PROTOKOL PENELITIAN

Judul Penelitian : STUDI EFEK PEMBERIAN EKSTRAK CIPLUKAN

(Physalis angulata L.) TERHADAP JUMLAH SEL
ENDOTEL PEMBULUH DARAH AORTA pada TIKUS
(Rattus norvegicus) DM (Diabetes mellitus)

Pendahuluan
Diabetes Mellitus (DM) adalah penyakit yang sangat sering terjadi dan dapat
menyerang seluruh bagian tubuh manusia dimana angka kejadian dan penyebarannya
selalu meningkat di seluruh dunia (Scobei, 1998). Diabetes melitus lebih dikenal
dengan penyakit gula atau penyakit kencing manis adalah penyakit yang ditandai
dengan hiperglikemia puasa atau respons glukosa plasma yang melebihi batas yang
ditentukan selama uji toleransi glukosa oral (Stein, 1998).
Diabetes mellitus saat ini merupakan penyakit yang banyak dijumpai dengan
prevalensi diseluruh dunia mencapai angka 4% (Depkes, 2005). Pada tahun 1985
jumlah penderita dibetes mellitus hanya sekitar 30 juta jiwa namun pada tahun 2003,
angka penderita diabetes mellitus di seluruh dunia telah bertambah hingga mencapai
194 juta jiwa dan jumlah penderita penyakit ini terus meningkat dan diperkirakan
pada tahun 2030 akan mencapai 333 juta jiwa (Pdpersi, 2008).
Di Indonesia, diabetes mellitus adalah salah satu penyakit yang paling sering
diderita dan penyakit kronik yang serius. Setengah dari jumlah kasus diabetes
mellitus tidak terdiagnosa karena pada umumnya diabetes tidak disertai gejala sampai
terjadinya komplikasi.
Berdasarkan survey WHO (World Health Organization), Indonesia
menempati urutan ke-4 terbesar dalam jumlah penderita diabetes melitus dengan
prevalensi 8,6% (Depkes, 2005). Pada tahun 2020 diperkirakan angka kejadian
diabetes mellitus di Indonesia mencapai 8,2 juta penderita. Apabila diprosentasikan
berdasarkan jumlah penderita dengan jumlah penduduk, maka pada usia sebelum 20
tahun angka kejadian diabetes mellitus diperkirakan 0,19% dan diatas usia 20 tahun
diperkirakan mencapai 8,6%, sedang pada usia di atas 65 tahun 20,1 % (Wahyudi,
2009). Prevalensi penyakit diabetes mellitus terus meningkat karena terjadi
perubahan gaya hidup, kenaikan jumlah kalori yang dimakan, kurangnya aktifitas
fisik dan meningkatnya jumlah populasi manusia usia lanjut (Hiswani, 2008).
Berbagai komplikasi dapat diakibatkan oleh rendahnya kontrol diabetes.
Komplikasi tersebut antara lain berupa penyakit vaskular sistemik (percepatan
aterosklerosis), penyakit jantung, penyakit mikrovaskular pada mata sebagai
penyebab kebutaan dan degenerasi retina (retinopati diabetik), katarak, kerusakan
ginjal sebagai penyebab gagal ginjal serta kerusakan saraf tepi (neuropati diabetik)
(Halliwel, 1999). Luasnya komplikasi pada diabetes tampaknya berkorelasi dengan
konsentrasi glukosa darah sehingga glukosa berlebih diduga menjadi penyebab utama
kerusakan jaringan (Nobar, et al, 1999). Hal ini dapat disebabkan oleh kemampuan
hiperglikemia secara in vivo dalam modifikasi oksidatif berbagai substrat. Selain itu,
hiperglikemia juga terlibat dalam proses pembentukan radikal bebas (Droge, 2002).
Hiperglikemia menyebabkan auto oksidasi glukosa, glikasi protein, dan
aktivasi jalur metabolisme poliol yang mempercepat pembentukan senyawa oksigen
reaktif. Pembentukan senyawa oksigen reaktif tersebut dapat meningkatkan
modifikasi lipid, DNA, dan protein pada berbagai jaringan (Ueno, et al, 2002).
Modifikasi molekuler pada berbagai jaringan tersebut mengakibatkan
ketidakseimbangan antara antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan
produksi radikal bebas. Hal tersebut merupakan awal kerusakan oksidatif yang
dikenal sebagai stres oksidatif (Nuttal, et al,1999)
Peningkatan produksi radikal bebas menyebabkan jumlah sel endotel pada
pembuluh darah pasien penderita diabetes mellitus menurun. Penurunan fungsi sel
endotel dapat menyebabkan hilangnya vasodilatasi, dan mengarah pada
vasokontriksi, thrombosis, dan inflamasi (Douglas, 1998).
