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DEMOSTRACION DEL EFECTO DEL pH Y
LA TEMPERATURASOBRE LA VELOCIDAD
DE LA REACCIN ENZIMTICA




1. OBJETIVOS
1.1 Demostrar el efecto o influencia del pH sobre la velocidad de reaccin de la
amilasa.
1.2 Demostrar el efecto o influencia de la temperatura sobre la velocidad de
reaccin de la amilasa.

2. INTRODUCCION
Las enzimas, en general, al actuar como biocatalizadores, aceleran reacciones qumicas
especficas, experimentando cambios fsicos durante ellas, pero recuperando su estado
original cuando la reaccin qumica ha terminado. Sin embargo dada la naturaleza
proteica de la molcula enzimtica, diferentes factores fsicos y qumicos pueden
modificar la actividad de una enzima, siendo lo ms importante la temperatura y el pH.
Las enzimas transforman rpidamente los sustratos a temperaturas y a valores de pH
ptimos caractersticos para cada una respectivamente.
Respecto al pH, las enzimas requieren, para actuar con mxima eficiencia, una
determinada concentracin de iones hidrogeno en el medio, por tanto, cada enzima tiene
un pH ptimo de accin. El efecto del pH se explica por la accin de la concentracin
de protones en la disociacin de distintos grupos del sustrato y en especial de la enzima,
que participan tanto en la unin enzima-sustrato y en el mecanismo cataltico mismo,
como en el mantenimiento de la determinada conformacin de la enzima. A valores de
pH por encima o por debajo del pH optimo, disminuye la actividad enzimtica por lo
que, generalmente se describe una curva en forma de campana.
Respecto a la temperatura, al igual que el pH, existe un rango, algunas veces muy
pequeo, donde es mxima la actividad enzimtica, que est determinado por la
magnitud de las variaciones de la velocidad inicial en funcin de la temperatura del
medio, lo que significa que la velocidad inicial de reaccin aumentar con la
temperatura hasta que se haga prcticamente imposible de medir debido a una
activacin. La mayora de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los
70 C.
La temperatura ptima de reaccin enzimtica es el resultado de un balance entre el
incremento en la actividad y la velocidad de destruccin de la enzima. La temperatura
ptima no es un valor constante para una enzima dada, sino que depende del tiempo
durante el cual se hace la medicin de la actividad. Mientras ms corto sea el tiempo de
medicin, ms alta ser la temperatura ptima.
Las molculas deben poseer cierta energa de activacin para que puedan reaccionar y
las enzimas actan disminuyendo la energa de activacin, permitiendo que la reaccin
avance rpidamente. Se puede determinar fcilmente el efecto de la temperatura,

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exponiendo la enzima a diferentes temperaturas y se mide la cantidad de actividad
residual.
Para estudiar el efecto de estos factores sobre una reaccin enzimtica, se debe trabajar
en condiciones de operacin bien determinadas. Los otros paramentos o factores, deben
permanecer constante respecto al factor determinante. Para ello se trabajar como
sustrato almidn y se determinara las variaciones del almidn segn procedimiento de
identificacin y cuantificacin de sustrato residual, utilizando solucin iodada.

3. MATERIAL METODOS
3.1 Material Biolgico :
Amilasa

3.2 Materiales:
Pipetas
Tubos de ensayos
Bao mara
Cocina elctrica
Balanza

3.3 reactivos
Solucin buffer acetato.
Solucin buffer fosfato.
Solucin buffer carbonato.
Solucin de almidn al 1%.
Solucin de enzima al 1%.
Solucin NaCl 0.1M
HCl 0.05 M
Solucin Iodada
Sol. Cprico alcalino

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. OBTENCION DE ENZIMA AMILASA
En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30 mL
Mezclar a la misma proporcin con buffer fosfato
Con una gasa o algodn proceder a filtrar la mezcla
El filtrado corresponde a la enzima

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4.2. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA
AMILASA SALIVAL.
A. Sistema de Incubacin:
COMPONENTES Y PROCESO
SISTEMA (Tubos)
1 2 3
Soluc. Almidn 1% 1.0 1.0 1.0
Buffer pH 2.5 3.0 - -
Buffer pH 6.8 - 3.0 -
Buffer pH 9.0 - - 3.0
Soluc. de NaCl 0.1N 0.5 0.5 0.5
Mezclar y Pre-Incubar a 37 C por 5 minutos.
Soluc. Amilasa 0.5 % 0.5 0.5 0.5
Mezclar y Pre-Incubar a 37 C por 15 minutos.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada sistema, prepara y
seguir con el siguiente sistema.

B. Valoracin de la actividad enzimtica por el sustrato residual:

COMPONENTES Y PROCESO
SISTEMA (Tubos)
Blanco 1 2 3
Soluc. HCl 0.5N 4.0 4.0 4.0 4.0
Agua destilada 0.5 - - -
De los tubo 1-3 parte A - 0.5 0.5 0.5
Solucion Iodada 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de manera
cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o bien de manera
cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el fotocolormetro con filtro
verde, o bien en espectrofotmetro a 660 nm).

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4.3. EFECTO DE la TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION
DE LA AMILASA SALIVAL.
A. Sistema de Incubacin:
COMPONENTES Y PROCESO
SISTEMA (Tubos)
1 2 3
Soluc. NaCl 0.2N 0.5 0.5 0.5
Soluc. Amilasa salival. 0.5 0.5 0.5
Mezclar y colocar los tubo por 2 minutos en:
Bao de agua helada SI - -
Bao mara a 37 C - SI -
Bao mara 65 C - - SI
Soluc. Almidn 1%. 1.0 1.0 1.0
Incubar por 15 minutos a las mismas temperaturas.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada sistema, prepara y
seguir con el siguiente sistema.

B. Valoracin de la actividad enzimtica por el sustrato residual:

COMPONENTES Y PROCESO
SISTEMA (Tubos)
Blanco 1 Blanco 2 1 2 3
Soluc. HCl 0.5N 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Agua destilada 0.5 - - - -
Soluc. Almidn 1% - 0.5 - - -
De los tubo 1-3 parte A - - 0.5 0.5 0.5
Solucion Iodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de manera
cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o bien de manera

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cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el fotocolormetro con filtro
verde, o bien en espectrofotmetro a 660 nm).

5. RESULTADOS:


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6. DISCUSIONES:


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7. CONCLUSIONES





















8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS


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CUESTIONARIO:

1. Explique qu ocurre en cada uno de los sistemas de incubacin preparados,
tanto en efecto del pH como de la temperatura.
2. Grafique el efecto del pH y la temperatura sobre la velocidad de reaccin de
la amilasa salival y otras enzimas.
3. Investigue los pH y las temperaturas ptimas de otras enzimas importantes.
4. Defina que es estabilidad enzimtica y explique la pH estabilidad y
termoestabilidad de una enzima.
5. Defina el punto isoelctrico (pI) de una enzima (protena).
6. Describa un procedimiento para demostrar (pI) de una enzima. Ejemplo
amilasa salival.