En ingeniera gentica, la ingeniera metablica se puede definir como la tecnologa que se ocupa
de la manipulacin delADN que d como resultado la variacin de rutas metablicas, ya sea
aadiendo nuevos intermediarios a las rutas preexistentes, modificar la regulacin de las mismas o crear nuevas rutas. Un ejemplo de ingeniera metablica es la Ingeniera metablica de los flavonoides, que consiste en la manipulacin del ADN en ciertas plantas con el objetivo de aumentar o disminuir su concentracin de flavonoides a travs de la manipulacin de sus vas metablicas. De esta forma se ha logrado cambiar el color de las flores a colores azules o amarillos que no existen en estado silvestre, y tambin aumentar la concentracin de flavonoides de inters farmacutico en los alimentos, entre otras cosas. Otro ejemplo es la produccin de artemisina, una droga antimalrica, en levaduras. A partir de la ruta del mevalonato, se modifica la regulacin de la ruta y se aaden nuevos enzimas, de forma que a partir del mevalonato se forma el cido artemisnico. 1
2 aleloqumicos Sustancias qumicas lanzadas por un organismo ejerciendo efectos conductuales o fisiolgicos en otro organismo, generalmente negativamente. En el caso de los microorganismos, los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibiticos. Es en la idiofase normalmente, cuando se producen (fase en la que el microorganismo no crece, pero sigue metablicamente activo). Los metabolitos primarios son compuestos biolgicos necesarios para el crecimiento, desarrollo y reproduccin de los organismos vivos. Ellos incluyen hidratos de carbono, protenas, lpidos y cidos nucleicos. Aunque las discusiones de metabolitos primarios suelen centrarse en la biologa de las plantas, todos los organismos vivos contienen estos compuestos. En bioqumica, una ruta metablica o va metablica es una sucesin de reacciones qumicas que conducen de un sustrato inicial a uno o varios productos finales, a travs de una serie de metabolitos intermediarios. Rutas catablicas Rutas anablicas Rutas anfiblicas Flavonoidees el trmino genrico con que se identifica a una serie de metabolitos secundarios de las plantas.Los flavonoides o bioflavonoides son pigmentos vegetales no nitrogenados. Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscpicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposicin mediante fermentacin de diversos cuerpos orgnicos, principalmente los azcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. La Ingeniera metablicaestudia todas las reacciones involucradas en elmetabolismo de las plantas y sus enzimas reguladoras. Las plantas utilizan un lenguaje qumico para interrelacionarse con otros seres vivos con los que coincide espacial y temporalmente. Los compuestos que median dichas interacciones se denominan aleloqumicos y pertenecen al grupo de los denominados metabolitos secundarios, productos naturales sintetizados por las plantas que no son considerados "esenciales" para los procesos bsicos de vida (en contraste con el metabolismo primario). Los avances recientes en el campo de la biotecnologa vegetal y el uso de herramientas como la protemica, permiten establecer estrategias eficientes para la obtencin de metabolitos de inters comercial. Contenido [ocultar] 1 Definicin de algunos trminos 2 Ingeniera Metablica 3 Estrategias para incrementar la produccin de metabolitos secundarios 4 Cultivo a gran escala 5 Bibliografa Definicin de algunos trminos Metabolismo: Es el conjunto regulado y coordinado de reacciones qumicas que tienen lugar en un organismo vivo, cada una catalizada por una enzima especfica. Una va metablica es el conjunto de reacciones que lleva a la sntesis o degradacin de una biomolecula dada, en tanto que un metabolito es un intermediario en una va metablica. El metabolismo es la suma del anabolismo (conjunto de las vas de sntesis, que requieren energa) y del catabolismo (conjunto de las vas de degradacin, que permiten obtener la energa necesaria para poder llevar a cabo las vas de sntesis). Metaboloma: El conjunto de vas metablicas que ocurren en una clula, tejido u organismo, incluyendo su interrelacin y regulacin. Metabolmica: Rama de la biologa que se dedica al estudio del metaboloma incluyendo los mtodos y tcnicas especficas que se usan con este objetivo. Proteoma: El conjunto de protenas que se estn expresando en un momento dado, en una clula, tejido u organismo. El proteoma puede considerarse como dinmico si se compara con el genoma pues vara con el tiempo y/o con diferentes estados fisiolgicos o patolgicos especficos. Protemica: Rama de la biologa que se dedica al estudio del proteoma incluyendo los mtodos y tcnicas especficas que se usan con este objetivo. En la practica la utilizacin de la energa metablica para acrecentar la produccin de metabolitos secundarios en las plantas es un tecnologa de avanzada muy til para el incremento de los rendimientos de metabolitos secundarios por unidad de masa de droga seca a industrializar. Ingeniera Metablica La ingeniera gentica de plantas y clulas de plantas es factible en los das de hoy, mtodos tales como la transformacin del agrobacterium y el xito silencioso de la pistola de partculas para la introduccin de nuevos genes en plantas. Pudiera esperarse que fuera posible modificar tambin el metabolismo secundario de las plantas, se pueden considerar numerosas posibilidades para lograr esto. 1. Incrementando el flujo a travs de las rutas, por incremento de la actividad de las enzimas que catalizan los pasos lmites. Esto pudiera lograrse utilizando la codificacin gentica para que la enzima particular de la misma planta o elgen de otra planta u organismo codifique una enzima con funciones similares. Aun la construccin de nuevas y ms eficientes enzimas (Ingeniera proteica) puede ser considerada, Ej. Enzimas que no sean sensibles a la inhibicin de la retroalimentacin. 2. Expresin constitutiva de la regulacin de los genes (o parte de) una ruta de metabolitos secundarios. 3. Bloqueo competitivo de rutas metablicas Ej. Competencia por un mismo inters por el C5 de los bloques de la construccin (isoprenoides) en caso de los terpenoides de los alcaloides indolicos y antraquinonas. 