Endotel pembuluh darah berfungsi mengatur hemostasis vaskular dan
pengaturan, hal ini sangat penting untuk mempertahankan aliran darah dan aktifitas
anti trombotik. NO (Nitric oxide) yang dibentuk dari L-arginine melalui enzim NO
synthase yang menyebabkan relaksasi pembuluh darah dan berhubungan dengan
penghambatan adesi dan agregasi trombosit. Jika terjadi gangguan pembentukan NO
atau peningkatan degradasi NO, maka terjadi disfungsi endotel pembuluh darah
(anonymous, 2008).
Disfungsi endotel memiliki peran yang sangat penting dalam patogenesa
penyakit arteri. Penyakit arteri merupakan penyebab morbiditas (kerusakan jaringan
dan kecacatan) dan mortalitas (kematian) di dunia barat. Bentuk yang paling umum
dari penyakit ini adalah arteriosklerosis (McGeachie, 1998) dimana salah satu bentuk
dari arteiosklerosis adalah atherosclerosis yang bertanggung jawab terhadap
terjadinya sebagian besar penyakit kardiovaskuler (Smith, 2004).
Dalam proses pengobatannya, penderita diabetes mellitus tidak hanya dapat
dilakukan dengan medikamentosa saja namun juga dapat dilakukan dengan
pengobatan tradisional. Suatu kenyataan yang tidak dapat dipungkiri bahwa cara
pengobatan tradisional masih mendapat tempat di masyarakat awam dan juga pada
kalangan tertentu termasuk kalangan intelektual (Santoso, 1998). Dalam hal ini
peneliti menduga ciplukan (Physalis angulata L.) dapat dimanfaatkan sebagai salah
satu alternative terapi pada penderita diabetes mellitus
Ciplukan (Physalis angulata L.) adalah spesies tetraploid dan termasuk famili
Solanaceae (Azlan, 2008). Ciplukan adalah tumbuhan asli Amerika yang kini telah
tersebar secara luas di daerah tropis di dunia. Di Jawa tumbuhan tumbuh secara liar di
kebun, tegalan, tepi jalan, kebun, semak, hutan ringan, tepi hutan (Latifah, et al,
2009). Tanaman ini banyak dicari dan ditemukan oleh anak-anak pedesaan pada saat
musim panen palawija tiba. Biasanya pada saat musim panen kacang tanah. Begitu
kacang tanah dipanen (dicabut), yang tinggal hanyalah rumput-rumput yang tumbuh
di sela-sela kacang tanah, termasuk diantaranya pohon ceplukan (Anonymous, 2009)
Sejak lama, ciplukan sebenarnya telah diteliti oleh para ahli dari berbagai
negara. Penelitian tersebut biasanya terfokus pada aktivitas yang dimiliki oleh
ciplukan. Dari penelitian yang telah dilakukan, baik secara in vitro maupun in vivo,
didapatkan informasi bahwa ciplukan memiliki aktivitas sebagai antihiperglikemi,
antibakteri, antivirus, imunostimulan dan imunosupresan (imunomodulator),
antiinflamasi, antioksidan, dan sitotoksik (Latifah, et al, 2009).
Dari beberapa penelitian, didapatkan data bahwa ciplukan mengandung 13,
14-seco-16, 24-cyclosteroid, dengan jenis antara lain: Physalin B (Matsura, et al,
1970); 5,6 -epoxyphysalin B (Row, et al, 1978); withaphysalin A (Mulchandani, et
al, 1979); withaphysalin B (Kirson, et al, 1976; Glotter, et al, 1975); Physalin D
(Mohana, et al, 1979). Withaphysalin A dan withaphysalin B tergolong dalam
withanolides. Secara kimia, withanolides merupakan ergostan tipe steroids yang
teroksidasi secara alami, mempunyai lactone pada tepi rantai (side chain) dan 2-en-1-
one system pada cincin A. Withanolides terdapat pada semua bagian tanaman
golongan Solanaceae, namun presentasi terbesar terdapat pada bagian daun (Singh,
2002). Menurut penelitian lainnya, kandungan physalin pada tanaman physalis
angulata ini terbanyak terdapat pada kuncup bunga dan daunnya (Azlan, 2008).
Oleh karena physalin juga memiliki struktur steroid yang juga bisa berfungsi
sebagai antioksidan maka peneliti menduga bahwa pemberian ekstrak ciplukan
tehadap tikus diabetes mellitus akan dapat meningkatkan jumlah sel endotel pada
pembuluh darah tikus tersebut, dan diharapkan nantinya hasil dari penelitian ini dapat
dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif terapi pada penderita diabetes.

