Anda di halaman 1dari 18

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN


ELEKTROFORESIS SDS-PAGE
NAMA : WAHYU ERWIN FIRMANSYAH
NIM : 125100101111014
KELOMPOK : J3
KELAS : J
ASISTEN : ISMI
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
1
BAB IX
ELEKTROFORESIS SDS-PAGE
A. Pre-lab
1. Apa yang dimaksud elektroforesis ?
Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah
molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang
serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus
listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan
negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan
bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya (Yuwono,
2008).
2. Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing-masing!
Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.
Elektroforesis Kertas: merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai
fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks) sebagai
fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang
sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit,
kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut (Boyer, 2004).
Elektroforesis Gel: merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita
yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama.
Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara
memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang
dibantu dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Media atau gel
yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel
(elektroforesis protein). Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran molekul,
konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan
buffer elektroforesis (Martin, 2006).
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
2
3. Apa fungsi SDS pada metode SDS-PAGE ?
SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan
molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada
metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan
muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi
protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk,
ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur
kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu
medan listrik (Anam, 2009).
4. Apa fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE?
Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat
timbulnya panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk
memisahkan molekul protein yang kecil. Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat
mempengaruhi migrasi protein. Pada proses pembuatan gel, akrilamid akan
berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen (Prihanto, 2011).
5. Apa tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis?
Tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis yaitu untuk memisahkan
protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid.
Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis protein dalam bahan atau sampel
yang akan dianalisis. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan digunakan sebagai
metode pemisahan untuk menentukan komponen dari protein (Wibowo, 2010).
6. Mengapa protein-protein tersebut dapat terpisah?
Protein-protein tersebut dapat terpisah karena adanya proses separasi pada protein
memisahkan molekul-molekul protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas
molekul protein dengan panjang yang sama. Protein dapat terpisah dengan cara memberi
gaya pada protein tersebut untuk melewati medium berisi gel (poliakrilamid) yang
dibantu dengan adanya listrik. Protein yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium
berisi tenaga listrik. Molekul-molekul dari protein akan bermigrasi menuju kutub positif
atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Pemisahan molekul
protein berdasarkan pada tingkat migrasi dan berat molekulnya dalam sebuah medan
listrik (Wibowo, 2010).
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
3
7. Bagaimana cara mengatur ukuran pori gel ?
Cara mengatur ukuran pori gel yaitu bergantung pada konsentrasi gel akrilamid
yang akan digunakan dan cros-linker (bis). Semakin tinggi konsentrasi akrilamid maka
diameter pori-pori di dalam gel akan semakin kecil, sebaliknya jika konsentrasi akrilamid
rendah maka diameter pori-pori di dalam gel akan semakin besar. Apabila protein
berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka memerlukan gel dengan
konsentrasi akrilamid yang kecil, dengan demikian ukuran pori di dalam gel akan besar
(Prihanto, 2011).
8. Apa yang dimaksud dengan stacking gel? Mengapa stacking gel diperlukan?
Stacking gel merupakan salah satu gel yang digunakan dalam SDS-PAGE. Stacking
gel merupakan gel pengumpul atau gel penimbun yang terletak pada bagian atas.
Stacking gel dibuat dengan campuran antara akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, steril
aquades, SDS 10%, Ammonium Phosphate (APS) 10%, dan temed (Utami, 2007).
Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk
mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein
menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel pemisah. Stacking gel
juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang
bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, protein akan tertarik ke bagian bawah arus
listrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik
sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar
akan berada pada bagian atas dari gel (Utami, 2007).
9. Apa fungsi pewarnaan gel pada metode elektroforesis ?
Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDS-PAGE.
Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis yaitu untuk membantu memonitor jalannya
elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein terdiri dari commasie
blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat
dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentuk pada gel pemisah. Jarak migrasi diukur
dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol.
Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama
elektroforesis (Anam, 2009).
