Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN SECARA GRAM




Disusun untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Mikrobiologi Lanjut
yang dibina oleh Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M. Pd
dan Dr. Endang Suarsini, M. Ked


Oleh:
Kelompok 3 / Kelas D
1. Dwida Maghfiroh (140341807365)
2. Intan Rezki Kurniasari (140341807180)
3. Martin Artiyono Pratama (140341807409)
4. W F Edi Hanzen (140341807914)
5. YuliaVenicreataDipu (140341807164)




The Learning University




UNIVERSITAS NEGERI MALANG
FAKULTAS PASCASARJANA
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
SEPTEMBER 2014
A. TOPIK
Pewarnaan Gram

B. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa memperoleh keterampilan
pewarnaan bakteri secara gram dan dapat menemukan sifat gram dari bakteri yang
diperiksa (mampu mengidentifikasi bakteri biakan berdasarkan sifat pewarnaan)

C. WAKTU PELAKSANAAN
Kamis. 11 September 2014. Mikrobiologi ruang BIO 305, Gedung Biologi Universitas
Negeri Malang

D. DASAR TEORI
Mikroba adalah prokariot dengan dinding sel yang terdiri dari struktur khusus
yang disebut dengan peptidoglikan. Hampir semua sel prokariot mempunyai dinding sel
kecuali mikoplasma. Dinding ini umumnya memberi kekuatan pada sel. Dinding sel
pada bakteri tidak sekaku seperti peluru baja, tetapi tipis dan lentur seperti bungkus
kulit bola kaki (Darkuni, 2001). Dinding sel inilah yang akan dijadikan indikator dan
penentu pada pewarnaan Gram.
Perbedaan tebal tipisnya struktur peptidoglikan menentukan mekanisme yang
spesifik terhadap penyerapan zat warna. Sifat ini dipergunakan untuk membantu
identifikasi suatu bakteri, sehingga dikenal adanya bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif (Darkuni, 2001).
Teknik pewarnaan gram pertama kali diuraikan dalam suatu publikasi pada
tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi Denmark, Christian Gram. Dia
mengembangkan prosedur pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk
memperlihatkan bakteri pneumokokus pada jaringan paru-paru pasien yang mati karena
pneumonia. Pewarnaan Gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Terutama amat berarti di laboratorium
diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang
diwarnai dengan pewarnaan gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan
organisme penyebab suatu infeksi (Pelczar & Chan, 2005).
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan differensial yang membedakan bakteri
dalam dua kelompok yaitu bakteri Gram positif yang mengikat warna. Pada proses ini
olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan ungu kristal, yodium, alkohol
(bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Sifat
untuk diwarnai ungu tua atau tidak dengan metode pewarnaaan yang diperkenalkan
Gram (1884) merupakan ciri taksonomi penting yang juga menunjukkan korelasi
dengan sifat-sifat lain dari bakteri. Menurut Hastuti (2012), prosedur pewarnaan gram
dimulai dengan mewarnai sel bakteri yang sudah difiksasi dengan pewarna basa kristal
violet, kemudian diteruskan dengan memperlakukan dengan iodium. Iodium dengan
kristal violet membentuk lak yang tidak larut air, tapi agak larut dalam alkohol atau
aseton. Sel-sel ini kemudian diberi alkohol atau dengan kata lain didiferensiasi. Sel-sel
yang gram positif akan mempertahankan kompleks iodium zat warna dan tetap
berwarna biru, sedangkan sel-sel gram negatif akan kehilangan warnanya oleh alkohol.
Sel-sel yang kehilangan warnanya ini kemudian diwarnai lagi dengan pewarna kontras
(fukhsin) agar nampak.
Dalam Dwidjoseputro (2005) juga disebutkan bahwa bila zat warna pertama
terhapus sehingga yang nampak adalah zat warna asli (ungu), maka sediaan ini disebut
dengan gram positif. Sedangkan bila zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat
warna asli tidak tampak, maka sediaan ini dinamakan dengan gram negatif. Ciri khas
inilah yang digunakan dalam penggolongan bakteri. Pewarnaan dinding bakteri dengan
pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi dua yaitu:
1. Bakteri gram positif
Gram positif ini apabila dilakukan pewarnaan, maka akan terlihat berwarna
ungu. Pada bakteri gram positif, kompleks dari kristal violet yodium (KV-1) tetap
tertangkap dalam dinding sel setelah perlakuan dengan etanol. Hal ini disebabkan
oleh pori-pori pada lapisan peptidoglikans mengecil. Pengecilan pori-pori ini terjadi
karena rendahnya kandungan lipid pada dinding sel bakteri gram positif sehingga
pada saat penambahan alkohol terjadi dehidrasi. Dengan demikian KV-1 tetap
terikat dan sel berwarna ungu (Darkuni, 2001). Selain itu, pada bakteri gram positif
juga ditemukan adanya senyawa Mg-ribonukleat yang akan bereaksi dengan kristal
violet sehingga zat warna ini tidak mudah dilarutkan oleh larutan pemucat.