Rumusan Masalah
Apakah ekstrak ciplukan (Physalis angulata L.) mempunyai efek terhadap
jumlah endotel pembuluh darah pada tikus (Rattus norvegicus) DM (Diabetes
mellitus)?


Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak ciplukan (Physalis angulata L.)
dalam berbagai dosis mempunyai efek terhadap jumlah endotel pembuluh darah pada
tikus (Rattus norvegicus) DM (diabetes mellitus).

Tujuan khusus
1. Untuk mengetahui jumlah sel endotel pada pembuluh darah tikus (Rattus
norvegicus) dengan diabetes mellitus dalam berbagai dosis.
2. Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak ceplukan terhadap jumlah sel endotel
pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) DM (diabetes mellitus) dalam berbagai
dosis.
3. Untuk mengetahui dosis optimum ekstrak ceplukan (Physalis angulata L.)
terhadap jumlah sel endotel pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) DM
(diabetes mellitus).

Manfaat Penelitian
1. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah khasanah ilmu pengetahuan
mengenai bahan-bahan alami di lingkungan sekitar yang dapat dimanfaatkan
dalam dunia kedokteran.
2. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi sumbangan terhadap ilmu
pengetahuan tentang ciplukan (Physalis angulata L.) yang dapat digunakan
sebagai acuan untuk penelitian-penelitian selanjutnya
3. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan penejelasan secara ilmiah
mengenai efek ciplukan (Physalis angulata L.) sebagai alternatif terapi diabetes
mellitus.

Manfaat Klinis
Penelitian diharapkan menambah wawasan masyarakat umum mengenai
manfaat ceplukan (Physalis angulata L.) sebagai alternatif terapi diabetes mellitus.

