1

PENETAPAN KADAR KININ DI URIN SETELAH MENGKONSUMSI

TABLET KININ DENGAN METODE FLUORESENSI, ALAT DENGAN
SPEKTROFOTODENSITOMETRI-MODE FLUORESENSI

I. TUJUAN
1.1 Menetapkan kadar kinin di urin setelah mengonsumsi tablet kinin dengan
metode fluoresensi (alat dengan spektrofotodensitometri-mode
fluoresensi).
1.2 Mengetahui tingkat validitas dari metode penetapan kadar kinin yang
dilakukan.

II. DASAR TEORI
2.1 Kinin
Kinin merupakan senyawa golongan alkaloid yang diperoleh dari kulit
kayu kina (Cinchona succirubra) yang berkhasiat sebagai antimalaria. Nama
IUPAC kinin ialah (8a,9R)-60-Methoxycinchonan-9-ol trihydrate dan nama
lainnya ialah Chinina, chininum dan quinine. Senyawa ini memiliki rumus
molekul C
20
H
24
N
2
O
2
dengan berat molekul 324,4 gram/mol. Pemerian kinin
berupa serbuk mikrokristal atau granul-granul berwarna putih dan sedikit
berfluoresensi. Kelarutan kinin dalam air sebesar 1:1900, dalam air panas 1:760,
dalam alkohol 1:0,8, dalam benzen 1:80, dalam kloroform 1: 1,2, dalam eter
kering 1:250, dalam gliserol 1:2. Kinin tidak larut dalam petroleum eter. Kinin
memiliki pKa 4,1;8,5 dalam suhu 20
o
C (Moffat et al, 2011).
Kinin merupakan salah satu senyawa obat yang berfluoresensi kuat yang
didasarkan dari strukturnya yang kaku dan kromofornya yang diperpanjang
(Gandjar dan Rohman, 2012). Berikut adalah struktur kimia dari kinin.



Gambar 2.1 Struktur Kimia Kinin (Moffat et al., 2011)
2

Pada 0,05 M H
2
SO
4
, kinin memiliki dua panjang gelombang eksitasi yaitu
ex = 250 dan 350 nm dan panjang gelombang intensitas emisi fluoresensi
maksimum, em atau fl, adalah 450 nm (Cheon et al., 2012). Identifikasi kinin
dengan kromatografi lapis tipis dapat menggunakan berbagai sistem fase gerak
dengan harga Rf yang dihasilkan, yakni sebagai berikut:
Tabel 2.1 Harga Rf Kinin dalam berbagai fase gerak (Moffat et al, 2005).
Sistem Fase gerak Perbandingan Rf
TA Methanol : larutan amonia kuat 100 : 1,5 51
TB Sikloheksana : toluen : dietilamin 75:15:10 2
TC Kloroform : methanol 90:10 11
TD Kloroform : aseton 80:20 -
TE
Etil asetat : methanol : larutan
amonia kuat
85:10:05 45

2.2 KLT-Spektrofotodensitometri
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi planar,
selain kromatografi kertas dan elektroforesis, dengan metode pemisahan
campuran analit dilakukan dengan mengelusi analit melalui suatu lempeng
kromatografi lalu melihat komponen/analit yang terpisah dengan penyemperotan
atau pengecatan. Fase gerak sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang
fase diam karena pengaruh kapiler. Sementara mekanisme sorpsi-desorpsi
(perpindahan analit dari fase diam ke fase gerak dan sebaliknya) yang utama pada
KLT adalah partisi dan adsorbsi.
Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk
selulosa. Sifat-sifat penjerap yang penting adalah ukuran partikel berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 m. Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari
pustaka, sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena
daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa
sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Fase gerak harus mempunyai
kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif dan
daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
3

antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. Nilai Rf dapat didefinisikan
sebagai berikut.
Rf =
aak ang ditempuh analit
aak ang ditempuh fase geak


