Anda di halaman 1dari 12

PRINSIP DASAR TEORI MENGHITUNG MIKROORGANISME PADA CAWAN

(BAGIAN 1)
Tujuan dari tulisan ini adalah untuk membumikan prinsip teori menghitung
mikroorganisme yang didalamnya meliputi cara sampling dan memilih metode tes yang
tepat sehingga didapatkan data yang akurat dan meyakinkan. Artikel ini dipostingkan
karena penulis jarang menjumpai uraian tentang cara menghitung bakteri dalam cawan
yang berbahasa Indonesia.
Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel,
diantaranya adalah plate count (spread plate, pour plate, spiral plate), membrane
filtration, MPN, menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya
(misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dll.). Namun dalam ulasan ini
lebih ditekankan pada metode yang memerlukan penghitungan koloni pada cawan petri,
seperti membrane filtration, spread plate, pour plate dll.
Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah
sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan
CFUs/volume atau berat. CFUs adalah singkatan dari Coloni Forming Units yang
artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni
adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan
membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi
ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar
merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel
pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, sarcina dll.
sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar
merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan
berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel.
Hal-hal penting yang harus dipikirkan matang sebelum menganalisa sampel untuk
diketahui jumlah mikroorganismenya adalah:
1. Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan
volume.
2. Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat.
3. Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung, misalnya
bermaksud akan menghitung yeast, bakteri, atau bakteri genus tertentu saja.
4. Menentukan media pertumbuhan yang cocok.
5. Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri, yeast dan
molds.
6. Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika sample yang
dianalisa memerlukan referensi tersebut.
7. Memperkirakan jumlah sampel (volum/berat) yang perlu ditampung pada saat
pengambilan sampel yang disesuaikan dengan sample size dari metode teretentu.
Seorang mikrobiologiwan sebaiknya mampu memprediksi jumlah sel mikroba dalam
suatu sampel tertentu atau yang disebut dengan cell density sebelum menganalisanya.
Densitas sel sangat tergantung dari jenis sample. Kemampuan mengira-ira ini dapat
diperoleh dari pengalaman, membaca atau bahkan bagi yang expert didapat dari
perasaan. Fungsi utama memperkirakan densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu
atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk menentukan jumlah sampel yang akan
dianalisa. Keputusan ini adalah sangat penting.
Sebagai pijakan awal, harus diketahui bahwa hasil yang paling baik adalah antara 30-300
koloni per cawan, ada juga yang menyebutkan 25-250 koloni per cawan. Mengapa dipilih
range jumlah koloni seperti itu ?... Hal ini ditujukan untuk meminimalisir kemungkinan-
kemungkinan kesalahan dalam proses analisa, terutama statistical error.
Untuk lebih jelasnya:
Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka:
- Kesalahan statistik tinggi.
- Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak
sengaja masuk, besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan).
- Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti.
solusi : memperbesar ukuran sampel.
Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka :
- Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A
menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik)
sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang
berdekatan.
- Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan
keterbatasan nutrisi.
- Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga
mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap
dihitung satu koloni.
- Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloni.
Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan.
Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang
mempengaruhi hasil akhir ini, seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan
metode apakah yang cocok untuk sampel tersebut.
Disarankan sebelum menghitung atau menganalisa yang sebenarnya, dilakukan perkiraan
(analisa pendahuluan) terlebih dahulu dengan mencoba memplatingnya pada ukuran
sampel atau pengenceran yang berbeda-beda.
Misalnya:
1. Sampel X tidak dapat diperkirakan jumlah densitas selnya, tetapi sepertinya jumlah
ml/cawan adalah lebih dari 300. Perlu dilakukan pemplatingan awal dahulu supaya
diperoleh tingkat pengenceran yang cocok sehingga menghasilkan 30-300 koloni per
cawan. Contohnya, didapatkan 10
-4
yang menghasilkan koloni dengan kisaran tersebut,
maka selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat mengulanginya dengan tingkat
pengenceran yang sama (tanpa sampai pengenceran yang lebih tinggi).
2. Sample X diperkirakan memiliki jumlah mikroba yang sangat sedikit +/-30
koloni/100ml. Perlu dilakukan penentuan sample size yang tepat terlebih dahulu supaya
dihasilkan 30-300 koloni per cawan atau paling tidak mendekati. Misal, jika dengan
ukuran sampel:
100 ml dihasilkan 10 koloni,
200 ml dihasilkan 22 koloni,
500 ml dihasilkan 49 koloni,
maka sample size yang paling sesuai adalah 500 ml atau lebih. Penentuan sample size ini
juga dipengaruhi sifat sampel itu sendiri dan keterbatasan metode yang dipakai.
Selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat menganalisa dengan sample size 500 ml
atau lebih. Yang dimaksud mendekati disini adalah jika misalnya ditemukan data
analisa pendahuluan seperti berikut:
50 ml dihasilkan 0 koloni/cawan,
100 ml dihasilkan 1 koloni/cawan,
200 ml dihasilkan 5 koloni/cawan,
400 ml dihasilkan 11 koloni/cawan,
500 ml dihasilkan 16 koloni/cawan,
Sedangkan dengan keterbatasan metode (misalnya metode filtrasi membran tidak
sanggup untuk menyedot sampel seperti air teh hasil pasteurisasi sampai lebih dari 500
ml karena akan menghambat pori pada membran tersebut sehingga membran macet)
maka digunakan ukuran sampel yang paling mendekati batas bawah kisaran yaitu 30
koloni per cawan.
Pemilihan metode dengan benar.
Berbagai metode umum untuk uji enumerasi bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri
antara lain:
- Plate count dengan teknik penanaman spread plate dan pour plate
- Membrane filtration
Pemilihan metode yang benar tergantung kepada :
- Jenis sampel
- Densitas sel (perkiraan dari analisa pendahuluan)
- Spesifikasi standar baku / standar lolos uji
Telah diuraikan didepan bahwa sebagai patokan sebaiknya didapatkan 30-300 koloni per
cawan dengan alasan utama adalah kesalahan statistik. Kita tidak perlu mengetahui secara
dalam mengenai mengapa harus dalam kisaran itu, atau mengapa tidak 100-500 koloni
per cawan, dan alasan-alasan berbau statistik lainnya. Namun sebagai microbiologist
yang baik, seharusnya mampu memilih metode yang tepat berdasarkan acuan kisaran itu,
karena kisaran 30-300 koloni ini digunakan secara internasional.
Berikut adalah penjelasan singkat metode-metode beserta ukuran sampel yang
disarankan:
Spread plate: teknik penanaman ini didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan
agar. Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan dengan diameter +/-
9 cm.
Jika digunakan volume:
<0,1 ml: kemungkinan kesalahannya adalah sel tidak tersebar merata (tidak tersapu oleh
batang L) karena volume pelarut kurang walaupun dengan pengenceran yang tepat.
Semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang
menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang
tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam.
Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut
tertekan keluar) sangat besar pengaruhnya pada hasil yang diperoleh.
0,1 ml
0,1 ml : volume yang tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah
mengering sehingga tidak menggenangi permukaan agar. Secara peluang, sel bakteri
dapat terambil dengan acak dan seragam dari tabung.
>0,1 ml : volume yang lebih besar otomatis air di permukaan agar lebih banyak sehingga
sulit mengering dan dapat menyebabkan pertumbuhannya memenuhi seluruh permukaan
agar karena sel dapat disebarkan oleh air (inilah kekurangan dari metode spread plate).
Penggunaan teknik penanaman ini sebaiknya dari jenis sampel yang memiliki densitas sel
yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu yang sesuai. Lebih baik tidak menganalisa
jenis sampel seperti air mineral dalam kemasan dengan teknik ini karena dikhawatirkan
jika terdapat pertumbuhan maka pertumbuhan tersebut kemungkinan besar adalah
kontaminan. Hal ini disebabkan oleh sedikitnya jumlah sel per satuan volum dalam air
mineral tersebut, dan jika dari sekian ratus ml sampel hanya diambil 0,1 ml-nya maka
secara nalar peluang untuk terambil sangat kecil. Permasalahan ini dapat dijelaskan
dalam kasus berikut:
Hasil perhitungan koloni dari ilustrasi di atas adalah sangat tidak representatif dan jika
tetap diambil 0,1 ml dan diplating maka kemungkinan besar adalah tidak ada
pertumbuhan. Misalnya saja didapati ada pertumbuhan hanya satu koloni, maka dapat
timbul pertanyaan apakah koloni ini berasal dari sampel atau kontaminan.
Pour Plate : teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan
sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel
tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar.
Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar
(bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan
dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang
dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran
30-300 koloni/cawan.
Jika digunakan volume:
<1ml : Sel kemungkinan tidak tersebar merata karena sel terlarut pada volume yang
terlalu kecil sehingga saat bercampur dengan agar akan sulit tersebar. Seperti teknik
spread plate semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang
menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang
tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam.
Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut
tertekan keluar) dapat berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh.
1-2 ml : volume sampel yang cocok tentunya dengan densitas sel >30sel/ml.
> 2 ml : semakin besar ukuran sampel maka kekuatan agar semakin berkurang dan lama
memadat sehingga dapat mempertinggi resiko kesalahan teknis seperti agar jatuh ke tutup
cawan. Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media
semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan
ukuran cawan yang sama. Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah
dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko
tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya
mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu
dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate.