Kerangka Konsep











Keterangan :
: Efek Inhibisi

Diabetes Mellitus
Ekstrak
ceplukan
Radikal bebas
meningkat
Memicu stress
oksidatif

Kerusakan Membran Sel,
Mitokondria, Protein, DNA

Kerusakan Struktur Histologis Dinding
Pembuluh Darah ( terutama Sel Endotel)

Kematian dan Lepasnya Sel Endotel dari
Dinding Pembuluh Darah

Pada diabetes mellitus akan terjadi keadaan ketidakseimbangan antara
antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan produksi radikal bebas. Pada
keadaan ini terjadi peningkatan radikal bebas dalam tubuh penderita. Apabila keadaan
ketidakseimbangan antara antioksidan protektif (pertahanan antioksidan) dan
produksi radikal bebas tersebut dibiarkan terus menerus akan mengarah kepada
keadaan stress oksidatif. Stres oksidatif tersebut akan menyebabkan terjadinya
kerusakan membran sel, mitokondria, protein, dan DNA. Hal ini menyebabkan
kerusakan struktur histologis dinding pembuluh darah yang menyebabkan kematian
dan lepasnya sel endotel dari dinding pembuluh darah.
. Dengan pemberian ekstrak ciplukan yang merupakan antioksidan diharapkan
dapat menurunkan radikal bebas dengan parameter yaitu meningkatnya jumlah sel
endotel dalam pembuluh darah penderita diabetes mellitus.

Hipotesis Penelitian
Pemberian Ekstrak Ciplukan dapat meningkatkan jumlah sel endotel
pembuluh darah pada tikus (Rattus Norvegicus) DM (Diabetes mellitus).

Rencana Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental di dalam laboratorium.
Ranacangan peneitian yang digunakan adalah Randomized Post Test Only Control
Group Design untuk mengetahui efek yang diinginkan dan setiap hewan coba
mempunyai probabilitas yang sama untuk mendapatkan perlakuan, sehingga dapat
menjaga validitas generalisasi ke populusi. Penelitian ini dilakukan untuk memenuhi
tujuan penelitian yaitu untuk mengetahui efek ekstrak daun ciplukan (Physalis
angulata l.) terhadap jumlah endotel pembuluh darah tikus (Rattus norvegicus) DM
(Diabetes mellitus). Pada rancangan ini, efek ekstrak daun ciplukan diamati setelah
pemberian ekstrak secara intragastric pada tikus DM. Pada penelitian ini sampel
dibagi menjadi 5 kelompok berbeda yang terdiri dari 1 kelompok kontrol dan 4
kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 4 ekor tikus.

Pemilihan Sampel
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus
norvegicus) strain Wistar, yang diperoleh dari Laboraturium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang, dengan ketentuan sebagai berikut:
a. Jenis kelamin jantan
b. Usia 2-3 bulan
c. Berat badan 250-400 gr
Tikus jenis ini dipilih sebagai sampel karena tikus putih (Rattus norvegicus)
strain Wistar karena tergolong jinak dan mudah perawatannya. Selain itu alasan tikus
putih sebagai hewan coba adalah sebagai berikut :
(Pagget and Barnes, 1971)
a. Ukurannya kecil
b. Memiliki sensitivitas yang tinggi terhadap obat
c. Lebih terstandarisasi dibandingkan dengan binatang percobaan lainnya
d. Dapat dibiakkan untuk menjaga keaslian dan keseragaman strain
e. Sangat kuat jika digunakan percobaan dengan pemberian anastesi
f. Tidak muntah karena memiliki pusat pengatur muntah
g. Tikus putih merupakan mamalia sehingga mirip dengan manusia

Estimasi Besar Sampel
Jumlah replikasi atau jumlah sampel (n) pada setiap perlakuan (p) dihitung
berdasarkan rumus sebagai berikut (Solimun, 2001):
p(n-1) 15
pn-p 15
5n-5 15
5n 20
n 4
Dari perhitungan didapatkan n 4, jadi jumlah sample tiap perlakuan minimal 4
ekor tikus (4 kali replikasi). Pada penelitian ini digunakan 4 ekor tikus atau 4 kali
replikasi untuk setiap control dan perlakuan.
Cara pengambilan sample untuk tiap kelompok dilakukan dengan metode
acak sederhana (simple random sampling) untuk mengurangi pengaruh dari variable
pengganggu (confounding). Besar sample dalam penelitian ini adalah sebanyak 20
ekor tikus yang dibagi dalam 5 kelompok, masing-masing 4 ekor tikus.