(Gandjar dan Rohman, 2012)
Densitometri (Thin Layer Chromato Scanner) merupakan metode analisis
instrumental yang berdasarkan pada interaksi REM dengan analit yang merupakan
bercak pada KLT. Radiasi elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh
analit, ditransmisi atau diteruskan jika plat yang digunakan transparan. Radiasi
elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit atau indikator plat dapat diemisikan
berupa flouresensi dan fosforesensi. Pemadaman flouresensi indikator F-254 dapat
terjadi akibat adanya noda pada plat sehingga teramati di bawah lampu UV
sebagai noda hitam (Sherma dan Fried, 1994). Densitometri lebih dititikberatkan
untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar kecil, yang memerlukan
pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. Densitometer dapat bekerja secara
serapan atau fluoresensi. Densitometer mempunyai sumber cahaya,
monokromator untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk
memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan rekorder (Gandjar dan
Rohman, 2007).
2.3 Fluoresensi
Peristiwa fluoresensi adalah pemancaran kembali sinar oleh molekul obat
yang telah menyerap energi sinar dan terjadi dalam waktu yang singkat setelah
penyerapan (10
-8
detik). Intensitas fluoresensi (F) sebanding dengan banyaknya
sinar yang diserap oleh molekul analit sehingga absorptivitas suatu senyawa
berkaitan dengan intensitas fluoresensinya. Molekul-molekul seperti hidrokarbon
jenuh yang tidak menyerap sinar UV-Vis tidak akan berfluoresensi. Senyawa-
senyawa yang berfluoresensi pasti menyerap sinar UV karena peristiwa
fluoresensi didahului oleh penyerapan/absorpsi. Teknik analisis berdasarkan
deteksi fluoresensi memiliki keunggulan dibandingkan teknik lainnya yaitu
sensitifitas dan selektifitas yang tinggi (Gandjar dan Rohman, 2012; Valeur,
2001).
4

III. ALAT DAN BAHAN
3.1 Alat
a. Gelas beker
b. Neraca analitik
c. Pipet ukur 1 mL, 5 mL, 10 mL
d. Bulb filler
e. Tabung reaksi
f. Plat Silika Gel G
60
10 x 10 cm
g. Chamber
h. Pipet kapiler
i. Oven
j. Spektrofotodensitometri
k. Sentrifugator
l. Sendok tanduk
m. Kertas perkamen
n. Kertas saring
o. Batang pengaduk
p. Labu ukur 5 mL, 10 mL
q. Pipet tetes
r. Botol vial
s. Mortir dan stamper
t. Sudip
3.2 Bahan
a. Tablet Kina
b. Metanol (CH
3
OH)
c. Urin
d. Amonia pekat (NH
3
)
e. Kloroform (CHCl
3
)
f. Asam Sulfat (H
2
SO
4
) 0,1 N
g. Isopropanol
h. Aluminium foil
5

IV. PROSEDUR KERJA
4.1 Pembuatan Larutan
4.1.1 Larutan Stok Baku Kinin Sulfat (1 mg/mL)
Ditimbang secara seksama 10 mg serbuk kinin sulfat. Serbuk
dimasukkan dalam beker gelas lalu ditambahkan 5 mL metanol dan
diaduk hingga larut dengan batang pengaduk. Larutan dimasukkan
pada labu ukur 10 mL dan ditambahkan metanol hingga tanda
batas. Labu ukur digojog hingga larutan homogen.
4.1.2 Larutan Standar Kinin Sulfat (100 ng/L)
a. Perhitungan
Diketahui : Konsentrasi Larutan Stok Baku Kinin Sulfat
= 1mg/mL = 1000 g/ mL (C
1
)
Konsentrasi Larutan Standar Kinin Sulfat
= 100 ng/L = 100 g/mL (C
2
)
Volume Larutan Standar Kinin Sulfat
= 5 mL (V
2
)
Ditanya : Volume Larutan Stok Baku Kinin sulfat (V
1
)
= ......?
Jawab :
C
1
V
1
= C
2
V
2

1000 g/mL V
1
= 100g/mL 5 mL
V
1
=
g/mL 1000
mL 5 g/mL 100

V
1
= 0,5 mL
b. Cara Pembuatan
Dipipet larutan stok baku kinin sulfat (1 mg/mL) sebanyak 0,5 mL
dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL. Ditambahkan metanol
hingga tanda batas kemudian digojog hingga homogen.
4.1.3 Larutan Uji
Dibuat tiga seri larutan uji dengan konsentrasi 250 ng/mL, 500
ng/mL, dan 1000 ng/mL. Larutan uji dibuat dari tablet kina dengan
6

kandungan kinin sulfat 200 mg/tablet yang telah dilarutkan dengan
10 mL metanol sehingga memiliki konsentrasi 20 mg/mL
a. Perhitungan
1. Pengencaran Awal Larutan Tablet Kinin Sulfat
Diketahui: Konsentrasi larutan tablet kinin sulfat = 20
mg/mL = 20000g/mL (C
1
)
Volume larutan tablet kinin sulfat = 0,1
mL (V
1
)
Volume larutan pengenceran awal = 10
mL (V
2
)
Ditanya : Konsentrasi Larutan pengenceran awal (C
2
) = ......?
Jawab :
C
1
V
1
= C
2
V
2

20000g/mL 0,1 mL = C
2
10 mL
C
2
=
mL 0 1
mL 0,1 g/mL 20000

C
2
= 200 g/mL
C
2
= 200000 ng/mL
2. Pengenceran Akhir Larutan Tablet Kinin Sulfat
Diketahui: Konsentrasi larutan pengenceran awal = 200
g/mL = 200000 ng/mL (C
1
)
Konsentrasi larutan pengenceran akhir = 5000
ng/mL (C
2
)
Volume larutan pengenceran akhir = 10
mL (V
2
)
Ditanya : Volume larutan pengenceran awal (V
1
) = ......?
Jawab :
C
1
V
1
= 5000 ng/mL V
2