4. Bloqueo del catabolismo de un producto deseado. El primero de los enfoques requiere genes sensibles, los cuales tengan una protena activa, unido a la maquinaria biosinttica de trabajo en una similar manera como a la planta no transformada o clula de planta, pero con un flujo ms grande de carbono hacia el producto deseado. Los dos siguientes enfoques requieren de la eliminacin del antisentido de los genes que bloqueen determinados pasos en una ruta. Ambos el sentido y el antisentido son la va de entrada de genes en el cambio de color de las flores. La mayor restriccin para la ingeniera metablica de produccin de metabolitos secundarios de plantas es la falta de conocimiento sobre el metabolismo secundario y como se regula este. La mayora de las rutas de los metabolitos secundarios han sido poco estudiadas, casi nicamente se han hecho las rutas propuestas para la introduccin de varios intermediarios. El conocimiento sobre el nivel de enzimas es en la mayora de los casos falta y consecuentemente la codificacin de los genes paso fundamental para el metabolismo secundario o genes reguladores, parte de las rutas no conocidas, adems para ser capaces de aplicar la ingeniera metablica con xito se deben estudiar en detalle el nivel necesario de productos y enzimas involucradas. Para el sistema modelo de los alcaloides por ejemplo la primera parte del proceso es la misma, todos ellos llegan hasta la estrictosidina como intermediario ms importante desde el cual parte una variedad de 3000 ndoles y alcaloides relacionados como derivados. Estrategias para incrementar la produccin de metabolitos secundarios Las plantas producen una amplia variedad de metabolitos secundarios. Estos compuestos los cuales varan para cada tipo de plantas con el medio ambiente, Ej. Las sustancias que atraen los polinizadores, los anticomestibles ante los depredadores o compuestos activos como antimicrobianos (fitoalexinas) contra los patgenos.Los metabolitos secundarios juegan un importante papel en las plantas ornamentales y alimentaras Ej. Olor, gusto, sabor y color. Los metabolitos secundarios de las plantas son un rasgo importante en conexin con la cra de las plantas. Muchos metabolitos secundarios de las plantas son usados como sustancias qumicas finas Ej. Como medicamentos, colorantes, insecticidas, fragancias y sabores. Un gran nmero de estos productos son derivados de plantas raras, lo cual entre otras razones lleva a investigar mtodos de produccin biotecnolgicos para tales especialidades qumicas. El taxol es un ejemplo. El cultivo de clulas de plantas provee de una suerte de alternativa de acercamiento a la produccin de metabolitos secundarios de plantas. Aos atrs todas las plantas tiles econmicamente han sido sometidas a cultivo de tejidos, sin embargo, en la mayora de los casos las productividades encontradas son bajas para hacer el proceso factible econmicamente. Las investigaciones ahora se centran en la posibilidad de incrementar la produccin de los metabolitos secundarios en clulas de plantas. Discutiremos algunos aspectos de la, biotecnologa de las clulas de plantas: Factibilidad tecnolgica y econmica. Aproximacin a los mtodos usados para incrementar la produccin. Prospeccin de procesos de ingeniera metablica para el incremento de los rendimientos. El sol y la regulacin de los metabolitos secundarios. Lo anterior se puede ilustrar con investigaciones realizadas sobre el Cataranthusroseus, (vicaria) y sobre la Quina roja (Cinchona). El Cataranthusroseus es una fuente de ajmalina, usado como un medicamento que incrementa la circulacin cerebral y los alcloidesdimericosvinblastina y vincristina, dos importantesmedicamentos antitumorales. Desde la corteza de la quina se extraen los alcaloides derivados de la quinolina (quinina), usado como medicamento antimalarico y agente amargo en bebidas y quinidina un medicamento antiarritmico. Ambas son derivados de la misma ruta biosinttica como se menciona previamente, mencionando los alcaloides terpenoidesindolicos, en los que la estrictosidina es un importante intermediario. Cultivo a gran escala Los microorganismos estn usualmente conectados con la produccin biotecnolgica. Por supuesto esto suscita la pregunta en todo caso de cmo es posible producir metabolitos secundarios de plantas con microorganismos transgnicos. En teora la respuesta es si, sin embargo en la prctica esto no es posible. Es posible expresar genes de plantas en microorganismos, pero en caso de las complejas rutas biosintticas de los metabolitos secundarios de plantas se necesita expresar un gran nmero de genes en el microorganismo, genes los cuales en la mayora de los casos no se conocen. Por otra parte, en las plantas las rutas secundarias son reguladas entre otras a travs de la compartimentacin. Ej. La 1era etapa en los plastidios, la siguiente etapa en le citosol y la etapa final en la vacuola. En algunos casos se involucran cedulas diferentes. Todas estas situaciones no pueden ser realizadas por un microorganismo. nicamente en casos de bioconversin que involucran uno o dos pasos pueden ser los microorganismos transgnicos una alternativa, por lo tanto los esfuerzos principales se han centrado en los cultivos de clulas de plantas como posible sistema de produccin.
Ingenieriametabolica En ingeniera gentica, la ingeniera metablica se puede definir como la tecnologa que se ocupa de la manipulacin del ADN que d como resultado la variacin de rutas metablicas, ya sea aadiendo nuevos intermediarios a las rutas preexistentes, modificar la regulacin de las mismas o crear nuevas rutas. Un ejemplo de ingeniera metablica es la Ingeniera metablica de los flavonoides, que consiste en la manipulacin del ADN en ciertas plantas con el objetivo de aumentar o disminuir su concentracin de flavonoides a travs de la manipulacin de sus vas metablicas. De esta forma se ha logrado cambiar el color de las flores a colores azules o amarillos que no existen en estado silvestre, y tambin aumentar la concentracin de flavonoides de inters farmacutico en los alimentos, entre otras cosas. Otro ejemplo es la produccin de artemisina, una droga antimalrica, en levaduras. A partir de la ruta del mevalonato, se modifica la regulacin de la ruta y se aaden nuevos enzimas, de forma que a partir del mevalonato se forma el cido artemisnico.