Lokasi dan Waktu Penelitian
Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakologi dan Laboraturium
Anatomi-Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
Waktu Penelitian
Pada penelitian ini perlakuan dan pengambilan organ dilakukan mulai bulan
oktober 2009 hingga bulan november 2009. Sedangkan pengamatan dan pengambilan
data dilakukan pada bulan desember 2009.

Bahan
Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus
norvegicus) strain Wistar, jenis kelamin jantan, berumur 2-3 bulan, berat badan 250-
400 gram, dengan kondisi umum sehat yang dapat ditandai dengan gerakan tikus
yang aktif. Tikus percobaan diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Hewan coba tersebut dipelihara dalam
kandang berukuran 20 cm x 30 cm x 40 cm dimana setiap kandang berisi 2 ekor
tikus.

Bahan untuk Pemeliharaan Hewan Coba
Makanan hewan coba adalah makanan ternak Confeed PAR-S dicampur
dengan terigu dan air serta diberi minum yang berasal dari PDAM.





Bahan untuk Perlakuan
a. Bahan Pembuat Tikus DM
Bahan yang digunakan untuk membuat tikus menjadi tikus diabet adalah
Streptozotosin yang dilarutkan dalam buffer sitrat 0,1 M dengan pH 4,5 yang
diinjeksikan secara intra peritoneum (IP) dengan kadar jumlah 60 mg/kgBB.
b. Bahan yang Diteliti
Bahan yang diteliti adalah daun ciplukan yang sebelumnya sudah dicuci dulu
kemudian dikeringkan dengan jalan mengangin-anginkanya di tempat yang teduh.
Setelah kering diblender dan diayak dengan ayakan B40 untuk mendapatkan
simplisia.

Bahan untuk Pengambilan Organ
Bahan yang digunakan untuk pengambilan organ adalah :
a. Eter
b. Formalin 10%

Bahan untuk Pembuatan Histopatologi Pembuluh Darah
Bahan untuk pembuatan sediaan histopatologi adalah :
a. Pembuluh darah tikus
b. Pewarna Hematoksilin Eosin (HE)
c. Alkohol absolute dan alcohol berbagai konsentrasi
d. Xilol
e. Parafin lunak
f. Parafin keras
g. Alkohol asam
h. Air
i. Entelan

Bahan untuk Perhitungan Jumlah Endotel Pembuluh Darah
Bahan yang digunakan untuk perhitungan jumlah endotel pembuluh darah
tikus DM adalah preparat pembuluh darah tikus yang telah dilakukan pengecatan
Hematoksilin Eosin (HE).

Alat untuk Pemeliharaan Hewan Coba
Alat yang digunakan dalam pemeliharaan hewan coba adalah:
a. Kandang Tikus
b. Tempat Makan Tikus
c. Tempat Minum tikus
d. Kawat kasa
e. Sekam

Alat untuk Pengukuran Berat Badan Hewan Coba
Untuk mengukur berat badan hewan coba, alat yang digunakan adalah Neraca
Ohaus.

Alat Pembuat Ekstrak Ciplukan
Alat yang dibutuhkan untuk membuat ekstrak ciplukan adalah :
a. Timbangan
b. Corong pengestrak
c. Etanol
d. Rotator evaporator
e. Oven

Alat Pemberian Ekstrak Ciplukan
Untuk pemberian ektrak ciplukan kepada tikus DM digunakan spuit yang
pada ujungnya dipasang sonde.

Alat Pembuat Tikus DM
Alat yang digunakan untuk membuat tikus menjadi tikus Diabet adalah :
a. Spruit
b. Kapas
c. Alkohol 70%

Alat Pengukur Kadar Gula Darah
Alat yang digunakan untuk mengukur kadar gula darah tikus adalah Alat
Pengukur Kadar Gula Digital dengan merk Optium Promega.