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
4
B. Diagram Alir Elektroforesis
1. Pembuatan gel
Dimasukan beaker glass dan diaduk
Diaduk hingga tercampur
Dituang pada cetakan gel dengan mikropipet tinggi tertentu
Dituang aquades dengan mikropipet pada permukaan gel
Dibiarkan 15-30 menit pada suhu ruang
Dibuang aquades dengan tissue
2. Persiapan sampel
Dilarutkan dalam sampel buffer
Dipanaskan suhu 90oC, 5 menit
Aquades 1700 micro liter
LGB 1300 micro liter 30% akrilamid
TEMED 3 ml APS 10% 35 micro liter
Hasil
Sampel
Hasil
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
5
3. Pemisahan protein dengan elektroforesis
Dimasukkan beaker glass dan diaduk
Diaduk hingga tercampur
Dituang gel pemisah
Disiapkan gigi sisir pada stacking gel jangan sampai ada gelembung
Gel dibiarkan terpolimerisasi 15-30 menit pada suhu ruang
Sisir diambil secara perlahan dari gel
Gel dipindahkan ke elektroforensis
Dimasukkan buffer ke tank elektroforensis
4. Pewarnaan gel
Dimasukkan dalam sumuran
Dipasang elektroda sesuai warna
Gel dipisahkan pada tegangan 200 V, 60 menit
Aquades 1475 micro liter
30% akrilamid 400
microliter
UGB 625 micro liter
APS 10% 20 micro liter
TEMED 4 micro liter
Hasil
10 ml sampel
Hasil
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
6
Dipisahkan gel dari tank
Dipindahkan glass plate dari gel kedua sisi
Dituang larutan pewarna gel dalam wadah
Ditutup dengan plastik dan letakkan shacker 5-30 menit
Dimasukkan ke penghilang warna
Dipindahkan larutan pewarna dari gel, bilas aquades
Dituangkan larutan pembilas
Dibiarkan 15-30 menit
Diganti larutan pembilas dengan yang baru hingga terbentuk pita proton pada
gel
Arus Listrik
Potongan kertas saring
Hasil
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
7
C. Hasil dan Pembahasan
Data Hasil Pengamatan
Protein
Marker
BM (KDa)
Panjang Pita
(cm)
Log (BM) RF
I 225 2,3 2,352 0,479
II 150 2,6 2,176 0,542
III 100 2,9 2 0,604
IV 75 3,5 1,875 0,729
V 50 4,1 1,698 0,854
VI 35
VII 25
Perhitungan
Panjang separating gel = 4,8 cm
Panjang pita sampel = 3,2 cm
RF
(sampel)
= =
,
,
= 0,667
RF
I
= =
,
,
= 0,479
RF
II
= =
,
,
= 0,542
RF
III
= =
,
,
= 0,604
RF
IV
= =
,
,
= 0,729
RF
V
= =
,
,
= 0,854
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
8
Kurva Log BM
RF
(sampel)
= x
y = -1,6552x + 3,0822
y = -1,6552(0,677) + 3,0822
y = -1,104 + 3,0822
y = 1,978
y = log BM
BM = anti log y
BM = anti log 1,978
BM = 95,060 KDa
Gambar Gel SDS-PAGE
Prinsip Elektroforesis
Prinsip yang digunakan pada elektroforesis yaitu memisahkan protein
berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid.
Protein terseparasi dalam medan listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan
warna dan pembilasan gel. Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat
pita yang terbentuk oleh marker.
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
8
Kurva Log BM
RF
(sampel)
= x
y = -1,6552x + 3,0822
y = -1,6552(0,677) + 3,0822
y = -1,104 + 3,0822
y = 1,978
y = log BM
BM = anti log y
BM = anti log 1,978
BM = 95,060 KDa
Gambar Gel SDS-PAGE
Prinsip Elektroforesis
Prinsip yang digunakan pada elektroforesis yaitu memisahkan protein
berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid.