Esto es un extracto del artculo Ingenieriametabolica de la enciclopedia libre Wikipedia. En Wikipedia hay disponible una lista de los autores. Ingeniera metablica es la prctica de la optimizacin de los procesos genticos y regulador dentro de las clulas para aumentar la produccin de una determinada sustancia de las clulas. Estos procesos son redes qumicas que utilizan una serie de reacciones bioqumicas y enzimas que permiten a las clulas para convertir las materias primas en las molculas necesarias para la supervivencia de las clulas. Ingeniera Metablica busca especficamente para modelar matemticamente estas redes, calcular un rendimiento de productos tiles, y el pin punto partes de la red que limitan la produccin de estos productos. Tcnicas de ingeniera gentica se pueden utilizar para modificar la red con el fin de aliviar estas limitaciones. Una vez ms esta red modificada puede ser modelado para calcular el rendimiento del nuevo producto. El objetivo final de la ingeniera metablica es ser capaz de utilizar estos organismos para producir sustancias valiosas a escala industrial de una manera rentable. Ejemplos actuales incluyen la produccin de cerveza, vino, queso, productos farmacuticos y otros productos de la biotecnologa. Dado que las clulas usan estas redes metablicas para su supervivencia, los cambios pueden tener efectos drsticos sobre la capacidad de las clulas para sobrevivir. Por lo tanto, las compensaciones en la ingeniera metablica surgen entre la capacidad de las clulas para producir la sustancia deseada y sus necesidades de supervivencia naturales. Por lo tanto, en lugar de eliminar directamente y/o sobreexpresin de los genes que codifican para las enzimas metablicas, el enfoque actual es apuntar a las redes de regulacin en una clula para disear de manera eficiente el metabolismo. Historia y aplicaciones de la ingeniera metablica En el pasado, para aumentar la productividad de un metabolito deseado, un microorganismo que se ha modificado genticamente por mutacin inducida qumicamente, y la cepa mutante que sobreexpresa el metabolito deseado se elige entonces. Sin embargo, uno de los principales problema con esta tcnica es que la va metablica para la produccin de metabolito que no se analiz, y como resultado, las restricciones a la produccin y la va de las enzimas relevantes a ser modificados eran desconocidos. En 1990, una nueva tcnica denominada ingeniera metablica surgi. Esta tcnica analiza la va metablica de un microorganismo, y determina las limitaciones y sus efectos sobre la produccin de los compuestos deseados. A continuacin, utiliza la ingeniera gentica para superar esas limitaciones. Algunos ejemplos de ingeniera metablica xito son los siguientes: Identificacin de restricciones a la produccin de lisina en Corynebacteriumglutamicum y la insercin de nuevos genes para aliviar estas limitaciones para mejorar la ingeniera de produccin de una nueva ruta de biosntesis de cido graso, llamada va de la beta oxidacin invertido, que es ms eficiente de la va nativa en la produccin de cidos grasos y alcoholes que pueden potencialmente ser convertidos catalticamente a los productos qumicos y combustibles mejora de la produccin de DAHP, un metabolito aromtico producido por E. coli que es un intermedio en la produccin de aminocidos aromticos. Se determin a travs de anlisis de flujo metablico que el rendimiento mximo terico de DAHP por molcula de glucosa utilizada, era 3/7 - Esto se debe a que una parte del carbono de la glucosa se pierde en forma de dixido de carbono, en lugar de ser utilizado para producir DAHP. Tambin, uno de los metabolitos que se utilizan para producir DAHP, se converta en piruvato para el transporte de glucosa en la clula, y por lo tanto, ya no estaba disponible para producir DAHP. Con el fin de aliviar la escasez de PEP y aumentar el rendimiento, Patnaik et al. ingeniera gentica utilizada en E. coli para presentar una reaccin que convierte PYR volver a PEP. Por lo tanto, la PPE utilizada para el transporte de glucosa en la clula se regenera, y se puede utilizar para hacer DAHP. Esto dio lugar a un nuevo mximo rendimiento terico de 6/7 - doble de la del sistema de E. coli nativa. En la escala industrial, la ingeniera metablica es cada vez ms conveniente y rentable. De acuerdo con la Organizacin de la Industria Biotecnolgica ", ms de 50 instalaciones de biorrefinera se construyen a travs de Amrica del Norte para aplicar la ingeniera metablica para la produccin de biocombustibles y productos qumicos a partir de biomasa renovable que puede ayudar a reducir las emisiones de gases de efecto invernadero". Biocombustibles potenciales incluyen alcoholes de cadena corta y alcanos, steres metlicos de cidos grasos y alcoholes grasos y cidos grasos-y biocombustibles basados isoprenoides. Anlisis de flujo metablico Un anlisis de flujo metablico se puede encontrar en el anlisis de flujo de equilibrio La creacin de una va metablica para el anlisis El primer paso en el proceso es para identificar un objetivo deseado para lograr a travs de la mejora o modificacin del metabolismo de un organismo. Los libros de referencia y bases de datos en lnea se utilizan para reacciones de investigacin y las vas metablicas que son capaces de producir este producto o resultado. Estas bases de datos contienen abundante informacin genmica y qumica, incluyendo vas para el metabolismo y otros procesos celulares. Usando esta investigacin, se elige un organismo que se utiliza para crear el producto o resultado deseado. Consideraciones que se tienen en cuenta a la hora de tomar esta decisin son la proximidad va metablica del organismo es la va deseada, los costos de mantenimiento asociados con el organismo, y lo fcil que es modificar la ruta del organismo. Escherichiacoli se utiliza ampliamente en la ingeniera metablica para sintetizar una amplia variedad de productos tales como los aminocidos, ya que es relativamente fcil de mantener y modificar. Si el organismo no contiene la ruta completa para el producto o resultado deseado, a continuacin, los genes que producen las enzimas que faltan deben ser incorporados en el organismo. Anlisis de una va metablica La va metablica completado se modela matemticamente para encontrar el rendimiento terico del producto o de los flujos de reaccin en la clula. Un flujo es la velocidad a la que se produce una reaccin dada en la red. Anlisis simple va metablica se puede hacer a mano, pero la mayora requieren el uso de software para realizar los clculos. Estos programas utilizan algoritmos complejos de lgebra lineal para resolver estos modelos. Para resolver una red usando la ecuacin para sistemas determinados se muestra a continuacin, se debe introducir la informacin necesaria acerca de las reacciones pertinentes y sus flujos. Informacin sobre la reaccin estn contenidos en las matrices Gx y Gm. Las matrices Vm y Vx contienen los flujos de las reacciones pertinentes. Cuando resuelto, la ecuacin se obtienen los valores de todos los flujos desconocidos. La determinacin de las manipulaciones genticas ptimas Despus de resolver para los flujos de reacciones en la red, es necesario determinar qu reacciones pueden ser alterados con el fin de maximizar el rendimiento del producto deseado. Para determinar qu manipulaciones genticas especficas para llevar a cabo, es necesario el uso de algoritmos de clculo, tales como OptGeneoOptFlux. Ellos proporcionan recomendaciones para los que los genes deben ser sobreexpresados, eliminados, o se introducen en una clula para permitir aumento de la produccin del producto deseado. Por ejemplo, si una reaccin dada tiene particularmente bajo flujo y est limitando la cantidad de producto, el software puede recomendar que el enzima que cataliza esta reaccin debe ser sobreexpresado en la clula para aumentar el flujo de reaccin. Las manipulaciones genticas necesarias se pueden realizar utilizando tcnicas estndar de biologa molecular. Los genes pueden ser sobreexpresados o eliminados de un organsism, en funcin de su efecto sobre la va y el objetivo final. Las medidas experimentales Con el fin de crear un modelo de solucin, a menudo es necesario tener ciertos flujos ya conocidos o medidos experimentalmente. Adems, con el fin de verificar el efecto de las manipulaciones genticas en la red metablica, es necesario medir experimentalmente los flujos en la red. Para medir flujos de reaccin, las mediciones de flujo de carbono se hacen usando carbono-13 etiquetado isotpico. El organismo se alimenta una mezcla que contiene molculas donde carbonos especficos estn diseados para ser carbono-13 tomos, en lugar de carbono-12 - Despus de estas molculas se utilizan en la red, tambin se convierten en metabolitos aguas abajo marcado con carbono-13, ya que incorporan los tomos en sus estructuras. El patrn de marcacin especfica de los diferentes metabolitos se determina por los flujos de reaccin en la red. Patrones de marcaje se pueden medir utilizando tcnicas tales como cromatografa de gas-espectrometra de masa junto con los algoritmos de clculo para determinar los flujos de reaccin.