Alat Pengambilan Organ Hewan Coba
Alat yang digunakan dalam pengambilan organ hewan coba adalah :
a. Kotak Tertutup
b. Kapas yang dibasahi eter
c. Scapel
d. Gunting
e. Pinset
f. Tabung plastik sebagai tempat penyimpanan organ sementara

Alat untuk Pembuatan Sediaan Histopatologi
Alat yang digunakan untuk pembuatan sediaan histopatologis adalah :
a. Mikrotom Rotate
b. Object Glass dan Cover Glass
c. Automatic Tissue Processor
d. Pencetak Parafin

Alat untuk Perhitungan Jumlah Endotel
Alat yang digunakan untuk menghitung jumlah endotel pembuluh darah tikus
DM adalah :
a. Mikroskop Elektrik Binokular jenis Labhopot
b. Mikroskop Olympus Photo Slide BX51 dengan kamera Olympus DP71 12 Megapixel

Variabel Penelitian
Variabel Tergantung
- Jumlah endotel pembuluh darah tikus DM

Variabel Bebas
- Ekstrak daun ceplukan tiga dosis. Skala yang digunakan adalah skala nominal.

Variabel Kendali
- Jenis Kelamin Tikus : Jantan
- Umur tikus : 2-3 bulan
- Berat Badan Tikus : 250-400 gr
- Waktu Pengujian : Lama pemberian ekstrak ciplukan
- Faktor lingkungan laboraturium
- Diet

Definisi Operasional
Tikus DM
Pada tikus percobaan disuntikkan Streptozotosin yang dilarutkan dalam buffer
sitrat 0,1 M dengan pH 4,5 secara intra paritoneum (IP). Setelah itu, setiap 3 hari
diukur kadar gula darahnya dengan alat pengukur gula darah digital. Setelah tikus
dapat dikatagorikan mengalami diabet (kadar gula darah 300mg/dl) maka dapat
segera diberikan ekstrak ceplukan.




Ekstrak daun ciplukan berbagai dosis
Ciplukan yang digunakan adalah daun ceplukan yang didapat dari kota Batu
yang telah disertifikasi oleh Materia Medika Batu, yang diekstraksi dengan pelarut
etanol absolut memakai alat ekstraktor sokhlet dan dibagi menjadi 3 dosis

Jumlah Endotel Pembuluh Darah
Jumlah endotel pembuluh darah adalah jumlah endotel yang dihitung pada 10
lapang pandang dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400x (lensa okuler 10,
dan lensa obyektif 40). Sel yang dihitung adalah sel endotel yang menempel sebagian
ataupun seluruhnya pada dinding pembuluh darah.

Cara Kerja
Aklimatisasi
Aklimatisasi hewan coba dilakukan pada kandang dalam laboratorium
Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang selama 7 (tujuh)
hari.

Pembagian Kelompok Hewan Coba
Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok yaitu 1 (satu) kelompok kontrol dan
4 (empat) kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 4 (empat) ekor tikus
dengan rincian sebagai berikut:
- Kelompok 1 : Tikus tidak DM dan tanpa pemberian ekstrak daun
ciplukan (Kelompok Kontrol).
- Kelompok 2 : Tikus DM tanpa pemberian ekstrak daun ciplukan selama
1 bulan
- Kelompok 3 : Tikus DM + pemberian ekstrak daun ciplukan dosis 1
(500mg/kgBB)
- Kelompok 4 : Tikus DM + pemberian ekstrak daun ciplukan dosis 2
(1500mg/kgBB)
- Kelompok 5 : Tikus DM + pemberian ekstrak daun ciplukan dosis 3
(2500mg/kgBB)