Protein terseparasi dalam medan listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan
warna dan pembilasan gel. Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat
pita yang terbentuk oleh marker.
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
8
Kurva Log BM
RF
(sampel)
= x
y = -1,6552x + 3,0822
y = -1,6552(0,677) + 3,0822
y = -1,104 + 3,0822
y = 1,978
y = log BM
BM = anti log y
BM = anti log 1,978
BM = 95,060 KDa
Gambar Gel SDS-PAGE
Prinsip Elektroforesis
Prinsip yang digunakan pada elektroforesis yaitu memisahkan protein
berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid.
Protein terseparasi dalam medan listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan
warna dan pembilasan gel. Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat
pita yang terbentuk oleh marker.
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
9
Rumus Elektroforesis
RF (Retention Factor)
RF =
y = ax + b x = RF ; y = log BM
Analisis Prosedur Elektroforesis
Pada percobaan Elektroforesis SDS-PAGE, alat yang digunakan antara lain:
seperangkat alat elektroforesis, kaca load, comb (sisir), mikropipet, mikrotip, beaker
glass, timbangan analitik, spatula, tube elektroforesis, kompor listrik, kuvet, dan
spektrometer. Sedangkan bahan yang digunakan antara lain: aquades, akrilamid, LGB
(Lower Gel Buffer), UGB (Upper Gel Buffer), TEMED (Tetra Etil Metil Ethilene Diamine,
APS (Amonia persulfat), pepsin, Running Buffer (berisi SDS), larutan pewarna
(Croomasil Brilian Blue, metanol, asam asetat glasial, aquabides), larutan pembilas
(metanol, asam asetat glasial, aquabides).
Pada percobaan Elektroforesis SDS hal yang pertama kali dilakukan yaitu
preparasi sampel dan bahan. Sampel yang digunakan yaitu enzim pepsin. Sampel
pepsin masing-masing ditimbang dengan timbangan analitik sebanyak 0,005 gr, 0,0075
gr, 0,01 gr, 0,0125 gr, dan 0,015 gr. Kemudian masing-masing sampel dibungkus
dengan kertas alumunium foil. Proses selanjutnya yaitu pembuatan separating gel (gel
pemisah). Namun sebelum pembuatan separating gel dilakukan preparasi bahan-bahan
penyusunnya seperti APS. Untuk APS (Amonium persulfat) ditimbang sebanyak 0,1
gram. APS digunakan sebagai inisiator yang dapat mengaktifkan akrilamid agar
bereaksi dengan gel poliakrilamid lain membentuk rantai polimer yang panjang.
Separating gel yang akan dibuat berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi
protein berdasarkan berat molekulnya. Pertama dimasukkan aquades 1700 L, 30%
Akrilamid 200 L, dan LGB 1300 L ke dalam beaker glass. Penambahan akrilamid
berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses pemisahan gel sedang LGB
sebagai buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 40 L dan TEMED 35 L secara
bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna. Setelah itu
diaduk supaya homogen.
Sebelum separating gel dimasukkan ke dalam cetakan, terlebih dahulu kaca
loading dibersihkan dengan cara dibilas menggunakan aquades sampai bersih
kemudian di lap searah menggunakan tisu,hal ini bertujuan agar kaca tidak tergores
sehingga mempengarui proses analisis yang dilakukan. Setelah itu kaca loading
dipasang pada alat elektroforesis, separating gel yang telah dibuat dimasukkan
kedalam cetakan dengan menggunakan mikropipet sampai pada batas yang ditentukan
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
10
yakni sekitar bagian dan bagian sisanya digunakan untuk stacking gel. Setelah itu
gel dibiarkan terpolimerisasi dalam suhu ruang selama 15 menit. Kemudian dituangkan
sedikit aquades untuk membuat permukaan separating gel datar/gel yang dibentuk
tidak bergerigi yang dapat menyebabkan adanya sekat diantara separating gel dengan
stacking gel yang dapat mengganggu proses pemisahan molekul. Aquades yang
ditambahkan kemudian diserap dengan menggunakan tisu agar tidak mempengaruhi
gel yang terbentuk.
