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PRACTICA DE LABORATORIO:

REACCIONES ENZIMATICAS Y ACTIVIDADES ENZIMATICAS EN TEJIDOS ANIMALES Y


VEGETALES


OBJETIVOS
Al finalizar este laboratorio el estudiante podr:

1. Explicar qu es una enzima y cmo stas actan en reacciones intracelulares.
2. Identificar factores que afectan la actividad enzimtica.


INTRODUCCION
Las clulas llevan a cabo simultneamente una gran cantidad de reacciones qumicas necesarias
para la vida. Muchos de los productos de esas reacciones se necesitan inmediatamente, y si no
fuera por la participacin de las enzimas, algunas reacciones no se produciran tan rpido. Las
enzimas, en su mayora protenas o RNA (riboenzimas), son catalizadores qumicos que agilizan
una reaccin que envuelve la formacin o rompimiento de enlaces qumicos.

Las enzimas no se consumen en las reacciones, ni tampoco se alteran, razn por lo cual no se
necesitan en grandes cantidades. Las enzimas actan sobre los sustratos formando un complejo
enzima-sustrato; esto ocurre en un lugar en especfico conocido como el sitio activo de la enzima.
Las enzimas son muy selectivas porque pocas molculas pueden interactuar bien con este sitio
(Figura 1).


FIGURA 1.
Reaccin con participacin de una enzima. Se forma el complejo Enzima-Sustrato al unirse la
enzima a los sustratos en lugares especficos de la enzima donde encajan los sustratos. Se forma
el producto y la enzima no se altera en el proceso; quedando libre para otra reaccin.

Las enzimas trabajan ptimamente bajo condiciones especficas y ciertos cambios pueden alterar
el funcionamiento de la enzima, desactivarla o hasta destruirla. Algunas enzimas necesitan
activadores para cambiar su conformacin de modo que pueda formarse el complejo enzima-
sustrato. Estos activadores se conocen como cofactores y pueden ser tan simples como iones
metlicos. Los cofactores orgnicos se conocen como coenzimas. Las enzimas pueden afectarse


negativamente por inhibidores que impidan la actividad enzimtica. Estos inhibidores pueden
afectar el sitio activo de dos maneras: competitivamente, al bloquear el sitio activo, o no
competitivamente, al pegarse en otro lugar de la enzima y alterar indirectamente la forma del sitio
activo.

MATERIALES

Perxido de hidrgeno
Papa
Hgado
Rin
Leche
Espinaca
Placas de porcelana
Goteros
Morteros o licuadora
Tubos de ensayo
Perxido de Hidrogeno
Gasa



METODO:
FUNCIONAMIENTO DE LA CATALASA EN VARIOS ORGANISMOS

A. Funcionamiento de la enzima catalasa en varios organismos


En los ejercicios siguientes se estudiar el funcionamiento de la catalasa. Esta enzima est
presente en casi todas las clulas aerbicas y acta descomponiendo perxido de hidrgeno (agua
oxigenada) en agua y oxgeno, segn la siguiente reaccin:





Procedimiento

En este ejercicio se prepararn varios homogenizados para obtener partculas pequeas y
uniformes al mezclarlas con el agua.

1. Lvese y seque bien las manos antes de iniciar la manipulacin de los tejidos a tratar Y
2. Para preparar los homogenizados, corte en pedazos por separado las muestras de papa,
hgado, setas y espinaca.
3. Usando un mortero, triture el material con un poco de agua hasta diluir parte de la muestra; no
muela excesivamente para que no queden pedazos muy pequeos del material.
4. De ser necesario, filtre el macerado con una gasa
5. Coloque 3ml de cada homogenizado en un tubo de ensayo.
6. Marque el nivel hasta donde llega cada homogenizado.
7. Ponga 3 mL de perxido de hidrgeno en cada tubo de ensayo.
8. Observe la reaccin que sucede en cada tubo y marque el cambio en el nivel del lquido.
9. Tabule los resultados en la Tabla 1.