Prosedur Pembuatan Tikus yang DM
1. Tikus yang telah dipersiapkan, diukur berat badan dan diukur kadar gula darah
sewaktu.
2. Tikus diinjeksikan dengan Streptozotosin (STZ) 60mg/KgBB intra peritoneal (IP).
Dilakukan perawatan tikus dan pemberian makanan seperti biasa. Kandang dan air
minum diganti setiap harinya.
3. 1 x 24 jam setelah injeksi STZ, diberikan injeksi insulin 1 unit secara intra peritoneal
pada beberapa tikus selama 1 minggu untuk pengadaptasiannya.
4. 2 x 24 jam setelah injeksi STZ, diukur kadar gula darah sewaktu . Tikus dinyatakan
positif DM jika kadar gula darah 300mg/dl.
5. Setelah tikus dapat beradaptasi (1 minggu) injeksi insulin diberikan .



Prosedur Pengukuran Kadar Gula Darah Tikus
Untuk mengukur kadar gula darah dari tikus dilakukan secara pengukuran
gula darah sewaktu dengan cara mengambil darah dari ekor tikus kemudian darah
tersebut diletakkan pada stick yang dihubungkan dengan alat pengukur gula darah
digital lalu tunggu beberapa saat hingga muncul hasilnya pada layar alat.

Ekstraksi daun ciplukan
Untuk mendapatkan ekstrak kasar daun ciplukan dilakukan proses ekstraksi.
Proses ekstraksi tersebut adalah sebagai berikut:
1. Simplisia (bubuk kering) ciplukan yang telah ditimbang beratnya, dibungkus dengan
kertas saring dan dimasukkan dalam corong pengekstrak.
2. Simplisia ciplukan direndam dengan pelarut etanol untuk mengeluarkan senyawa-
senyawa yang terkandung dalam daun ceplukan. Perendaman dengan larutan etanol
dilakukan minimal sehari semalam. Larutan hasil rendaman disisihkan dan simplisia
dapat direndam kembali dengan pelarut etanol yang baru. Pekerjaan ini dilakukan
berulang-ulang sampai didapatkan larutan yang cukup atau sampai larutan bewarna
jernih.
3. Larutan hasil rendaman ditampung dan dibiarkan mengendap. Endapan dipisahkan
dari larutan yang tidak mengendap.
4. Larutan yang tidak mengendap ditampung dan dikeringkan dengan rotary evaporator
pada suhu 70-80
o
C hingga diperoleh ekstrak kental.
5. Ekstrak kental dioven pada suhu 70
o
C untuk menghilangkan pelarut etanol yang
tersisa.

Pemberian Ekstrak Daun Ciplukan
Pemberian ciplukan secara intragastric dengan menggunakan spuit yang pada
ujungnya dipasang sonde yang dapat dimasukkan melalui mulut sampai ke lambung
tikus.

Prosedur Pengambilan Organ Pembuluh Darah Tikus
Tikus yang akan dibedah, dianastesi terlebih dahulu dengan cara dimasukkan
ke dalam kotak tertutup yang didalamnya terdapat kapas yang telah dibasahi larutan
eter. Tikus dibiarkan lemas, kemudian dibedah dan diambil pembuluh darahnya
sepanjang 2 cm. Potongan ini kemudian di fiksasi dalam larutan formalin 10%
untuk kemudian dibuat sediaan histopatologis dengan pengecatan HE.