Teknik penanaman ini lebih tepat untuk jenis sampel yang tidak dapat untuk difiltrasi dan
sulit sulit untuk diratakan di permukaan agar seperti jus buah.
Lalu jika timbul pertanyaan bagaimana cara yang tepat untuk menganalisa jenis sampel
jus jeruk atau jus apel hasil pasteurisasi yang diperkirakan memiliki densitas sel <10
sel/200ml? Permasalahannya adalah jenis sampel seperti ini tidak dapat difiltrasi dan
hanya dapat dilakukan dengan teknik pour plate. Hal ini akan dibahas pada bagian
selanjutnya.
Membrane filtration : Prinsip teknik ini adalah dengan melewatkan sejumlah volume
sampel pada saringan dengan diameter pori lebih kecil dari pada sel mikroba. Hal inilah
yang menjadi keterbatasan teknik filtrasi membran, dan dapat berpengaruh kepada jenis
sampel dan ukuran sampel yang akan dianalisa. Metode filtrasi membran sebaiknya
digunakan hanya pada sampel yang memiliki perkiraan jumlah sel yang kecil dan metode
ini merupakan metode yang paling baik untuk menganalisa cairan dengan volume yang
besar, tetapi dibatasi jumlah koloninya pada kisaran 100 CFU/membran.
Beberapa pengaruh tersebut adalah:
- Viskositas / kekentalan sampel : semakin kental cairan maka semakin sulit
difiltrasi sehingga volume yang dibutuhkan tidak terlalu besar. Misalnya sirup,
kecap, madu dll.
- Bahan-bahan yang terlarut dalam sampel : suatu bahan-bahan mikroskopis yang
dapat menghambat pori-pori sehingga semakin sedikit jumlah pori yang dapat
melewatkan larutan tersebut. Misalnya air teh, kopi dll.
Ciri-ciri dari jenis sampel yang seperti ini adalah terdapat bekas pada membran filter
setelah dilakukan penyaringan.
Ukuran sampel yang dipakai dalam teknik membran filtrasi tergantung kepada jenis
sampel, standar lolos uji / jumlah maksimum aman, ukuran pori-pori membran filter dan
acuan 30-300 koloni.
-Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat
tinggi: maka dapat diambil sampel dengan ukuran sampel yang kecil (misalnya 1 ml).
Setelah difiltrasi maka ditambahkan air steril secukupnya (20 ml) supaya sel tersebar
merata pada membran filter. Jika tidak ditambahkan air steril maka pertumbuhannya akan
mengelompok di pinggir yang disebabkan oleh adanya pengumpulan air sampel pada
pangkal filter funnel (corong) dan juga kemungkinan masih ada sel yang menempel pada
dinding filter funnel (fungsi membilas). Selain cara tersebut sampel dapat terlebih dulu
diencerkan sampai tingkat yang sesuai.
-Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat
sedikit maka ukuran sampel sebaiknya diperbesar.
-Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang memiliki kekentalan yang tinggi, maka
sampel dapat ditambah dengan air steril. Tujuannya yaitu menurunkan kekentalan sampel
tersebut sehingga lebih mudah difiltrasi. Perhitungannya tetap mengacu pada volume
sampel yang dianalisa bukan volume total setelah ditambah air steril karena air steril ini
bukan bagian dari sampel.
.
Studi kasus :
- Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air sungai / kali tercemar?
- Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air mineral / AMDK (Air
Minum Dalam Kemasan)?
- Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air teh dalam botol hasil
pasteurisasi?
- Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel jus buah yang mengandung
ampas buah hasil pasteurisasi?
1. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air sungai / kali tercemar?
Permasalahannya: air sungai memiliki perkiraan densitas sel yang sangat tinggi misalnya
dapat mencapai 10
8
sel/ml.
Sampel air sungai dapat diencerkan secara bertingkat (1:9) atau yang disebut teknik
gradual dilution. Dari tingkat pengenceran yang tepat dapat ditanam dengan metode
spread plate, pour plate ataupun dengan teknik membrane filtrasi. Perlu diingat bahwa
tetap mengacu pada kisaran 30-300 koloni per cawan sehingga misalnya pada tabung
(10ml) pengenceran yang menghasilkan kira-kira 10
3
sel/ml, maka penanaman sebaiknya
dilakukan dengan spread plate yaitu diambil 0,1 ml (didapatkan +/- 100 koloni) lalu pada
tingkat pengenceran 10
2
sel/ml, maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan pour plate
yaitu diambil 1 ml (+/- 100 koloni), sedangkan dari tingkat pengenceran yang
diperkirakan menghasilkan 10 sel/ml maka seluruh volume dalam tabung dapat difiltrasi
sehingga didapatkan +/- 100 koloni. Tiap pengenceran yang tepat beserta teknik
penanamannya tersebut hanyalah opsi yang dapat disesuaikan dengan tujuan dan alat
yang tersedia.