2. Bakteri gram negatif.
Sel-sel gram negatif terlihat berwarna merah setelah dilakukan pewarnaan.
Berbeda halnya dengan bakteri gram positif, pada bakteri gram negatif kandungan
peptidoglikannya lebih rendah, tetapi kandungan lipidnya tinggi. Kandungan lipid
yang cukup tinggi ini dapat menyebabkan pembesaran lubang pori-pori dan
meningkatkan permeabilitas zat warna pada saat pencucian. Pori-pori pada
peptidoglikan bakteri ini cukup besar sehingga setelah perlakuan dengan etanol
kompleks KV-1 lepas (tidak terikat) dan sel akan mengikat zat warna kedua
(Darkuni, 2001). Selain itu, dalam bakteri gram negatif ini juga tidak ditemukan
adanya senyawa Mg-ribonukleat yang dapat bereaksi dengan kristal-violet.
Akibatnya kristal-violet mudah larut oleh larutan pemucat.

E. ALAT DAN BAHAN
Alat:
- mikroskop - kaca benda
- mangkok pewarna - kawat penyangga
- pipet - pinset
- lampu sepritus - botol penyemprot

Bahan:
- Akuades steril
- Biakan murni bakteri umur 1x24
jam
- Larutan amonoium oksalat kristal
violet
- Kertas penghisap
- Korek api
- Alkohol 70%
- Lisol
- Alkohol 95%
- Sabun cuci
- Larutan safranin
- Larutan iodium

F. PROSEDUR KERJA
Menyediakan kaca benda bersih, memanaskan di atas nyala api spiritus, kemudian
membiarkan dingin dengan cara meletakkannya di atas kawat penyangga

Meneteskan aquades steril 1 kolong jarum inokulasi diatas kaca benda tersebut

Mengambil Secara aseptik bakteri dari biakan murni, kemudian meletakkan pada
Kaca benda dan meratakan secara perlahan menggunakan ujung kawat inokulasi

Mengeringkan sendiri sediaan bakteri, hal ini berarti kita telah membuat sediaan
bakteri secara olesan kering udara

Melakukan fiksasi dengan panas, caranya dengan melewatkan sediaan api
di atas api spiritus.

Meletakan sedian diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkok pewarna, lalu
meneteskan larutan amonium oksalat kristal violet selama 1 menit.