Enrique Iez Pareja Instituto de Biotecnologa Universidad de Granada NDICE: 1. Introduccin 2. Ejemplos de ingeniera metablica tradicional 2.1 Reduccin de acetato en E. coli para lograr gran produccin de protenas recombinantes 2.2 Ingeniera metablica en bacterias del cido lctico 2.2.1 Inactivacin de la LDH 2.2.2 Oxidacin de NADH 2.2.3 Produccin de diacetilo 2.2.4 Produccin de alanina 3. Ingeniera metablica genmica y sus aplicaciones 3.1 Genmica 3.2 Anlisis de flujo metablico 3.3 Ejemplos de aplicaciones de anlisis de balance de flujo 3.3.1 Deleciones gnicas 3.3.2 Penicilliumchrysogenum 4. Herramientas genticas 4.1 Vectores 4.2 Promotores
1.Introduccin Definicin de ingeniera metablica:
Manipulacin de los procesos metablicos mediante tecnologa recombinante con el objetivo de mejorar las propiedades de los microorganismos.
Mejora dirigida de las propiedades celulares mediante I.G. para modificar o introducir nuevas reacciones bioqumicas especficas.
Alteracin racional y dirigida de las rutas metablicas de un organismo para mejor comprender y utilizar las rutas celulares en transformaciones (conversiones), transduccin de energa y ensamblaje supramolecular. Es un campo interdisciplinario que usa principios y tcnicas de varios mbitos: ciencias computacionales, gentica, bioqumica, ciencia de los sistemas, biologa celular y molecular, ingeniera bioqumica. El inters estriba en redirigir los flujos metablicos para objetivos industriales y mdicos.
Incrementar productividad del proceso (ej., produccin de antibiticos)
Incrementar la produccin de precursores biosintticos o polmeros
Ampliar capacidades metablicas aadiendo actividades extrnsecas. Hasta hace poco, esto se haca de modo emprico, por ensayo y error (rondas sucesivas de mutagnesis y rastreo o seleccin de mutantes). 2.Ejemplos de ingeniera metablica tradicional 2.1Reduccin de acetato en E. coli para lograr gran produccin de protenas recombinantes El problema tcnico de la acumulacin de acetato en cultivos densos de E. coli en los biorreactores, que tiene efectos negativos sobre la produccin de protenas recombinantes.
Una aproximacin obvia es la destruccin o eliminacin de la porcin de la ruta que conduce desde el nodo de acetil-CoA a la formacin de acetato.
Otro enfoque es un mejor control de la captacin de fuente de C para reducir la acumulacin de piruvato o acetil-CoA
Creacin de una nueva ruta que encaje en las rutas glucolticas preexistentes introduciendo genes que codifiquen enzimas apropiadas. Dos enfoques usados para modular la captacin de glucosa:
Metil--glucsido (MG), un anlogo de la glucosa que entra por el mismo sistema PTS, no txico, metablicamente inerte, inhibidor competitivo de la E-II glc . La adicin de MG redujo la acumulacin de acetato en el fermentador.
Basndose en estos estudios, se construy una raza manipulada que tena baja formacin de acetato a travs de la modificacin de la tasa de captacin de glucosa. La cepa tena una mutacin en el gen ptsG, que codifica la PEP:PTS. La produccin de protena recombinante aument 50% Redireccin del flujo de C hacia subproductos menos inhibitorios: expresin heterloga del gen de la acetolactatosintasa (ALS) de B. subtilis, cuyo producto convierte piruvato en acetona. Se escogi el punto de ramificacin del piruvato debido a su posicin central de punto de redireccin de flujo. La expresin heterloga de ALS modific drsticamente los flujos glucolticos: el nivel de acetato excretado se redujo drsticamente, siempre por debajo de su nivel txico, mientras que la acetona es 50 veces menos txica. No se afectaron la tasa de crecimiento especfica ni los rendimientos celulares. Eliminacin de enzimas crticas implicadas directamente en la formacin de acetato, especficamente la ruta acetato quinasa-fosfotransacetilasa (ack-pta). La destruccin de esta ruta origin bajos niveles de acetato a expensas de la aptitud celular, debido a que la ruta de la LDH a partir del piruvato se hace mucho ms competitiva. 2.2Ingeniera metablica en bacterias del cido lctico Las BAL homofermentativas tienen un metabolismos relativamente sencillo enfocado a la rpida conversin de azcar en lctico, y carente de muchas capacidades biosintticas. Poseen un elaborado sistema proteoltico centrado en la rotura completa de protenas en aminocidos, que son captados u usados en biosntesis. No hay casi solapamiento entre el catabolismo del C y el metabolismo biosinttico del N, lo que las hace objetivos ideales de la ingeniera metablica: cada metabolismo puede ser modificado sustancialmente sin influir en el otro en la medida en que no se altere la generacin de energa ni la biosntesis de material celular. El metabolismoshomofermentativo se caracteriza por altas tasas metablicas, logradas principalmente por la muy alta actividad de LDH, que regenera NAD. Ha sido muy fcil redirigir los flujos metablicos hacia la produccin de otros metabolitos. 2.2.1Inactivacin de la LDH Se sabe que ciertas condiciones se reduce la formacin de lctico y aumenta la de ciertas sustancias, algunas de las cuales (actico, frmico, acetona, acetaldehido, diacetilo) contribuyen a las cualidades organolpeticas de las leches fermentadas:
Poco metabolismo de azcar, con sustratos como galactosa o limitacin de azcar
Alta aireacin Estas condiciones provocan una baja actividad LDH o bajos niveles de NADH.
