Microbiolog

Microbiolog

a.M
a.M

todos R
todos R

pidos
pidos
ATP - Bioluminiscencia
BC
Aplicaciones Anal
Aplicaciones Anal

ticas, s.l.
ticas, s.l.
ATP. Bioluminiscencia
ATP. Bioluminiscencia

Introduccin

Tecnologa

Aplicaciones
Introducci
Introducci

n
n

La microbiologa tradicional
emplea varios das para obtener
resultados

Se necesitan unos 10,000,000 de
clulas para poder visualizar una
colonia
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n

Empleando la Bioluminiscencia
en condiciones idneas slo
necesitamos unas:
-1000 bacterias
-100 levaduras

La sensibilidad final depende del
tipo de matriz o producto (*)
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n

En que consiste?

Mtodo indirecto

Detecta la presencia de los
microorganismos mediante el
anlisis de su
ATP
ATP intracelular
ATP
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n

El ATP en una molcula universal
idntica para todos los seres vivos

El contenido de ATP vara entre los
distintos microorganismos

Es posible diferenciarlos mediante
bioluminiscencia?

No, pero........
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n

Cmo funciona?

Mediante una reaccin enzimtica

Utiliza una enzima de las
lucirnagas Photinus pyralis:
Luciferasa
Luciferasa

Un sustrato:
D
D
-
-
Luciferina
Luciferina

Para obtener
Luz
Luz a partir del ATP
y medirla en un luminmetro
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n
Lucirnaga Photinus pyralis
Luciferasa recombinante
Sustrato D- Luciferina
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n
ATP
D-Luciferina
Luciferasa
O
2
, Mg
2+
LUZ
Oxyluciferina
PPi CO
2
AMP
Reaccin enzimtica 100% rendimiento
1 molcula de ATP = 1 fotn
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n

Pero hay un problema ........

Todas las clulas vivas contienen ATP
- Clulas Somticas
- Microorganismos
- ATP libre o extracelular
ATP. Introducci
ATP. Introducci

n
n

Tres fuentes de ATP
qumicamente idntico

La cuestin es que en microbiologa
la mayora de veces slo nos
interesa medir el ATP microbiano

La solucin ...........
Tecnolog
Tecnolog

a. Reactivos
a. Reactivos

Proceso combinado para ....

Eliminar selectivamente el ATP
no microbiano

Posteriormente analizar el ATP
microbiano

Emplea hasta tres reactivos en
funcin del tipo de muestra

Aplicados en un orden
preestablecido
Tecnolog
Tecnolog

a. Reactivos (1)
a. Reactivos (1)

Para extraer el ATP somtico sin afectar
las clulas microbianas

Se trata la muestra con productos
tenso-activos (extractantes) que actan
selectivamente sobre las membranas de
las clulas somticas

Pero el ATP sigue en la muestra como ATP
libre......
Tecnolog
Tecnolog

a. Reactivos (2)
a. Reactivos (2)

Para eliminar el ATP libre o extracelular

ATP-asa (Apirasa de patata ) cuya
actividad enzimtica se adapta a cada
matriz o tipo de productos

Incubacin de unos 15 min.

Incubacin combinada con los
extractantes para clulas somticas
Tecnolog
Tecnolog

a. Reactivos (3)
a. Reactivos (3)

Para extraer el ATP de las clulas
microbianas

Extractantes clsicos: Tris-EDTA, TCA,
DMSO ......(diluir la muestra)

En fase homognea: Mezclas de detergentes
(amplio espectro )

Extractantes rpidos:
Exprimir frente a permeabilizar para evitar la
competencia de las ATP-asas endgenas
Tecnolog
Tecnolog

a. Reactivos
a. Reactivos

Para valorar el ATP

Luciferina-luciferasa (Tris-buffer)

Liofilizados o lquidos estabilizados

Sensibilidad:
- CLS: 10
-15
mol/L
- HS : 10
-17
mol/L

Estabilidad: hasta 7 das para liofilizados
reconstituidos y un ao para reactivos
lquidos
Tecnolog
Tecnolog

a. Sensibilidad (*)
a. Sensibilidad (*)

La sensibilidad final depende del tipo de
matriz o producto

Reaccin enzimtica con emisin de luz

Condiciones idneas = solucin acuosa

Quenching (to quench = mitigar, apagar)

Factores contrarios:Turbidez, color, pH
extremo, determinadas sustancias.....