Membuang kelebihan zat warna tersebut kedalam mankok dan membilas dengan air
kran yang mengalir perlahan, kemudiaan mengringkan dengan menekan kertas hisap

Meneteskan larutan iodium diatas sedian , menunggu selama 2 menit

Membuang larutan iodium tersebut kedalam mankok dan membilas dengan air kran

Meneteskan alkohol 95% diatas sediaan,membiarkan selama 1 menit

membuang sisa alkohol tersebut kedalam mankok dan membilas dengan air kran

Mengenangi sediaan dengan pewarna safranin selama 30 detik. Membilas dengan
air kran sampai tidak tampak lagi adanya warna di dalam air bilasan,

Mengeringkan sedian secara hati-hati dengan kertas hisap




Mengamati sediaan yang telah kering di bawah lensa mikroskop, mula-mula dengan
menggunakan pembesaran lemah, kemudiaan melanjutkan pembesaran kuat 1000x
dengan memberikan minyak emersi di atas sediaan.

G. DATA HASIL PENGAMATAN
Berdasarkan pengamatan praktikum mikrobiologi tentang pewarnaan gram sel
bakteri pada tanggal 11 September 2014, maka hasil pengamatan adalah:



















Tabel data hasil pengamatan pewarnaan bakteri secara gram.
Koloni Warna Sel Bentuk Sel Keterangan
1 Merah Streptobasil Gram negatif
2 Ungu Stafilococcus Gram positif