En Lactococcuslactis el gen ldh se inactiv por integracin de plsmido. La cepa mutante tena una fermentacin mixta en anaerobiosis, produciendo actico, frmico, acetona y etanol, y una fermentacin casi homoacetonica en aerobiosis.
Algo parecido en Lactobacillusplantarum, aunque fue ms complicado porque esta bacteria posee dos LDH (para D- y L-lctico) En ambas bacterias la produccin de etanol se mejor ms clonando los genes de Zymomonasmobilis, una bacteria muy eficiente en formacin de etanol: la clonacin de los genes pdc-adh (piruvatodescarboxilasa y alcohol deshidrogenasa) en los mutantes ldh con LDH inactivada origin un 2% de etanol. 2.2.2Oxidacin de NADH Superexpresin de NADH-oxidasa (NOX). Se clon el gen nox de Streptococcusmutans bajo el control del promotor de nisA inducible por nisina en L. lactis, y la adicin de cantidades subhinibitorias de nisina. 2.2.3Produccin de diacetilo El aroma a mantequilla se debe al diacetilo, aunque se produce en pequeas cantidades de modo natural. Hay un intermediario inestable, el -acetolactato, que normalmente se convierte en acetona (acetotolactatodescarboxilasa, producto del gen ALDB). Se realiz un doble cambio: superexpresin del gen NOX (para bajar nivles de LSD) y disrupcin integrativa del gene ALDB. La cepa resultante converta ms del 50% del azcar en diacetilo. Esto es un buen ejemplo de cmo convertir BAL en factoras de compuestos para alimentacin. 2.2.4Produccin de alanina Superexpresin de alanina deshidrogenasa de Bacillussphaericus en L. lactis origin la produccin de alanina dependiente de amonio a partir de azcar. Cuando la clonacin se hizo en un mutante ldh el resultado fue espectacular: ms del 99,5% del azcar se convirti en alanina. Si adems se deleciona el gen de la alaninaracemasa, se puede lograr convertir a esta bacteria en fbrica de L- alanina, que se usa como potenciador del sabor. 3.Ingeniera metablica genmica y sus aplicaciones Con la llegada de la I.G., se abre la perspectiva de hacerlo racionalmente y a voluntad, realizando cambios especficos en el genotipo que rindan fenotipos superiores previstos de antemano. Sin embargo, como dice Stephanopoulos, exista una gran disparidad entre el poder de las herramientas genticas actuales y la capacidad para analizar racionalmente las redes bioqumicas. Desde comienzos de los aos 90 toma cuerpo el nuevo enfoque de rediseo metablico racional, estimulado por las aplicaciones comerciales potenciales y por el atractivo de sustituir procedimientos qumicos por otros equivalentes biolgicos. El acercamiento ingenieril al anlisis y diseo depende de tener un modelo matemtico o computacional (simulador dinmico) del metabolismo, en la esperanza de que tal modelo se pueda usar luego en el diseo sistemtico, por I.G., para lograr los cambios deseados. Tras los comienzos en los aos 60, se llega en los 90 a la teora de los sistemas bioqumicos (BST) y al anlisis del control metablico (MCA). Ambos mtodos proporcionan clculos sobre cmo los cambios en la concentracin o en la actividad enzimtica pueden llevar a cambios en los flujos metablicos y en las concentraciones de metabolitos. Se ha visto que cambios sutiles en actividad de enzimas pueden lograr grandes cambios en los flujos. Igualmente se ha visto que las limitaciones de los flujos no suelen deberse a una sola enzima, lo que sugiere que las modificaciones genticas deben ser amplias, incluso afectando a todos los genes de una ruta. El deseo de tener modelos detallados dinmicos (cinticos) del metabolismo elucidando el comportamiento sistmico de las redes metablicas comienza a ser factible en la era postgenmica. Ahora tenemos la perspectiva de elaborar catlogos de partes de los componentes del metabolismo en razas concretas. A partir de esa informacin es posible reconstruir redes metablicas a escala celular y recabar informacin sobre la estructura y estequiometra de la red y de sus reacciones. Se pueden pues construir modelos metablicos a escala genmica. La fisiologa de las redes complejas como el metabolismo es una funcin de mltiples componentes que interaccionan. Por lo tanto, para comprender la funcin del metabolismo en tanto ligado a la fisiologa celular global se necesita un enfoque holstico del estudio del metabolismo. Esa comprensin de la funcin sistmica de una red metablica es obligatoria para el xito del campo de la ingeniera metablica. El control del flujo metablico es el objetivo primario de la ingeniera metablica. El flujo metablico se define como la tasa a la que el material se convierte va reacciones y rutas metablicas. Para ello debemos comprender los factores que influyen en el flujo. Una vez que uno entiende el flujo metablico, se ha dado un paso hacia la comprensin del metabolismo celular, con lo que el ingeniero est en posicin de alterar el genotipo de la clula en la esperanza de lograr el fenotipo deseado. Objetivos: 1. Aumentar la produccin de metabolitos demasiado caros de obtener por sntesis qumica o para introducir una nueva capacidad. 2. Organismos con nuevas capacidades catablicas, de gran inters en aplicaciones ambientales o en microorganismos industriales que puedan crecer usando sustratos diferentes y ms baratos para la obtencin de vitaminas, aminocidos, antibiticos, etc. 3. Propiedades celulares que sean beneficiosas en el proceso industrial: evitacin de productos txicos como el acetato y desvo hacia productos menos txicos (etanol, acetolactato). Escherichiacoli con compuestos portadores de oxgeno, lo que le permite mejorar en condiciones de limitacin de oxgeno. La ingeniera metablica ya se haca, pero se han logrado resultados inesperados cuando las enzimas se sobreexpresan o se reprimen. Lo impredecible de la respuesta metablica a las alteraciones genticas se debe a la naturaleza multignica de la funcin metablica. Por lo tanto, no basta entender la funcin de una enzima o de una ruta aislada para describir la respuesta holstica del sistema al cambio gentico. Por lo tanto, para que la ingeniera metablica se beneficie de la I.G. hace falta comprender las funciones multignicas, y para ello necesitamos la genmica. 3.1Genmica Tras terminar un proyecto genoma, hay que identificar los genes o las ORFs, mediante:
Bsqueda por contenido
Bsqueda por seales
