" que tiene un retraso de 1//
de longitud de onda" logrando de esta manera que salgan al mismo tiempo y se
recombinen para dar brillo" creando una interferencia constructiva3 aumentando en esta
forma el objeto mientras su contorno permanece con menos intensidad.
5
Principio De La Microscopa De Fluorescencia
Las mol,culas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y
emiten luz de otra longitud de onda m(s larga. -i un componente de este tipo es
iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a trav,s de un filtro que slo
permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida" el componente
aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una
propiedad caracter*stica de la mol,cula fluorescente utilizada.
Los colorantes fluorescentes utilizados para la tincin celular son detectados con ayuda
del microscopio de fluorescencia. +ste microscopio es similar al microscopio
convencional" a excepcin de que la luz incidente que procede de una potente fuente
atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al
fluorocromo" antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra 'reflejada y
fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisin
del fluorocromo.
+n la imagen se muestra el esquema de
funcionamiento de un microscopio de
epifluorescencia" en el que la luz incide sobre la
preparacin a trav,s de las lentes del objetivo. +ste
microscopio" de gran poder de resolucin tiene que
tener objetivos de cuarzo para permitir el paso de la
luz ultravioleta. +n el esquema se sit7an los tres
elementos caracter*sticos del microscopio de
fluorescencia<
1. primer filtro de corte o filtro de excitacin. +s el filtro que selecciona la luz de la
longitud de onda incidente. +n el esquema est( seleccionando luz de longitud de
onda entre /2! y /=! nm 'azul)
. espejo de ranuras ordenadas o especjo dicroico. -e trata de un espejo que tiene la
propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. +n
este caso refleja luz de longitud de onda menos de 21! nm 'por ello refleja la luz
incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 21! nm" dejando
pasar la luz verde emitida por el fluorocromo presente en la muestra.
.. segundo filtro de corte o filtro de emisin. +s el filtro que selecciona la luz de
longitud de onda fluorescente. +n este caos deja pasar la luz de longitud de onda
2! a 25! nm.
+n el esquema los filtros que se han indicado ser*an los que emplear*amos la
fluorescencia asociada al isotiocianato de fluoresce*na" mol,cula fluorescente
ampliamente utilizada en microscop*a de fluorescencia acoplada a anticuerpos.
+xisten un gran n7mero de juegos de filtros de excitacin y de emisin para los diferentes
fluorocromos" inclusive conjuntos que permiten la observacin simult(nea de dos
>
fluorocromos. +s de gran importancia seleccionar el adecuado conjunto de filtros para la
observacin. +n las im(genes de la parte inferior veremos el resultado de la observacin
de una preparacin de c,lulas 0t? en las que se ha inmunodetectado la tubulina
mediante anticuerpos acomplejados a fluoresce*na 'verde)" y se ha te1ido el n7cleo con
D40@ 'azul). -e muestra el espectro caracter*stico de tres sistemas de filtros 'A&" A@9 y
8@B:CD40@).
filtros espectros imagen
!
-e detecta la emisin de D40@ pero no
la de 8@B: por su baja excitacin.
"#
-e detecta la emisin de 8@B: pero no
la de D40@ pues no es excitado.
F"$C % D&P"
+l filtro de dos bandas 8@B: y D40@
permite la correcta excitacin y
deteccin simult(nea de 8@B: y D40@.
D
+n numerosas ocasiones es muy conveniente combinar la observacin de la preparacin
con dos t,cnicas diferentes" una panor(mica que informe del aspecto general de la misma
'por ejemplo microscop*a de contraste de fases o microscop*a interferencial) y una
segunda que nos de una imagen espec*fica de uno o pocos componentes 'por ej. la
microscop*a de fluorescencia). 4 continuacin tienes dos ejemplos de estas t,cnicas
combinadas.
t'cnica
estructura de los
grupos pticos
imagen
Contraste de fases ( epifluorescencia
La imagen superior corresponde a la
imagen de fluorescencia" la segunda a la
de contraste de fases y la tercera a la
combinada.
"nterferencial de )omars*i (
epifluorescencia
La imagen superior corresponde a la
imagen de fluorescencia" la segunda a la
interferencial de EomarsFi y la tercera a la
combinada.
=