200000 ng/mL V
1
= 5000 ng/mL 10 mL
7

V
1
=
ng/mL 20000
mL 10 ng/mL 5000

V
1
= 0,25 mL
3. Larutan Uji
Diketahui: Konsentrasi akhir larutan tablet kinin sulfat =
5000 ng/mL (C
1
)
Konsentrasi larutan uji yang dibuat =
250ng/mL (C
2
), 500ng/mL (C
3
), dan 1000 ng/mL
(C
4
)
Volume larutan uji = 2 mL (V
2
, V
3
, V
4
)
Ditanya: Volume baku sekunder yang diambil = .....? (V
1
)
Jawab:
Konsentrasi larutan uji 250 ng/mL
C
1
V
1
= C
2
V
2

5000 ng/mL V
1
= 250ng/mL 2 mL
V
1
=
ng/mL 5000
mL 2 ng/mL 250

V
1
= 0,1 mL
Jadi untuk larutan uji dengan konsentrasi 250 ng/mL
diambil volume larutan tablet kinin sulfat sebanyak 0,1 mL
Konsentrasi larutan uji 500 ng/mL
C
1
V
1
= C
3
V
3

5000 ng/mL V
1
= 500ng/mL 2
mL
V
1
=
ng/mL 5000
mL 2 ng/mL 500

V
1
= 0,2 mL
Jadi untuk larutan uji dengan konsentrasi 500 ng/mL
diambil volume larutan tablet kinin sulfat sebanyak 0,2 mL
Konsentrasi larutan uji 1000 ng/mL
C
1
V
1
= C
4
V
4

8

5000 ng/mL V
1
= 1000ng/mL 2 mL
V
1
=
ng/mL 5000
mL 2 ng/mL 1000

V
1
= 0,4 mL
Jadi untuk larutan uji dengan konsentrasi 1000 ng/mL
diambil volume larutan tablet kinin sulfat sebanyak 0,4 mL
b. Cara Pembuatan
Tablet kina digerus hingga halus kemudian dilarutkan dengan 5
mL metanol dalam beker gelas. Diaduk dengan batang pengaduk
lalu disaring dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam labu
ukur 10 mL. Ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog
hingga homogen (Larutan 1). Diambil 0,1 mL larutan 1
dimasukkan dalam labu ukur 10 mL lalu ditambahkan metanol
hingga tanda batas dan digojog hingga homogen (Larutan 2).
Diambil 0,25 mL Larutan 2 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog hingga
homogen. Disiapkan 3 tabung reaksi lalu diberi label Tabung 2,
Tabung 3 dan Tabung 4. Masing- masing tabung memiliki
komposisi sebagai berikut.
Tabel 4.1. Komposisi masing-masing tabung larutan Uji
Tabung
Konsentrasi
(ng/mL)
Kandungan
Kinin
Sulfat (ng)
Volume
Larutan
Tablet
Kinin
Sulfat
(mL)
Volume Urin
yang
Ditambahkan
(mL)
2 250 500 0,1 1,9
3 500 1000 0,2 1,8
4 1000 2000 0,4 1,6

4.1.4 Larutan Blanko
Dipipet urin sebanyak 2 mL ke dalam tabung reaksi dan diberi
label Tabung 1.
9

4.1.5 Larutan Sampel
Larutan sampel dibuat dari campuran larutan tablet kinin sulfat
yang konsentrasiya belum diketahui dengan urin dan diberi label
Tabung 5.
4.2 Ekstraksi Cair-cair
Tabung 1 - 5 ditambakan amonia secukupnya kurang lebih 0,1 mL
hingga mencapai pH 9-10, pH ditentukan dengan indikator pH.
Ditambahkan campuran pelarut kloroform dan isopropanol (3:1)
sebanyak 4 mL. Tabung 1 - 5 dikocok dengan tangan selama 1 menit.
Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Fase
kloroform diambil dari masing masing tabung, dan diuapkan pada suhu
tidak lebih dari 80C. Residu dilarutkan dalam metanol secukupnya
(Cheon et al., 2012).
4.3 KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan Spektrofotodensitometri
Plat siliki gel G
60
10 cm 10 cm dicuci dengan metanol, kemudian
diaktivasi pada oven dengan suhu 120 C selama 30 menit. Chamber
dijenuhkan dengan fase gerak yaitu sistem TA (metanol : Larutan amonia
pekat; 100:1,5). Disiapkan 1 cm tepi atas dan tepi bawah pada plat silika
gel. Larutan blanko, larutan standar, larutan uji, dan larutan sampel
ditotolkan pada plat silika G
60
. Sehinggga diperoleh sembilan totolan
sebagai berikut:
Tabel 4.2 Totolan pada plat KLT
Totolan Larutan
Jumlah totolan
(L)
Jumlah Kinin Sulfat
(ng)
1
Larutan Blanko
(Tabung 1)
25 -
2
Larutan Uji 1
(Tabung 2)
25 250
3
Larutan Uji 2
(Tabung 3)
25 500
4
Larutan Uji 3
(tabung 4)
25 1000
5 Larutan Sampel 25 tidak diketahui
10