Mtodos integrados Estamos a punto de obtener catlogos completos de componentes de muchos organismos. La genmica funcional debe llevar al uso de esa informacin para analizar interpretar y predecir las funciones celulares resultantes de su actividad coordinada. La accin coordinada de mltiples genes y protenas se puede considerar como un circuito gentico, que es el conjunto de diferentes productos gnicos que se requieren conjuntamente para ejecutar una funcin particular. Para comprender la naturaleza sistmica de las funciones celulares, cada gen debe estudiarse en relacin con su contribucin a la funcin celular global. Actualmente los microorganismos suministran los mejores modelos para establecer mtodos in silico para analizar, interpretar u predicir las relaciones genotipo-fenotipo. Una vez que se han completado las asignaciones de ORFs a genes metablicos, se puede construir el mapa metablico completo que representa la estequiometra de todas las reacciones metablicas que tienen lugar en la clula. 3.2Anlisis de flujo metablico Con el subconjunto de genes que codifican las enzimas metablicas se puede construir una red de reacciones metablicas. Se puede escribir un balance de flujo para cada metabolito, y con el tiempo, en el estado estacionario, los flujos se deben equilibrar para evitar una acumulacin significativa del metabolito en la red. La estequiometra de todas las reacciones de la red se puede representar por una matriz estequiomtrica Sv = 0
S es la matriz estequiomtrica de m x n m es el nmero total de metabolitos n es el nmero de flujos metablicos)
v es el vector de n flujos metablicos Tpicamente el sistema est indeterminado donde m>n. Pero bajo ciertas condiciones algunas rutas no son operativas y se pueden obviar. El sistema se puede hacer totalmente determinado o supradeterminado y se puede resolver junto con las medidas de los flujos externos o internos. Los mtodos no invasivos de anlisis, como la RMN pueden proporcionar tambin informacin sobre la estructura de la red. Para determinar el estado metablico hay que resolver esa ecuacin para los flujos metablicos (v), lo que entonces indicar el estado metablico de la clula bajo las condiciones definidas. La matriz S es el componente clave del anlisis de flujo, y se puede derivar de la informacin genmica. El sistema indeterminado origina un rango infinito de soluciones a la ecuacin, pero las reales residen en un subconjunto llamado el set factible. Este se puede definir como las capacidades del genotipo metablico de un organismo, puesto que define todas las distribuciones de flujo que se pueden lograr con un juego particular de genes metablicos. El uso particular del genotipo metablico bajo unas condiciones concretas se puede definir como fenotipo metablico desplegado en esas condiciones. 3.3Ejemplos de aplicaciones de anlisis de balance de flujo Resumiendo lo visto hasta ahora: la genmica nos suministra informacin sobre la estructura y contenido de la red metablica de un organismo. A su vez, esto nos sirve para generar una matriz estequiomtrica, definida por la asignacin de las ORFs. Entonces, el anlisis de balance flujo se puede emplear para explorar la capacidades tericas de produccin y aptitud general del genotipo metablico. Ejemplos de objetivos:
Eliminacin de una enzima o su inhibicin para eliminar una ruta que compite con la de inters
Eliminacin de un subproducto txico
Amplificacin de un gen o grupo de genes para mejorar la sntesis de un producto existente
Expresin de enzimas heterlogas para para extender el rango de sustratos, para producur una nueva sustancia, para lograr rutas de degradacin de compuestos txicos
Desregulacin de enzimas para relajar los mecanismos de control de un nodo rgido
Manipulacin adicional de una ruta del metabolismo central para generar precursores, cofactores y energa necesarios para sostener a la ruta de inters modificada Veamos algunas reas de aplicacin. 3.3.1Deleciones gnicas El anlisis de balance de flujo se puede emplear para interpretar y predecir los efectos fenotpicos de alteraciones en el genotipo, como las debidas a deleciones. Se puede hacer una prediccin sobre si la delecin va a alterar negativamente la tasa de crecimiento o no va a tener influencia. La incapacidad de la red de absorber una alteracin conduce inmediatamente a la requerimientosauxotrficos. Con ello podemos determinar los requerimientos auxotrficos que se necesitan en una cepa genticamente alterada para encaminar los recursos metablicos hacia rutas o reacciones particulares. En un estudio in silico se investig la relacin entre el genotipo metablico de cepas K.O. de E. coli y su fenotipo, recurriendo a todas las combinaciones posibles de deleciones sencillas, dobles y triples de los genes del metabolismo intermediario. Los productos gnicos se clasificaron en varias categoras: esenciales, importantes, no esenciales y redundantes. Un buen nmero de genes parecan redundantes para el crecimiento en medio mnimo con glucosa. Los fenotipos previstos eran coherentes con los mutantes caracterizados experimentalmente. Se puede investigar los cambios esperados en el enrutamiento metablico cuando hay prdida de funcin de un producto gnico por deleciones gnicas o por inhibicin de su actividad. La red metablica tiene la suficiente flexibilidad estequiomtrica para redistribuir sus flujos metablicos con pocos cambios en su capacidad para el aumento de biomasa, incluso cuando se pierden enzimas clave. Adems, el anlisis de flujo se puede usar para predecir los fenotipos metablicos bajo difererentes condiciones de crecimiento, como sustrato o disponibilidad de oxgeno. El anlisis de flujo se puede combinar con tcnicas recientes que examinan la expresin gentica en una escala genmica. Aunque la relacin entre el valor de flujo y los niveles de expresin gnica es no linear, se puede obtener informacin cualitativa (on/off), as como la importancia relativa de los productos gnicos bajo una determinada condicin. Basndose en la magnitud de los flujos metablicos, se pueden inferir evaluaciones cualitativas de la expresin gnica. Estos se puede comparar con grupos de datos experimentales (arrays de oligonucletidos). Ello se vio con la levadura: se observaron los cambios temporales en los perfiles de expresin gnica durante el cambio diaxico usando ESTs de todo el genoma. 3.3.2Penicilliumchrysogenum Un modelo estequiomtrico con este hongo consider 61 flujos internos y la captacin de glucosa, lactato, -butirato y 21 aminocidos. Puesto que se consideraron 49 metabolitos intracelulares y 82 flujos incluyendo tasas de captacin, el nmero de grados de libertad fue 33. Se midieron 33 flujos, el mismo nmero que el de grados de libertad, incluyendo las tasas de captacin de los sustratos mencionados y las tasas de formacin de penicilina V y de 5 otros intermediarios clave. Se calcul el rendimiento mximo terico de produccin de penicilina para dos rutas diferentes de biosntesis de cistena, una por sulhidrilacin directa y otra por transulfuracin. El estudio propuso que un incremento de 20% del rendimiento terico mximo de penicilina V sobre glucosa era posible si la cistena se sintetizaba por sulfhidrilacin directa en lugar de por transulfuracin. 4.Herramientas genticas Las herramientas genticas ideales para la ingeniera metablica deberan ser:
Promotores fuertes y con un control estricto y consistente en todas las clulas. Los promotores inducibles deberan responder de modo lineal a la cantidad de inductor
El sistema de control gentico debera poder regular la expresin simultnea de mltiples genes aunque a diferentes niveles
El vector debera mantenerse indefinidamente en el husped en ausencia de una gran presin selectiva
El vector y el sistema gentico de regulacin asociado deberan imponer el mnimo de carga metablica en ausencia de expresin gnica (Vase artculo para ampliar estas ideas) 4.1Vectores
Deberan tener estabilidad segregacional, al estilo de la que tienen los plsmidos F y P1
Deberan tener un nmero mnimo pero consistente de copias en todas las clulas del cultivo. La consistencia la logran plsmidos como el F, cuya replicacin est coordinada con el ciclo celular
El vector debe poder albergar grandes fragmentos de ADN para poder clonar rutas completas. De nuevo parece que los sistemas mejores son los derivados del plsmido F
Encotrar vectores de amplio espectro de huspedes Se han diseado vectores basados en el plsmido F. Tienen entre 1-5 copias por clula. Se ha construido un vector derivado de F, que presenta las siguientes caractersticas:
9 kb de F con elementos necesarios para la replicacin y la estabilidad segregacional: Los orgenes oriV, oriS aseguran replicacin especfica del ciclo celular, el locus de reparto permite ese reparto equitativo a clulas hijas, el gen repD recombina los dmeros hasta monmeros los genes ccd matan cualquier segregante que pierda el plsmido
Gen bla para resistencia a ampicilina
Mdulo de clonacin para la expresin: Promotor de araBAD y gen araC para una expresin inducible por arabinosa Sitio de clonacin mltiple Terminadores de transcripcin
Este plsmido es estable en ausencia de presin selectiva, tiene una expresin gnica bien controlada e impone una pequea carga metablica. 4.2Promotores
Para la mayora de aplicaciones, necesitamos promotores fuertes y regulables
El nivel de expresin debera variar directamente y a ser posible linermente con la cantidad de inductor
Debera de poder inducido uniformemente cuando se estimule Desgraciadamente, los promotores investigados, especialmente el de lac, muestran respuestas del tipo todo o nada, que se piensa se deben al acoplamiento de la expresin del gen que codifica el transportador para el inductor. Esto supone una mayor carga metablica para las clulas que expresan los genes. La solucin lgica es desacoplar el control del gen del transportador respecto del control del inductor, o eliminar el gen del transportador del inductor y usar anlogos del inductor (como el IPTG) que difunden fcilmente a travs de la membrana. En otro lugar hemos hablado de los promotores ms usados (lac, araBAD), a los que hay que sumar el Pm de la ruta meta de los y Pu de la ruta upper de los plsmidos TOL de Pseudomonas. En ltima instancia, la ingeniera metablica tendr que intentar la expresin de diferentes genes a partir de diferentes promotores, y de hecho ya hay varios ejemplos de esta estrategia.
Artculos de esta seccin: [ Arriba ] [ Introduccin a la Biotecnologa ] [ Ingeniera gentica bsica ] [ Ingeniera gentica industrial ] [ Manipulacin de la expresin ] [ Ingeniera metablica ]
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Enrique Iez. Prohibido el uso fraudulento. Se permite su uso no comercial en entornos educativos. Microorganismos genticamente optimizados Produccin de compuestos de alto valor agregado para el agro y el sector de Bioenergas. En la plataforma de Ingeniera Metablica se desarrollan organismos genticamente optimizados que permiten la produccin de compuestos de alto valor agregado y mnimo impacto ambiental, a partir de materias primas de bajo costo. Para esto, se incorporan en la bacteria adecuada los genes de la ruta metablica de inters y se optimiza el metabolismo bacteriano para la obtencin del mximo rendimiento posible. Posteriormente, se identifican las mejores condiciones de cultivo que garantizan la mayor productividad posible. 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Estos procesos son redes qumicas que utilizan una serie de reacciones bioqumicas y enzimas que permiten a las clulas para convertir las materias primas en las molculas necesarias para la supervivencia de las clulas. Ingeniera Metablica busca especficamente para modelar matemticamente estas redes, calcular un rendimiento de productos tiles, y el pin punto partes de la red que limitan la produccin de estos productos. Tcnicas de ingeniera gentica se pueden utilizar para modificar la red con el fin de aliviar estas limitaciones. Una vez ms esta red modificada puede ser modelado para calcular el rendimiento del nuevo producto. El objetivo final de la ingeniera metablica es ser capaz de utilizar estos organismos para producir sustancias valiosas a escala industrial de una manera rentable. Ejemplos actuales incluyen la produccin de cerveza, vino, queso, productos farmacuticos y otros productos de la biotecnologa. Dado que las clulas usan estas redes metablicas para su supervivencia, los cambios pueden tener efectos drsticos sobre la capacidad de las clulas para sobrevivir. Por lo tanto, las compensaciones en la ingeniera metablica surgen entre la capacidad de las clulas para producir la sustancia deseada y sus necesidades de supervivencia naturales. Por lo tanto, en lugar de eliminar directamente y/o sobreexpresin de los genes que codifican para las enzimas metablicas, el enfoque actual es apuntar a las redes de regulacin en una clula para disear de manera eficiente el metabolismo. Historia y aplicaciones de la ingeniera metablica En el pasado, para aumentar la productividad de un metabolito deseado, un microorganismo que se ha modificado genticamente por mutacin inducida qumicamente, y la cepa mutante que sobreexpresa el metabolito deseado se elige entonces. Sin embargo, uno de los principales problema con esta tcnica es que la va metablica para la produccin de metabolito que no se analiz, y como resultado, las restricciones a la produccin y la va de las enzimas relevantes a ser modificados eran desconocidos. En 1990, una nueva tcnica denominada ingeniera metablica surgi. Esta tcnica analiza la va metablica de un microorganismo, y