Selanjutnya dibuat stacking gel (gel pengumpul). Cara pembuatan stacking gel
hampir sama dengan pembuatan separating gel, yang membedakan yaitu banyaknya
atau jumlah yang ditambahkan. Selain itu pada stacking gel digunakan UGP (Upper gel
buffer) sebagai buffer pada gel. Langkah pembuatanya yaitu pertama dimasukkan
aquades 1475 L, 30% Akrilamid 400 L, dan UGB 625 L ke dalam beaker glass.
Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses
pemisahan gel sedang UGB sebagai buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 20 L dan
TEMED 4 L secara bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara
sempurna. Setelah itu diaduk supaya homogen.
Langkah selanjutnya yaitu memasukkan stacking gel diatas gel pemisah dan
disisipkan gigi sisir yang berfungsi untuk mencetak sumuran yang akan digunakan
sebagai tempat meneteskan sampel. Gigi sisir dibiarkan sampai gel terpolimerisasi
pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah terbentuk sumuran selanjutnya gigi sisir
diambil dari gel. Gel yang telah terbentuk kemudian dipindahkan ke dalam tank
elektroforesis dan siapkan digunakan untuk proses selanjutnya.
Sementara itu, sampel pepsin yang masing-masing telah ditimbang sebanyak
0,005 gr, 0,0075 gr, 0,01 gr, 0,0125 gr, dan 0,015 gr yang dibungkus alumunium foil
masing-masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf lalu ditambahkan masing-
masing sampel buffer sebanyak 0,5 L yang didalamnya mengandung SDS yang akan
memberikan muatan negatif pada sampel yang dianalisis serta -mercaptoetanol yang
dapat mereduksi ikatan disulfida pada protein. Kemudian sampel dipanaskan diatas
kompor listrik sehingga sampel dapat terdenaturasi sempurna pada suhu 90C selama 5
menit. Selanjutnya sampel diangkat dan didinginkan untuk selanjutnya dilakukan
proses analisis. Sampel yang telah tersedia kemudian dimasukkan ke dalam sumuran
sebanyak 0,01 L. Kemudian alat elektrolisis dipasang dan dimasukkan buffer tank ke
dalam tank elektrolisis sampai pada batas sumuran. Buffer ini digunakan sebagai
penghantar listrik yang akan membantu memisahkan sampel saat alat dinyalakan.
Pada proses pewarnaan, gel yang telah dielektroforesis dipindahkan dari tank
kedalam wadah plastik. Pewarnaan (staining) pita protein dilakukan dengan jalan
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
11
merendam gel hasil elektroforesis (setelah dilepas dari rangkaian plat) dalam larutan
Coomasie brilliant blue (CBB) lalu gel yang terdapat dalam wadah plastik dishaker
selama 15 menit, penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining
yang dilakukan oleh CBB. kemudian dilakukan destaining untuk menghilangkan
kelebihan warna dengan jalan merendam gel dalam larutan destaining (aquabides,
metanol, asam asetat glasial dan Coomasie brilliant blue) dan dishaker selama 10 menit.
Selain itu, perendaman dengan larutan destaining bertujuan untuk menghilangkan CBB
yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan
CBB yang tidak berada pada band protein. Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan
aquades serta dimasukkan potongan kertas saring untuk menyerap warna yang akan
dibilas hingga gel menjadi jernih dengan pita terpisah jelas satu sama lainnya.
Pembilasan berfungsi untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan
pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Kemudian dilakukan penghitungan
Rf (Retention factor) pada sampel yang telah terpisah yang kemudian digunakan untuk
mencari berat molekul dari sampel.
Analisis Hasil Elektroforesis
Dari hasil percobaan elektroforesis yang dilakukan pada sampel enzim pepsin
didapatkan pita-pita dimana dari pita yang terbentuk dihitung panjang atau RF
(Retention Factor) yang akhirnya didapatkan BM sampel. Pada percobaan tersebut
digunakan marker yaitu protein yang mengandung beberapa komponen enzim.