6
Larutan
Standar 1
5 500
7
Larutan
Standar 2
10 1000
8
Larutan
Standar 3
15 1500
9
Larutan
Standar 4
20 2000

Plat dielusi dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak. Plat
diangkat dan diangin-anginkan hingga kering, lalu diamati menggunakan
spektrofotodensitometer. Bercak diamati dengan
spektrofotodensitometer. Masing-masing noda diukur luasnya dengan
spektrofotodensitometer pada panjang gelombang absorpsi maksimum
terjadi eksitasi (250 nm). Plat KLT selanjutnya disemprot dengan larutan
asam sulfat 0,1 N. Dilakukan pengukuran spektrum emisi pada panjang
gelombang 450 nm. Kemudian dilakukan analisa terhadap data dari hasil
scan yang didapat.

V. SKEMA KERJA
5.1 Pembuatan Larutan
5.1.1 Larutan Stok Baku Kinin Sulfat (1 mg/mL)











Ditimbang seksama 10 mg serbuk kinin sulfat dan
dimasukkan ke beker gelas

Ditambahkan 5 mL metanol dan diaduk hingga larut dengan
batang pengaduk

Dimasukkan larutan ke dalam labu ukur 10 mL dan
ditambahkan metanol hingga tanda batas
Larutan digojog hingga homogen dan dipindahkan ke botol
vial
11

5.1.2 Larutan Standar Kinin Sulfat (100 ng/L)











5.1.3 Larutan Uji


















Dipipet larutan stok baku kinin sulfat (1 mg/mL) sebanyak 0,5
mL

Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan
metanol hingga tanda batas
Larutan digojog hingga homogen dan dipindahkan ke botol
vial
Tablet kina digerus hingga halus dan dilarutkan dengan 5 mL
metanol

Larutan diaduk dengan batang pengaduk dan disaring dengan
kertas saring
Dimasukan ke labu ukur 10 mL dan ditambahkan metanol
hingga tanda batas (Larutan 1)
Diambil 0,1 mL larutan 1 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog
hingga homogen (Larutan 2)
Diambil 0,25 mL larutan 2 dimasukkan dalam labu ukur 10
mL lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog
hingga homogen
12










5.1.4 Larutan Blanko





5.1.5 Larutan Sampel






5.2 Ekstraksi Cair-cair








Tabung 3
0,2 mL Larutan
Tablet Kinin
Sulfat + 1,8 mL
urin
Tabung 2
0,1 mL Larutan
Tablet Kinin
Sulfat + 1,9 mL
urin
Tabung 4
0,4 mL Larutan
Tablet Kinin
Sulfat + 1,6 mL
urin
Dipipet urin sebanyak 2 mL ke dalam tabung reaksi
Diberi label Tabung 1
Dibuat campuran larutan tablet kinin sulfat yang
konsentrasinya belum diketahui
Diberi label Tabung 5
Tabung 1 5 ditambahkan ammonia 0,1 mL + 4 mL kloroform :
isopropanol (3 : 1)
dikocok dengan tangan selama 1 menit
Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit
13









5.3 KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan Spektrofotodensitometri


















Fase kloroform dari masing-masing tabung diambil
Diuapkan pada suhu yang diatur agar tidak lebih dari 80
o
C

Residu dilarutkan dengan metanol secukupnya

Disiapkan plat silika gel G
60
dengan ukuran 10 cm 10 cm
Tepi atas dan bawahnya ditandai dengan jarak 1 cm

Plat diaktivasi dalam oven 120 C selama 30 menit
Semua larutan ditotolkan pada plat sesuai dengan Tabel 4.2
Plat dielusi dalam chamber yang sudah jenuh dengan fase gerak
metanol : amonia kuat (100 : 1,5)
Plat diangkat dan diangin-anginkan hingga kering
Bercak diamati dengan spektrofotodensitometer. Masing-masing
noda diuku luas aeana pada max eksitasi 250 nm
14



Plat disemprot dengan H
2
SO
4
0,1 N
Dilakukan pengukuran spektrum emisi pada panjang gelombang
450 nm
Dilakukan analisa terhadap data dari hasil scan yang didapat