Tabla 1. Resultados de produccin de catalasa en varios organismos
Muestra Cantidad de burbujas Cantidad de homogenizado consumido
A
B
C
D

Preguntas
1. Qu ocurri al aadir el perxido?
2. Ocurri lo mismo en todas las muestras?
3. Por qu se forman burbujas?
4. Cmo se muestra en nuestro experimento la presencia ausencia de catalasa en los tejidos?
5. Qu otros organismos podran usarse para esta prueba?
6. Por qu se prepararon los homogenizados? Por qu no se aadi el perxido directamente a
los tejidos sin macerarlos?
7. Explique por qu la gran mayora de las especies de plantas y de animales producen la enzima
catalasa.
8. Fue igual la produccin de catalasa en todas las muestras?
9. Qu indican los resultados sobre la fisiologa de estos organismos?


B. Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas

PROCEDIMIENTO

1. Coloque 3ml de cada homogenizado en un tubo de ensayo.
2. Someta los tubos a coccin en bao de mara
3. Ponga 3 mL de perxido de hidrgeno en cada tubo de ensayo.
4. Observe la reaccin que sucede en cada tubo
5. Compare estos resultados con la operacin anterior (parte A de la practica)

Preguntas
6. Cmo se relacionan la temperatura y la actividad enzimtica?
7. Qu le sucede a las enzimas cuando se exponen a temperaturas extremas (muy fras o muy
calientes?
8. Cul ha sido el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica?


C. Accin de la Amilasa

Las amilasas (Alfa y Beta) qumicamente conocidas como 1,4-glucano o 4 glucanohidrolasa
constituyen uno de los componentes de la saliva producida por las glndulas submaxilar,
sublingual y partida. Las amilasas se presentan a elevadas concentraciones en los cereales en
germinacin; a donde juegan un papel importante en la degradacin de los almidones para la
obtencin de combustibles Que aseguren el desarrollo embrionario. Las beta-amilasa hidrolizan
produciendo maltosa, por rompimiento de los enlaces alfa 1,4 glucanos de los polisacridos a
partir del extremo no reductor de la cadena



Procedimiento 1

1. Tome 2ml de extracto de cebada y calintelo en bao de Mara por 5 minutos
2. Marque dos tubos de ensayo como Tubo No. 1 y tubo No.2
3. En el tubo 1 agregue 4 ml de solucin de almidn al 1% y 2 mL de cebada previamente
calentada en bao de Maria
4. En el tubo No.2 coloque 4ml de solucin de almidn al 1% y 2m de extracto de cebada
5. Agite cada tubo y de cada uno tome 2ml de la solucin y lleve a tubos limpios y realice la
prueba de lugol
6. Repita la prueba de lugol a los 5 minutos


Procedimiento 2

1. Tome 3 tubos de ensayo y mrquelos Tubo No.1, Tubo No.2, Tubo No.3
2. Coloque en cada uno de ellos 2ml de buffer fosfato 0.1M pH3, 7 y 10
3. A cada tubo adicione 2ml de extracto de cebada y agite hasta que la solucin sea
homognea
4. Adicione a cada tubo 2ml de la solucin de almidn 1%
5. A partir de este momento y a intervalos de 5 minutos retire 1ml de solucin de cada tubo
y realice la prueba de lugol
6. Interprete los resultados, Cul es el pH optimo para la actividad de la amilasa?



Preguntas

1. Determine en cul de los tubos la prueba de almidn se hace negativa. Explique el
resultado
2. En el tubo en que la prueba para almidones se hace negativa, ensaye para azcar reductor
Cul es el reactivo a emplear?
3. Si esta ltima prueba es positiva cual es el azcar responsable de la reaccin
4. En cul de los tubos de ensayo la prueba es siempre positiva? A qu se debe esto?


INFORMACION ADICIONAL

La catalasa: se encuentra en casi todas las clulas aerbicas, donde acelera el rompimiento de
perxido de hidrgeno (producto txico de las clulas). A veces, la reduccin de oxigeno al agua
es incompleta y se produce superxido, una sustancia sumamente txica. Una enzima rompe el
superxido y forma agua y perxido de hidrgeno, que es menos txico. La catalasa entonces
rompe el perxido de hidrgeno para producir agua y oxgeno.

Recursos del tema se pueden encontrar en:
Solomon, Berg & Martin (2004). Biologia, 7
th
Ed. Brooks Cole Publ.
http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/chang



Denniston, Topping and Caret (2004). General, Organic, and Biochemistry , 4ta Ed. Mc Graw Hill.
New York. USA
Boyer, B (1999). Concepts in Biochemistry, Brooks/Cole Publishing.
http://www.seps.org/cvoracle/faq/catalase.html

www.worthington-biochem.com/introdBiochem/introEnzymes.html