Sementara itu sumuran/well yang terbentuk ada 10 dimana pada sumuran pertama diisi
dengan protein marker. Sampel enzim pepsin yang diinjeksikan ada 5 dengan
konsentrasi yang berbeda-beda. Pepsin dengan konsentrasi 0,005 L dimasukkan ke
sumuran no.2, pepsin dengan konsentrasi 0,0075 L dimasukkan ke sumuran no.8,
pepsin dengan konsentrasi 0,01 L dimasukkan ke sumuran no.9, pepsin dengan
konsentrasi 0,0125 L dimasukkan ke sumuran no.10, dan pepsin dengan konsentrasi
0,015 L dimasukkan ke sumuran no.3. pada sumuran 4,5,6, dan & 7 tidak digunakan
karena ada gelembung-gelembung.
Setelah dilakukan running, pita yang terbentuk selama percobaan yaitu ada 5.
Pada marker I dengan BM 225 KDa, panjang pita yaitu 2,3 cm, log BM 2,352, dan RF
0,479. Pada marker II dengan BM 150 KDa, panjang pita yaitu 2,6 cm, log BM 2,176, dan
RF 0,542. Pada marker III dengan BM 100 KDa, panjang pita yaitu 2,9 cm, log BM 2, dan
RF 0,604. Pada marker IV dengan BM 75 KDa, panjang pita yaitu 3,5 cm, log BM 1,875,
dan RF 0,729. Pada marker V dengan BM 50 KDa, panjang pita yaitu 4,1 cm, log BM
1,698, dan RF 0,854. Pada marker VI dan VII tidak terbentuk pita sehingga tidak dapat
diketahui nilai RF. Dari hasil percobaan didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
12
sampel maka pita yang terbentuk akan semakin tebal. RF yang didapatkan merupakan
retention factor yaitu faktor retensi atau hambatan yang berarti pemisahan protein pada
gel. Prinsipnya yaitu penghambatan terhadap laju migrasi dari proteinprotein
tersebut sehingga pemisahan karena perbedaan
berat molekul mengakibatkan terbentuknya pitapita pada jarak migrasi yang berbeda
satu sama lain dan jarak tersebut di konversi menjadi nilai RF. Dari marker I-V
menunjukkan bahwa semakin besar nilai RF maka akan berbanding terbalik dengan
berat molekul yang semakin kecil.
Dari hasil percobaan didapatkan panjang pita sampel 3,2 cm dengan panjang
separating gel 4,8 cm. Sehingga dari data tersebut dapat dihitung RF sampel dengan
rumus RF = dan didapatkan RF sampel sebesar 0,667. Dari RF dan
log BM selanjutnya dibuat kurva sehingga didapatkan persamaan y = -1,6552x + 3,0822
dimana x=RF sampel dan y=log BM. Dari persamaan tersebut didapatkan y atau log BM
yang kemudian dicari BM sampel dengan antilog y sehingga didapatkan BM sampel
sebesar 95,060 KDa.
Apabila diperhatikan posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada gel,
akan terlihat bahwa pita sampel membentuk garis lurus dengan marker. Hal ini
menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama karena sampel
yang digunakan sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat yang sama akan
bergerak menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Suranto, 2006).
Pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel
sampel yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik
pada sampel yang bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama
akan terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan
panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya (Hames, 2004).
Dari hasil percobaan, sampel membentuk garis lurus. Hal tersebut
mengindikasikan bahwa sampel-sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama
karena sampel yang digunakan sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat yang
sama akan bergerak menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus
(Bollag, 2009).
Sebenarnya Elektroforesis protein dan enzim itu hampir sama prinsipnya. Namun
yang membedakan antara elektroforesis enzim dan protein yaitu pada Elektroforesis
protein mengandung beberapa jenis asam amino yang memiliki berat molekul yang
berbeda-beda yang akan terpisah ketika proses running pada gel poliakrilamid.