determina las limitaciones y sus efectos sobre la produccin de los compuestos deseados. A continuacin, utiliza la ingeniera gentica para superar esas limitaciones. Algunos ejemplos de ingeniera metablica xito son los siguientes: Identificacin de restricciones a la produccin de lisina en Corynebacteriumglutamicum y la insercin de nuevos genes para aliviar estas limitaciones para mejorar la ingeniera de produccin de una nueva ruta de biosntesis de cido graso, llamada va de la beta oxidacin invertido, que es ms eficiente de la va nativa en la produccin de cidos grasos y alcoholes que pueden potencialmente ser convertidos catalticamente a los productos qumicos y combustibles mejora de la produccin de DAHP, un metabolito aromtico producido por E. coli que es un intermedio en la produccin de aminocidos aromticos. Se determin a travs de anlisis de flujo metablico que el rendimiento mximo terico de DAHP por molcula de glucosa utilizada, era 3/7 - Esto se debe a que una parte del carbono de la glucosa se pierde en forma de dixido de carbono, en lugar de ser utilizado para producir DAHP. Tambin, uno de los metabolitos que se utilizan para producir DAHP, se converta en piruvato para el transporte de glucosa en la clula, y por lo tanto, ya no estaba disponible para producir DAHP. Con el fin de aliviar la escasez de PEP y aumentar el rendimiento, Patnaik et al. ingeniera gentica utilizada en E. coli para presentar una reaccin que convierte PYR volver a PEP. Por lo tanto, la PPE utilizada para el transporte de glucosa en la clula se regenera, y se puede utilizar para hacer DAHP. Esto dio lugar a un nuevo mximo rendimiento terico de 6/7 - doble de la del sistema de E. coli nativa. En la escala industrial, la ingeniera metablica es cada vez ms conveniente y rentable. De acuerdo con la Organizacin de la Industria Biotecnolgica ", ms de 50 instalaciones de biorrefinera se construyen a travs de Amrica del Norte para aplicar la ingeniera metablica para la produccin de biocombustibles y productos qumicos a partir de biomasa renovable que puede ayudar a reducir las emisiones de gases de efecto invernadero". Biocombustibles potenciales incluyen alcoholes de cadena corta y alcanos, steres metlicos de cidos grasos y alcoholes grasos y cidos grasos-y biocombustibles basados isoprenoides. Anlisis de flujo metablico Un anlisis de flujo metablico se puede encontrar en el anlisis de flujo de equilibrio La creacin de una va metablica para el anlisis El primer paso en el proceso es para identificar un objetivo deseado para lograr a travs de la mejora o modificacin del metabolismo de un organismo. Los libros de referencia y bases de datos en lnea se utilizan para reacciones de investigacin y las vas metablicas que son capaces de producir este producto o resultado. Estas bases de datos contienen abundante informacin genmica y qumica, incluyendo vas para el metabolismo y otros procesos celulares. Usando esta investigacin, se elige un organismo que se utiliza para crear el producto o resultado deseado. Consideraciones que se tienen en cuenta a la hora de tomar esta decisin son la proximidad va metablica del organismo es la va deseada, los costos de mantenimiento asociados con el organismo, y lo fcil que es modificar la ruta del organismo. Escherichiacoli se utiliza ampliamente en la ingeniera metablica para sintetizar una amplia variedad de productos tales como los aminocidos, ya que es relativamente fcil de mantener y modificar. Si el organismo no contiene la ruta completa para el producto o resultado deseado, a continuacin, los genes que producen las enzimas que faltan deben ser incorporados en el organismo. Anlisis de una va metablica La va metablica completado se modela matemticamente para encontrar el rendimiento terico del producto o de los flujos de reaccin en la clula. Un flujo es la velocidad a la que se produce una reaccin dada en la red. Anlisis simple va metablica se puede hacer a mano, pero la mayora requieren el uso de software para realizar los clculos. Estos programas utilizan algoritmos complejos de lgebra lineal para resolver estos modelos. Para resolver una red usando la ecuacin para sistemas determinados se muestra a continuacin, se debe introducir la informacin necesaria acerca de las reacciones pertinentes y sus flujos. Informacin sobre la reaccin estn contenidos en las matrices Gx y Gm. Las matrices Vm y Vx contienen los flujos de las reacciones pertinentes. Cuando resuelto, la ecuacin se obtienen los valores de todos los flujos desconocidos. La determinacin de las manipulaciones genticas ptimas Despus de resolver para los flujos de reacciones en la red, es necesario determinar qu reacciones pueden ser alterados con el fin de maximizar el rendimiento del producto deseado. Para determinar qu manipulaciones genticas especficas para llevar a cabo, es necesario el uso de algoritmos de clculo, tales como OptGeneoOptFlux. Ellos proporcionan recomendaciones para los que los genes deben ser sobreexpresados, eliminados, o se introducen en una clula para permitir aumento de la produccin del producto deseado. Por ejemplo, si una reaccin dada tiene particularmente bajo flujo y est limitando la cantidad de producto, el software puede recomendar que el enzima que cataliza esta reaccin debe ser sobreexpresado en la clula para aumentar el flujo de reaccin. Las manipulaciones genticas necesarias se pueden realizar utilizando tcnicas estndar de biologa molecular. Los genes pueden ser sobreexpresados o eliminados de un organsism, en funcin de su efecto sobre la va y el objetivo final. Las medidas experimentales Con el fin de crear un modelo de solucin, a menudo es necesario tener ciertos flujos ya conocidos o medidos experimentalmente. Adems, con el fin de verificar el efecto de las manipulaciones genticas en la red metablica, es necesario medir experimentalmente los flujos en la red. Para medir flujos de reaccin, las mediciones de flujo de carbono se hacen usando carbono-13 etiquetado isotpico. El organismo se alimenta una mezcla que contiene molculas donde carbonos especficos estn diseados para ser carbono-13 tomos, en lugar de carbono-12 - Despus de estas molculas se utilizan en la red, tambin se convierten en metabolitos aguas abajo marcado con carbono-13, ya que incorporan los tomos en sus estructuras. El patrn de marcacin especfica de los diferentes metabolitos se determina por los flujos de reaccin en la red. Patrones de marcaje se pueden medir utilizando tcnicas tales como cromatografa de gas-espectrometra de masa junto con los algoritmos de clculo para determinar los flujos de reaccin.