Jika akan dianalisa dengan filtrasi membran dan transfer cairannya hanya 1 ml atau lebih
maka sebaiknya setelah disaring, ditambahkan air steril secukupnya (+/- 20 ml) untuk
menyebarkan sel-sel pada kertas membran (dapat dilihat pada gambar).
2. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air mineral?
Permasalahannya adalah bahwa sampel ini memiliki jumlah bakteri yang sangat sedikit
yang terlarut dalam air dengan volume yang banyak.
Lalu bagaimana cara menghitungnya? Air mineral dalam kemasan merk tertentu dibuat
sedemikian rupa sehingga sebisa mungkin bebas dari bakteri. Perkiraan jumlah per 500
ml air adalah <10CFU, oleh karena itu untuk menghitung bakteri yang sangat sedikit
secara akurat maka ukuran sampel sebaiknya diperbesar. Memperbesar ukuran sampel
untuk dianalisa, berarti memperbanyak sel (koloni) untuk dihitung. Perhatikan ilustrasi
berikut:
3. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air teh dalam botol hasil
pasteurisasi?
Permasalahnnya hamper sama dengan menghitung mikroba pada air minum dalam
kemasan yaitu jumlah bakteri yang sedikit, tapi yang menjadi titik kelemahan disini yaitu
sifat dari sampel itu sendiri yang tidak dapat disaring dengan teknik filtrasi membran
dalam volume yang besar. Hal ini disebabkan adanya zat-zat yang terkandung dalam teh
yang dapat menghambat pori membran sehingga jika lebih dari 100ml (pada umumnya)
proses filtrasi akan macet.
Volume sampel yang disarankan sebaiknya dengan volume yang besar (misalnya 500ml).
Namun dalam volume 500 ml itu disaring pada beberapa membran filter sehingga
membran tidak terlalu mampat oleh zat-zat di dalam teh. Kemudian penjumlahannya
tetap dijumlahkan total dari beberapa membran filter tersebut. Tidak dapat satu-satu.
4. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel jus buah yang mengandung
ampas buah hasil pasteurisasi?
Permasalahan disini yaitu jumlah bakteri yang sangat sedikit dalam volume yang banyak
dan juga adanya ampas buah yang dapat menghambat pori membran filter ataupun ujung
pipet ukur.
Jika dianalisa dengan teknik penanaman spread plate, maka ukuran sampel yang diambil
terlalu sedikit (0,1ml) sehingga kesalahan statistiknya sangat tinggi.
Jika dianalisa dengan teknik filtrasi membran, maka ampas buah dapat menghambat
membran filter.
Cara analisa yang tepat adalah dengan teknik pour plate, tetapi kekurangannya adalah
ukuran sampel yang kecil (1 ml). Namun hal ini dapat disiasati dengan memperbesar
ukuran sampel (misalnya menjadi 5 ml) dan ditambah dengan media pertumbuhan yang
konsentrasinya lebih besar (misalnya 2 kali resep) sehingga saat dicampur dengan sampel
maka konsentrasi media dapat menjadi 1X.
Misal dalam botol 350 ml jus stroberi hasil pasteurisasi merk tertentu diperkirakan
terdapat <10CFU /350ml. Untuk benar-benar menghitung bakteri di dalam jus tersebut
terpaksa harus dilakukan skrining, yaitu memplatingnya memakai teknik penanaman
pour plate masing-masing 5 ml pada tiap cawan (d: 9 cm) dengan konsentrasi media 2X
(penambahan media +/-5 ml) . Hal ini jelas membutuhkan cawan minimal 70 buah dan
dengan konsumsi media yang lebih boros. Mengapa media yang ditambahkan
konsentrasinya lebih besar? Karena dalam teknik yang tidak biasa ini membutuhkan
sampel 5 ml, sedangkan perbandingan antara sampel dan media adalah 1:1. Jadi hal ini
ditujukan untuk mengimbangi ukuran sampel yang besar sehingga konsentrasi media
setelah dicampur menjadi 1X. Jika hal ini dilakukan maka akan membutuhkan teknik
aseptis yang sangat teliti.
Kesimpulan dari uraian di atas adalah :
INTINYA ADALAH MELIPATGANDAKAN ATAU MENYEDIKITKAN
(MENGENCERKAN) SAMPEL DAN MEMILIH CARA ANALISA YANG PALING
TEPAT SUPAYA DIPEROLEH PERHITUNGAN YANG MEMENUHI SYARAT
SECARA STATISTIK DEMI KEAKURATAN HASIL ANALISA DAN
MEMINIMALKAN KESALAHAN-KESALAHAN.
Bersambung ke bagian 2