Koloni 1
Koloni 2
Gambar 1. Medium lempeng yang telah
ditumbuhi mikroorganisme
H. ANALISIS DATA
Praktikum pewarnaan bakteri secara gram bertujuan agar kita terampil dalam
pewarnaan bakteri secara gram untuk menentukan sifat gram suatu bakteri. Bakteri yang
diberi pewarnaan secara gram sudah terlebih dahulu kami kembangbiakan dengan
menggunakan medium lempeng NA. Bakteri tesebut berasal dari depan gedung Biologi
05 FMIPA UM. Langkah pertama dalam pewarnaan sel bakteri adalah pemberian
aquades steril yang bertujuan sebagai tempat inokulum bakteri pada kaca benda.
Kemudian setelah dilakukan inokulasi, kaca sediaan di fiksasi dengan tujuan untuk
melekatkan bakteri pada kaca benda tanpa mengubah struktur morfologi sel bakteri.
Langkah selanjutnya adalah pemberian larutan amonium oksalat kristal violet pada
sediaan dan didiamkan selama 1 menit. Larutan amonium oksalat kristal violet
merupakan reagen pewarna utama yang akan memberikan warna pada sel bakteri.
Pendiaman sediaan selama 1 menit bertujuan agar sel bakteri dapat menyerap warna
secara sempurna. Langkah selanjutnya adalah pemberian larutan iodium yang
didiamkan selama 2 menit, pemberian larutan ini bertujuan untuk memperkuat
penyerapan sel bakteri terhadap larutan amonium oksalat kristal violet. Langkah
selanjutnya adalah pemberian alkohol 95% yang bertujuan untuk melunturkan larutan
amonium oksalat kristal violet yang terlalu tebal. Langkah terakhir adalah pemberian
larutan sfranin sebagai larutan penutup yang bertujuan untuk memberikan hasil
pewarnaan yang kontras pada sel-sel yang tidak menghisap zat warna utama.
Setelah dilakukan pewarnaan terhadap sediaan, selanjutnya sediaan diamati di
bawah mikroskop. Berdasarkan data yang diperoleh, koloni 1 berbentuk streptobasil
yang ditunjukkan dengan bentuk bantang yang berkoloni seperti rantai. Pada saat
pewarnaan, koloni 1 menunjukkan warna merah. Hal ini berarti bahwa bakteri koloni 1
termasuk bakteri gram negatif, karena tidak mempertahankan warna dasar dari
pewarnaan larutan amonium oksalat kristal violet setelah dilakukan pemberian alkohol
95% dan berwarna merah setelah diberi safranin. Pada koloni 2 berbentuk stafilococcus
yang ditunjukkan dengan bentuk bulat yang berkoloni menyerupai bentuk anggur. Pada
saat pewarnaan, koloni 2 menunjukkan warna ungu. Hal ini berarti bahwa bakteri koloni
2 termasuk bakteri gram positif karena sel bakteri dapat mempertahankan warna dasar
dari pewarnaan larutan amonium oksalat kristal violet setelah dilakukan pemberian
alkohol 95% dan tidak berwarna merah setelah diberi safranin.
I. PEMBAHASAN
Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 m.
Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral (Pelczar &
Chan, 2005). Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat
pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran (Fardiaz, 1992).
Pada pewarnaan Gram ada 4 larutan yang digunakan, yaitu larutan Ammonium
Oksalat Kristal violet, alkohol 95%, larutan Safranin, dan larutan Iodium. Larutan
Ammonium Oksalat Kristal Violet berfungsi sebagai pewarna utama. Alkohol 95%
berfungsi sebagai peluntur warna. Larutan Safranin berfungsi sebagai pewarna sekunder
atau penambah warna, dan larutan iodium berfungsi untuk mempertajam atau
mempertegas warna (Juliantina, 2012).
Setelah dilakukan pewarnaan secara gram pada sel bakteri koloni 1 dan koloni 2
yang berasal dari depan gedung Biologi, nampak bahwa pada koloni 1 sel bakteri
berwarna merah dan koloni 2 sel bakteri berwarna ungu. Hal ini membuktikan bahwa
koloni 1 merupakan bakteri gram negatif dan koloni 2 merupakan bakteri gram positif.
Data yang diperoleh sesuai dengan pernyataan Dwidjoseputro (2005) bahwa bila zat
warna pertama terhapus sehingga yang nampak adalah zat warna asli (ungu), maka
sediaan ini disebut dengan gram positif. Sedangkan bila zat warna tambahan (merah)
bertahan hingga zat warna asli tidak tampak, maka sediaan ini dinamakan dengan gram
negatif. Ciri khas inilah yang digunakan dalam penggolongan bakteri. Perbedaan respon
terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri menurut Pelczar & Chan (2005)
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi
dan dinding selnya tipis.
Hadioetomo (1993) menyatakan bahwa perbedaan reaksi pewarnaan Gram
berdasarkan komposisi dinding sel bakteri. Dinding sel bakteri gram negatif terdiri dari
5-20% peptidoglikan, selebihnya adalah polisakarida, sedangkan dinding sel bakteri
gram positif mengandung 90% peptidoglikan selebihnya adalah asam teikoat. Sel
bakteri gram positif terlihat berwarna ungu karena dapat membentuk ikatan komplek
dengan pewarna pertama yaitu komplek ungu Ammonium Oksalat Kristal Violet. Pada
bakteri gram positif setelah pelunturan warna dengan alcohol maka sel akan mengalami
dehidrasi sehingga terjadi pengerutan pori-pori yang mengakibatkan permeabilitas turun
dengan demikian kompleks kristal violet dan iodium tidak dapat keluar dari sel. Oleh
karena itu bakteri tetap berwarna ungu, ketika diberi zat pewarna safranin.
Hasil pewarnaan gram yang menunjukkan dinding sel bakteri berwarna merah
disebabkan karena kandungan peptidoglikan pada dinding selnya lebih rendah, tetapi
kandungan lipidnya tinggi. Pada saat pencucian dengan alkohol 95% dengan kandungan
lipid yang cukup tinggi ini, akan menyebabkan lipid yang terlarut juga banyak sehingga
terjadi pembesaran lubang pori pada lapisan peptidoglikan dan akhirnya meningkatkan
permeabilitas terhadap zat warna. Setelah itu kompleks amonium oksalat kristal violet
yodium lepas dalam hal ini terlarut oleh pencucian dengan alkohol 95%, sehingga sel
akan mengikat zat warna kedua, dalam hal ini safranin. Hal tersebut sesuai dengan
Tarigan (1988) bahwa selama perlakuan dengan alkohol ternyata lemak tersebut tertarik
keluar sehingga memperbanyak porositas atau menaikkan permeabilitas dinding sel. Hal
ini mengakibatkan kompleks kristal violet yodium tertarik keluar, sehingga bakteri
kehilangan warna. Pada bakteri gram negatif kandungan jumlah peptidoglikannya lebih
sedikit, pori-pori dinding selnya cukup besar meskipun sudah diberi perlakuan dicuci
dengan etanol, dan kompleks kristal violet yodium ikut tercuci. Karena itulah bakteri
gram negatif kehilangan warna tersebut dan menyerap zat warna selanjutnya yaitu
safranin, sehingga sel bakteri berwarna merah.
Lebih lanjut dinyatakan oleh Hadioetomo (1993) bahwa sel-sel gram negatif
mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid umumnya
larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid oleh pemucat yang digunakan diduga
memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan
pada sel-sel gram negatif berlangsung lebih cepat. Kemungkinan lain bahwa dalam
bakteri koloni 1 tidak ditemukan adanya senyawa Mg-ribonukleat yang dapat bereaksi
dengan amonium oksalat kristal-violet, sehingga amonium oksalat kristal-violet mudah
larut oleh safranin. Hal ini seperti yang dijelaskan oleh Darkuni (2001) bahwa pada
bakteri gram negatif tidak ditemukan adanya senyawa Mg-ribonukleat.
Berdasarkan teori diatas, dapat disimpulkan bahwa bakteri dikatakan bersifat
Gram positif atau bersifat Gram negatif, dikarenakan larutan pewarnaan yang
menembus melalui dinding sel. Pada bakteri Gram positif, setelah pelunturan warna
dengan alkohol, sel mengalami dehidrasi. menyebabkan terjadinya pengerutan pori-pori
sehingga permeabilitas turun dan kompleks kristal violet-iodium tidak dapat keluar dari
sel. Sedangkan pada bakteri Gram negatif setelah pelunturan warna dengan alkohol,
lemak dikeluarkan dari dinding sel menyebabkan porositas meningkat, sehingga
kompleks kristal violet-iodium keluar dari sel.