Necesitaremos ms ATP o ms
microorganismos para poder detectar
Tecnolog
Tecnolog

a. Sensibilidad
a. Sensibilidad

En los Kits todo est bajo control

Validacin interna previa

Ensayos de inoculacin

Determinar el % de quenching es muy
sencillo (diluciones seriadas)

Disponemos de mejores patrones de ATP
(lquidos y estables en nevera 2-8 C )
Tecnolog
Tecnolog

a.
a.
Lumin
Lumin

metros
metros

Para medir la luz emitida en la reaccin
se emplean los luminmetros

Equipos dotados con detectores
extremadamente sensibles:
-Foto-multiplicadores
-Foto-diodos de estado slido

Convierten los quantums de luz en
pulsos elctricos
Tecnolog
Tecnolog

a.
a.
Lumin
Lumin

metros
metros

Integran la seal (pulsos) durante un
perodo de tiempo establecido

Expresan los resultados como
URL
URL
(Unidades Relativas Luz)

Relativas porque cada fabricante
calibra sus equipos en funcin de las
caractersticas constructivas ( detector,
electrnica asociada,etc...)
Tecnolog
Tecnolog

a.
a.
Lumin
Lumin

metros
metros

Tipos de Luminmetros:
- Tubo o cubeta
- Micro-placa
- Porttiles
- Especiales (para dispositivos integrados de
control de higiene)

Con inyectores de reactivos: 2, 3 y 4
unidades (jeringa o fuelle)
Tecnolog
Tecnolog

a.
a.
Lumin
Lumin

metros
metros
Tecnolog
Tecnolog

a.
a.
Lumin
Lumin

metros
metros
Tecnolog
Tecnolog

a. Automatizaci
a. Automatizaci

n
n

Para automatizar esta tecnologa
disponemos de:
- Extractantes rpidos: 5 seg./muestra
- Los Robots Toma-muestras: Capaces de
procesar 600 muestras /hora y de
dispensar reactivos auxiliares (ATP-asa)
- Luminmetros de Micro-placa: Capaces
de analizar entre 400 -700 tests/hora
- Equipos transfer
Tecnolog
Tecnolog

a. Automatizaci
a. Automatizaci

n
n
Equipo transfer
Tecnolog
Tecnolog

a. Automatizaci
a. Automatizaci

n
n
Tecnolog
Tecnolog

a. Automatizaci
a. Automatizaci

n
n
Tecnolog
Tecnolog

a. Automatizaci
a. Automatizaci

n
n
Aplicaciones
Aplicaciones

Control Microbiolgico de
producto final

Control de Higiene en
Superficies

Aplicaciones especiales
Aplicaciones. Control Higiene
Aplicaciones. Control Higiene

Medida del
ATP TOTAL
ATP TOTAL como
indicador de una limpieza incorrecta

Permite la accin correctiva de
inmediato (resultados en segundos)

Integrable en el CPC

Valores de decisin (pasa o falla)

Luminmetros porttiles

Dispositivos integrados
Aplicaciones. Control Higiene
Aplicaciones. Control Higiene
Aplicaciones. Producto Final
Aplicaciones. Producto Final

Medida del
ATP Microbiano
ATP Microbiano como
indicador de la presencia o ausencia de
microorganismos en nuestros productos

Control de esterilidad alimentario: Leche
UHT, zumos, refrescos, bebidas, etc....

Productos cosmticos, de aseo personal,
y detergentes

Bio-burden en productos farmacuticos
Tipo de producto Kits
Anlisis
directo
Filtracin
de
membrana
Incubacin
directa del
envase
Incubacin
previa en
caldo de
cultivo
Productos
cosmticos y
detergentes
Kit +
Aplicaciones
Si
en caldo
?
No 24- 48 h.
Bio-burden en
productos
farmacuticos
Kit +
Aplicaciones
Si
en caldo
?
No 24- 48 h
Productos de aseo
personal
Kit +
Aplicaciones
Si
en caldo
?
No 24- 48 h
Refrescos y
bebidas Kit Si Si
?
No
Zumos UHT con
alto contenido en
pulpa
Kit Si No 2- 3 das No
Zumos UHT con
bajo contenido en
pulpa
Kit Si No 2- 3 das No
Aplicaciones. Resumen (I)
Aplicaciones. Resumen (I)
Tipo de producto Kits
Anlisis
directo
Filtracin
de
membrana
Incubacin
directa del
envase
Incubacin
previa en
caldo
Leche UHT,
esterilizada, de
soja, etc...
Kit
Si No
2- 3 das
No
Postres lcteos
termizados
Kit
Dilucin
(?) No
2- 3 das
No
Mezclas zumos
y leche UHT
Kit
Si No
2- 3 das
No
Control de
Superficies
Kits y
Dispositivos Si No No No
Aguas de
aclarado
Kits y
Dispositivos
Si
Si
Sensibilidad No No
Biomasa total Kit
Si
?
No No
Nuevos
productos
Validacin
? ? ? ?
Aplicaciones. Resumen (II)
Aplicaciones. Resumen (II)
FIN
FIN
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