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
13
Sedangkan pada elektroforesis enzim hanya memiliki satu komponen spesifik yang
tidak bisa dipisah lagi (Alberts, 2009).
Berat molekul yang didapatkan dari percobaan dengan literatur berbeda jauh
dimana pada hasil percobaan dengan BM 95,060 KDa. Sedangkan menurut Fatchiyah
(2011), berat molekul enzim pepsin yaitu 34,5 KDa. BM tersebut sangat berbeda yang
disebabkan oleh beberapa faktor. Selain itu sampel metode elektroforesis yang
digunakan adalah enzim sedangkan metode elektroforesis yang digunakan adalah
elektroforesis protein.
Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis kali ini yaitu
ukuran dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage.
Ukuran dan Bentuk Molekul : . Semakin besar ukuran molekul maka pergerakan
akan semakin lambat, bentuk molekul sekunder atau tersier mempunyai
pergerakan yang lebih lambat dari pada protein primer.
Konsentrasi Gel : Pada konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan protein
lebih cepat dan sebaliknya pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka
pergerakan protein akan lebih lambat.
pH : Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena
akan mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi
tingkat dan arah pergerakan protein.
Suhu : suhu akan mempengaruhi denaturasi protein dimana pada Elektroforesis
digunakan suhu 90-95
o
C untuk mendenaturasi protein.
Voltage : voltage yang digunakan juga mempengaruhi pergerakan protein
dimana dengan voltage yang tinggi maka pergerakan protein dalam gel
elektroforesis akan lebih cepat, sebaliknya jika voltage yang digunakan rendah
maka pergerakan protein dalam gel akan lambat.
Pertanyaan
1. Ada berapa pita yang terbentuk ? Jelaskan !
Pita yang terbentuk ada lima. Pita terbentuk karena perbedaan berat molekul. Selain
itu pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah
partikel sampel yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya
muatan listrik pada sampel yang bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki
berat molekul sama akan terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk
beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat
molekulnya
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
14
2. Apakah kepekatan warna pita berkaitan dengan konsentrasi protein ?
Iya, kepekatan warna pita berkaitan dengan konsentrasi protein. Tebal tipisnya pita
yang terbentuk dari pita protein menunjukkan konsentrasi atau banyaknya protein
yang memiliki berat molekul sama yang berada pada posisi pita yang sama. Semakin
tinggi konsentrasi sampel semakin tebal pita yang terbentuk. Hal ini sejalan dengan
prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak
bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang
sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.
3. Bagaimana cara mengidentifikasi jenis protein yang membentuk pita pada gel
elektroforesis ?
Cara mengidentifikasi jenis protein yang membentuk pita pada gel elektroforesis
yaitu dengan membandingkan posisi pita sampel dengan pita pada jalur
marker/standar yang telah diketahui berat molekulnya. Marker atau penanda
merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan
untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis
marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur
marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran
molekul.
4. Apakah fungsi penambahan merkaptoetanol pada persiapan sampel ?
Fungsi penambahan merkaptoetanol pada persiapan sampel yaitu untuk mereduksi
ikatan disulfida yang terdapat pada protein sehingga protein tidak memiliki struktur
tersier maupun sekunder dan akan lebih mudah untuk dipisahkan dalam analisis
elektroforesis.
5. Apakah fungsi pemanasan sampel protein ?
Fungsi pemanasan sampel protein yaitu untuk mendenaturasi protein yang akan
dianalisis sehingga protein tidak lagi memiliki struktur tersier ataupun sekunder.
Dengan demikian ketika dilakukan proses pemisahan ukuran protein yang lebih
sederhana akan memiliki pergerakan yang lebih cepat. Selain itu pemanasan sampel
protein juga berfungsi untuk mempercepat reaksi (katalis) karena ketika sampel
ditambahkan dengan sampel buffer proses pemanasan akan mempercepat adanya
interaksi dan reaksi antara keduannya.
