Anda di halaman 1dari 5

BAB III

MATERI DAN METODE


3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Sampel susu diambil pada bulan Oktober 2014 yang berasal dari sapi perah Frisian Holstein
yang berada di Kabupaten Enrekang dan dilakukan . Identifikasi dan pengujian sensifitas
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin.
3.2. Materi Penelitian
3.2.1. Sampel dan teknik sampling
Sampel diambil dari sapi betina lakatasi dengan jumlah Sampel penelitian diambil
menggunakan metode Simple Random Sampling dengan rumus:
(T-1)(n-1) 15.
Dimana, n= jumlah sampel
T= perlakukan, dimana dalam hal ini berupa lokasi desa
3.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Baired Parker Agar (BPA),
Nutrient Agar (NA), perekasi pewarnaan gram, perekasi katalase, Mannitol Salt Agar
(MSA).
3.2.3. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa padel, test tube, container ice pack,
cawan petri, tabung reaksi, mikroskop, objek glass, cover glass, botol media, pipet ukur,
ose, bunsen, inkubator, stomacher, autoclave.



3.3. Metode
3.3.1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri
3.3.1.1. Isolasi Bakteri
Isolasi dilakukan dengan penanaman bakteri pada media Baird Parker Agar
(BPA) dan Nutrient Agar (NA). Secara aseptis dilakukan pengenceran dimulai
10
0
,10
1
,dst. Pengenceran 10
-1
dan 10
-2
dimasukkan dalam cawan lalu media Baird
Parker Agar (BPA) dituangkan dan dihomogenkan dengan menggoyangkan seperti
angka 8. Cawan diinkubasi selama 24 -48 jam pada suhu 37
o
C . Sementara
pengenceran 10
-3
dan 10
-4
dimasukkan dalam cawan yang lain lalu media Nutrient Agar
(NA) untuk menghitung Total Plate Count (TPC). Koloni S.aureus pada BPA
mempunyai cirri koloni bundar, licin/halus, cembung,diameter 2mm-3mm, warna abu-
abu hingga kehitaman, sekeliling tepi koloni being (berbentuk halo). Koloni mempunyai
konsistensii berlemak dan lengket bila diambil denga jarum inokulasi. (BSN,2011).
3.3.1.2. Identifikasi Bakteri
Uji identifikasi diawali dengan Pewarnaan Gram. Kaca objek dibersihkan
dengan alkohl hingga bebas lemak, kemudian 1 tetes suspensi diletakkan pada kaca
objek lalu disebarkan setipis mungkin. Lalu difiksasi di atas bunsen. Preparat yang telah
difiksasi kemudian ditetesi dengan Kristal Violet lalu didiamkan selama 1-2 menit. Sisa
zat warna dibuang, kemudian dibilas dengan air mengalir. Seluruh preparat ditetesi
dengan larutan lugol dan biarkan selama 30 detik. Buang larutan lugol dan bilas dengan
air mengalir. Lunturkan preparat dengan alkohol 96% sampai semua zat warna lutur, dan
segera cuci dengan air mengalir. Teteskan dengan zat warna Fuchsin, biarkan selama 2
menit lalu bilas dengan air mengalir kemudian dibiarkan kering. Amati di bawah
mikroskop dengan pemebesaran objektif 100x memakai emersi. S.aureus memiliki ciri
berwarna ungu dan bergermbol seperti anggur.
Uji katalase dilakukan untuk membedakan Staphylcccus dan streptcooccus.
Ambil 1 se inokulum dari Nutrient Agar (NA) lalu goreskan ke dalam media TSA
miring dan inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35
o
C. Setelah diinkubasi ambil 1 ose
inokulum tersebut dan letakkan di atas gelas preparat, tetesi dengan H
2
O
2
untuk melihat
pembentukan gelembung-gelembung gas(BSN,2011)
Uji fermentasi manitol dilakukan dengan mengambil 1 ose inokulum dari
Baird Park Agar. Inokulasikan ke tabung reaksi yang berisi media manitol, tutup lapisan
atas dengan parafin oil steril setebal 25mm. Inkubasi selama 5 hari pada suhu 35
o
C.
Kondisi asam dihasilkan secara anaerob jika terjadi perubahan warna media dari ungu
menjadi kuning, ini menunjukkan adanya Staphylococcus aureus. (Anonim, 2013)
Uji koagulase dilakukan dengan penanaman koloni yang diduga
Staphylococcus aureus ke dalam 2 ml BHI broth dan diinkubasi 18-24 jam pada suhu
37
o
C. Inokulum yang telah ditanam dipindahkan 0,2 ml- 0,3 ml ke dalam tabung steril
dan tambahkan 0,5 ml koagulase plasma kemudian diaduk dan diinkubasi pada suhu
37
o
C. Pengamatan dilakukan tiap jam untuk 4 jam pertama dan dilanjutkan hingga 24
jam untuk melihat terbentuknya koagulan. Koagulan yang terbentuk secara padat/solid
dan tidak jatuh apabila tabung dibalik dinyatakn positif (reaksi 4+). Koagulan yang
menunjukkan reaksi 2+, dan 3+ harus dilakukan uji tmbahan (BSN, 2011).
Uji Voges Proskouer (VP) dikerjakan dengan memupuk koloni
staphylococcus pada media VP dalam tabung dan diinkubasi selama 48 jam.
Pertumbuhan bakteri ditandai dengan warna media yang menjadi keruh, kemudian
ditambahkan ke dalam tabung Barrit's reagen, terdiri atas larutan KOH 40% dalam
akuades steril dan -napthol 5% dalam ethanol, yang bertindak sebagai katalis. Larutan
yang telah ditambah reagen kemudian dikocok perlahan tiap 3-5 menit dan diamati
adanya perubahan warna larutan dari kuning menjadi merah tua yang menunjukkan
adanya kandungan asetoin yang diproduksi oleh bakteri dalam larutan.
3.4. Kerangka Konsep
Sampel susu
Pengambilan dan pengumpulan sampel

Isolasi

Identifikasi


Positif negatif




Analisis Data Kesimpulan

3.5. Analisis Data
Kejadian mastitis akibat Staphylococcus aureus pada sapi perah di kec. Cendana, Kab.
Enrekang dikonfirmasi melalui identifikasi bakteri pada susu melalui pengujian labratorium dan
dianalisis secara deskriptif.



3