J. DISKUSI
1. Apakah fungsi fiksasi dalam pewarnaan gram?
Jawab: Proses fiksasi dilakukan agar bakteri benar-benar melekat pada kaca benda
sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian.
2. Apakah fungsi larutan iodium dalam pewarnaan gram?
Jawab: larutan iodium berfungsi sebagai larutan mordan, yaitu untuk
mempertegas/mempertajam warna dalam pewarnaan gram.

3. Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan gram antara bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif? Jelaskan proses kimiawi dalam proses pewarnaan
secara gram!
Jawab: Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri terjadi
karena adanya perbedaan yang didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel
bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung
lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol,
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding
sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu.

K. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum ini dapat disimpulkan bahwa:
Pewarnaan bakteri dapat dilakukan dengan cara pewarnaan gram. Bakteri gram negatif
pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan
menghasilkan warna ungu. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram
pada bakteri terjadi karena adanya perbedaan yang didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Berdasarkan hasil pengamatan koloni 1 merupakan bakteri gram negatif dan koloni 2
merupakan bakteri gram positif.

L. DAFTAR PUSTAKA
Darkuni, M. Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi, dan Mikologi).
Malang: Universitas Negeri Malang.
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Imagraph.
Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Gramedia Pustaka
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta.: Gramedia.
Hastuti, Utami Sri. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Malang: UMM Press.
Juliantina, Farida. 2012. Manfaat Sirih Merah (Piper Crocatum) Sebagai Agen Anti
Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. JKKI Jurnal
Kedokteran dan Kesehatan Indonesia. (Online),
(http://journal.uii.ac.id/index.php/jkki/article/view/543/467, diakses 15 September
2014).
Pelczar, Michael J dan Chan, E.C.S. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:
Universitas Indonesia Press.
Tarigan, Jeneng. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Depdikbud Dirjen Pendidikan
Tinggi P2LPTK