6. Mengapa pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein ?
Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena akan
mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
15
arah pergerakan protein. Pada titik isolelektrik, protein akan terdenaturasi sehingga
ikatan-ikatan protein akan terputus dan menghasilkan molekul yang lebih sederhana
sehingga akan mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan protein.
7. Reagen apa yang berfungsi untuk mempolimerisasi gel ?
Reagen yang berfungsi untuk mempolimerisasi gel yaitu APS (Amonium persulfat)
dan TEMED (Tetra Ethyl Methyl Ethilene Diamine). APS berfungsi sebagai inisiator
yang mengaktifkan akrilamid agar dapat bereaksi dengan poliakrilamid lain
membentuk rantai polimer yang panjang. Sedangka TEMED berfungsi sebagai
katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat
dingunakan dalam pemisahan protein.
8. Faktor-faktor apa yang mempengaruhi pergerakan protein dalam gel elektroforesis ?
Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan protein dalam gel elektroforesis yaitu
ukuran dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, dan voltage. Semakin besar ukuran
molekul maka pergerakan akan semakin lambat, bentuk molekul sekunder atau
tersier mempunyai pergerakan yang lebih lambat dari pada protein primer. Pada
konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan protein lebih cepat dan sebaliknya
pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka pergerakan protein akan lebih lambat.
Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena akan
mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan
arah pergerakan protein. Selain itu voltage yang digunakan juga mempengaruhi
pergerakan protein dimana dengan voltage yang tinggi maka pergerakan protein
dalam gel elektroforesis akan lebih cepat, sebaliknya jika voltage yang digunakan
rendah maka pergerakan protein dalam gel akan lambat.
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
16
KESIMPULAN
Dari hasil percobaan Elektroforesis yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan
bahwa prinsip dari elektroforesis yaitu memisahkan protein berdasarkan berat molekul
dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Protein terseparasi dalam medan
listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna dan pembilasan gel.
Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh
marker. Rumus yang diguinakan yaitu RF = , y = ax + b; x = RF; y =
log BM.
Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis kali ini yaitu
ukuran dan bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage dimana faktor-faktor
tersebut akan berpebgaruh terhadap pergerakan protein selama elektroforesis.
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan didapatkan hasil dengan panjang
pita sampel 3,2 cm dan panjang separating gel 4,8 cm dimana RF yang didapatkan yaitu
0,667. BM dari enzim pepsin yaitu 95,060 KDa.
Wahyu Erwin Firmansyah
THP-FTP-UB-2014
17
DAFTAR PUSTAKA
Alberts B, Johnson A., Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2009. Molecular Biology of
The Cell, 4th Edition. Garland Scince. USA
Anam, K. 2009. SDS-PAGE dengan Silver Staining dan Zimogram. Bioteknologi Sekolah
Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. 2009. Protein Methods. New York: A John Wiley and Sons
Inc
Boyer, R. 2004. Modern Experimental Biochemistry. California: The Benjamin Publishing
Company
Fatchiyah, A., dkk 2011. Biologi Molekuler: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit
Erlangga
Hames, B.D & Rickwood. 2004. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein.
Huntington: Robert E Krieger Publishing Company
Martin, R. 2006. Gel Electroforesis: Nucleid Acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd.
Prihanto, A.A. 2011. Teknik Molekuler: Elektroforesis. http://asep.lecture.ub.ac.id.
Diakses Tanggal 15 Mei 2014
Suranto. 2006. Electrophoresis Studies of Ranunculus Triplodantus Population.
Biodiversitas. 1(1) 1-7
Utami, E.S.W., dkk. 2007. Sintetis Protein Selama Embriogenesis Somatik Anggrek Bulan
Phalaenopsis amabilis (L.). Jurnal Biodiversitas. Vol.8, No.3, Hal.188-191
Wibowo, M.S. 2010. Elektroforesis. Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung
Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Penerbit Erlangga