Pembuatan preparat histopatologi
Pembuatan preparat histopatologi dilakukan di laboratorium Anatomi-
Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dengan metode iris
yang kemudian dilakukan pengecatan Hematoksilin-Eosin (HE).
1. Dilakukan pencucian dengan aquadest untuk menghilangkan bahan fiksasi
2. Dilakukan dehidrasi untuk mengangkat air dari jaringan dengan merendam pada
alkohol bertingkat, yaitu pada konsentrasi 70%, 80%, 85%, 90%, 96% masing-
masing selama 1 jam. Setelah itu direndam dengan alkohol absolute selama 2x1 jam
3. Dilakukan clearing (penerawangan) untuk memisahkan alcohol dari jaringan dengan
xilol 3 kali selama 1 jam.
4. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin lunak pada suhu 42-46
o
C, 2 kali selama 1 jam.
5. Dilakukan blocking selama 1 jam dengan menggunakan paraffin keras pada suhu 46-
52
o
C.
6. Dilakukan pemotongan blok paraffin menggunakan mikrotom rotate
7. Hasil sayatan blok paraffin diletakkan pada air dengan suhu 35
o
C dan dibubuhi
gelatin secukupnya kemudian dipasang pada kaca obyek.
8. Dilakukan deparafinisasi untuk memisahkan paraffin dari jaringan yaitu dengan
perendaman xilol 3 kali selama 5 menit , kemudian pada alcohol bertingkat dengan
urutan 80%, 85%, 90%, 96%, alcohol absolute, dan air mengalir masing-masing
selama 3 menit.
9. Dilakukan pengecatan Hematoksilin-Eosin dengan prosedur :
a. Pemberian hematoksilin selama 10 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir
selama 5 menit.
b. Deparafinasi pada alkohol asam selam 3-10 detik, kemudian dicuci dengan air
mengalir hingga warnanya menjadi biru
c. Sediaan dimasukkan ke dalam larutan eosin selama 3-5 menit, kemudian dicuci
dengan air mengalir selama 5 menit.
d. Dilakukan dehidrasi dengan lakohol bertingkat dengan konsentrasi 70%, 85%, 95%,
dan alkohol absolute masing-masing selama 5 menit.
e. Pemberian Xilol selama 2 x 5 menit.
f. Mounting menggunakan entelan kemudian dipasang deck glass.


Prosedur Penghitungan Jumlah Endotel
Jumlah endotel yang dihitung pada 10 lapang pandang dengan menggunakan
mikroskop perbesaran 400x (lensa okuler 10, dan lensa obyektif 40). Sel yang
dihitung adalah sel endotel yang menempel sebagian ataupun seluruhnya pada
dinding pembuluh darah. Hasil pada 10 lapang pandang tersebut kemudian di rata-
rata.

Alur Penelitian













Keterangan : DM = Diabetes Mellitus
EC = Ekstak Ciplukan
20 ekor tikus strain wistar
Randomisasi tikus ke dalam 5 kelompok
Perlakuan 3
DM (+)
EC (+)dosis 2
(1500mg/kgBB)
Perlakuan 4
DM (+)
EC (+) dosis3
(2500mg/kgBB)
Perlakuan 2
DM (+)
EC (+) dosis 1
(500mg/kgBB)
Kontrol
DM (-)
EC (-)
Perlakuan 1
DM (+)
EC (-)
Tikus Dianastesi
Pembuluh Darah diambil 2cm
Dibuat sediaan Histoptologis
Penghitungan sel Endotel pembuluh darah
Hasil
Analisis Data dan Kesimpulan
Analisis Data
Data yang diperoleh sesuai dengan pembagian kelompok dianalisa
menggunakan :
1. Uji Homogenitas varian dan Distribusi normal
Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah data yang telah diperoleh
memenuhi syarat untuk uji ANOVA.
2. Uji statistik dengan metode one-way ANOVA (analisa varian satu arah)
Bertujuan untuk menilai apakah terdapat perbedaan yang bermakna dalam
jumlah endotel antara kelompok Kontrol dengan kelompok Perlakuan.
3. Analisis Post-Hoct LSD
Bertujuan untuk menilai apakah terdapat perbedaan yang bermakna dari hasil
tes ANOVA.
4. Uji korelasi Pearson
Bertujuan untuk menilai apakah terdapat hubungn yang nyata antara
perbedaan dosis dengan jumlah endotel pembuluh darah tikus.
Seluruh proses analisa dilakukan dengan menggunakan program SPSS 12,0
for Windows pada taraf kepercayaan 95% (=0,05).