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CONTROLES DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE ANLISIS DE LA CALIDAD TCNICA DE
SEMILLAS


G. Garca Visglerio
1
, H. Algar Castro
1
y M. Barrera lvarez-Murias
1


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Laboratorio de Produccin y Sanidad Vegetal, Consejera de Agricultura y Pesca de la Junta de Andaluca, Ctra de Utrera
km. 1. 41013 Sevilla, Espaa. E-mails: gregorio.garcia@juntadeandalucia.es, herminia.algar.ext@juntadeandalucia.es y
macarena.barrera@juntadeandalucia.es


REA TEMTICA. REQUISITOS TCNICOS


RESUMEN. Se exponen algunos de los mtodos para el
control de calidad en ensayos de semillas. El control de
calidad con muestras ciegas en ensayos de pureza, de
determinacin de otras especies en nmero y en ensayos de
germinacin con la metodologa y criterios para la
evaluacin de la precisin con valores de tolerancia ISTA.
En los ensayos para la determinacin de otras especies se
evala tambin la exactitud con muestras preparadas y para
ello se dan igualmente los criterios de evaluacin.
Otro control de calidad para comprobar el funcionamiento
correcto de la tcnica en los ensayos de germinacin se
realiza mediante muestras testigos de buena o elevada
germinacin. Para considerar vlidos los ensayos
realizados, la muestra testigo tiene que dar como mnimo
un valor de germinacin que depende del porcentaje de
germinacin de la muestra de la cual procede.
Tambin se hace referencia a los ejercicios de
intercomparacin y sus criterios de evaluacin y a los
controles peridicos a los sustratos utilizados en los
ensayos de germinacin, capacidad de retencin de agua,
conductividad, pH y limpieza y toxicidad.

PALABRAS CLAVE. Muestras ciegas, precisin,
exactitud, familias de especies.



1.- Introduccin

El Laboratorio de Produccin y Sanidad Vegetal de
Sevilla perteneciente a la Consejera de Agricultura y Pesca
de la Junta de Andaluca est acreditado por ENAC en
ensayos de semillas de pureza especfica, determinacin de
otras especies en nmero y germinacin.
Entre los controles de calidad que se llevan a cabo en el
laboratorio en cumplimiento de nuestro sistema de calidad,
exponemos los que consideramos ms interesantes porque
pueden servir de gua o de aplicacin directa en otros
laboratorios que realicen tareas similares.


2.- Controles de calidad de los ensayos del laboratorio
de semillas

Los controles de calidad son tcnicas empleadas para
asegurar la fiabilidad de los resultados emitidos por el
laboratorio.
Para el control de calidad de los ensayos se establecen las
siguientes familias de especies: cereales, leguminosas
pequeas, leguminosas de grano, otros cultivos agrcolas y
hortcolas. En los controles de calidad con muestras ciegas
y en los ejercicios de intercomparacin se irn rotando
especies de cada familia para cubrir todo el alcance.
Los principales ensayos que se realizan a las semillas son:
pureza especfica, germinacin y otras semillas en nmero
(conteo).

2.1 Muestras ciegas

2.1.1 Definicin

Son muestras ciegas las utilizada en las analticas con el
nico fin de evaluar el trabajo de los analistas sin que estos
tengan constancia de ello, es decir, muestras que no puedan
ser relacionadas por los analistas evaluados con ninguna
otra muestra del laboratorio.

2.1.2 Objeto

El objetivo de las muestras ciegas es comprobar que cada
analista del laboratorio realiza sus anlisis de conteo,
pureza y germinacin con resultados cuyos desvos se
deban nicamente al azar y no al sesgo del propio analista.
Para ello se evaluar la precisin en los ensayos anteriores
y adems la exactitud en el ensayo de conteo por ser el
nico en el cual se puede preparar una muestra de
referencia con valor exacto del nmero de semillas de otras
especies.

2.1.3 Realizacin

-Los controles de calidad con muestras ciegas abarcar el
mayor nmero de especies posibles de las que se pueda
disponer de semilla suficiente en el laboratorio y adems en
el caso de germinacin se variarn en cada evaluacin la
temperatura y el sustrato utilizados, de manera que todos y
cada uno de los analistas autorizados evale a lo largo del
tiempo, diferentes especies y en germinacin hagan
tambin ensayos a diferentes temperaturas y con diferentes
sustratos.
-La periodicidad de los controles con muestras ciegas ser
de al menos uno semestral. Se irn rotando especies de
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cada familia de forma que en un periodo de tres aos se
haya cubierto todo el alcance.
-Para evaluar la precisin se tomar una muestra de las
conservadas en el laboratorio se preparar una muestra a
partir de ellas de modo que se obtenga una muestra
definida como ciega para que sea analizada al menos por
dos analistas. Normalmente se compararn los resultados
de cada dos analistas entre s para ver su compatibilidad. Si
se parte de una muestra analizada anteriormente se podr
estudiar tambin la compatibilidad del resultado del
anlisis oficial de la muestra y los resultados de los
analistas. Adems en el caso de la germinacin se podrn
evaluar simultneamente tres y hasta cuatro analistas. Para
evaluar la precisin (para germinacin, pureza y conteo) se
utilizarn las Tablas ISTA de tolerancias. As se aplicar la
Tabla 3C (captulo 3 ISTA) para comparar los porcentajes
de semilla pura obtenidos por dos analistas y, si procede,
los de cada uno de stos con el porcentaje de semilla pura
del resultado oficial de la muestra. Para decidir que los
ensayos son precisos su diferencia deber ser menor o igual
que la tolerancia de la Tabla anterior. Para conteo se
utilizar la Tabla 4A (captulo 4 ISTA) para comparar el
nmero de otras semillas encontradas por cada uno de los
dos analistas y, si procede, con el nmero de otras semillas
encontradas en el anlisis oficial. Del mismo modo para
comparar los porcentajes de plntulas normales en ensayos
de Germinacin se aplicar la Tabla 5C Parte 1 (captulo 5
ISTA); para comparar al mismo tiempo los porcentajes de
plntulas normales obtenidos por tres analistas (o de dos
analistas y el del anlisis oficial) se aplicar la Tabla 5D
parte 1 (captulo 5 ISTA) y para evaluar al mismo tiempo
los resultados de cuatro analistas (o de tres analistas y el
del anlisis oficial) se aplicar la Tabla 5E parte 1 (captulo
5 ISTA). Como se resume en el cuadro siguiente.

Tabla 1. Criterios de evaluacin
Ensayo Parmetro Valor
Pureza
especfica
Precisin
Tolerancia Tabla 3 C.
Captulo 3 ISTA
Conteo Precisin Tolerancia Tabla 4 A. Captulo 4 ISTA
Germinacin
Precisin
2 analistas
3 analistas
4 analistas
Tolerancia Tabla 5 C Parte 1.
Tolerancia Tabla 5 D Parte 1
Tolerancia Tabla 5 E Parte 1.
Captulo 5 ISTA

-Para la evaluacin de la exactitud en el anlisis de conteo
se preparar una muestra de referencia con semilla pura de
una especie cultivada perteneciente a una de las familias de
especies a la que se aadirn un nmero concreto de otras
semillas de especies determinadas. La preparacin la
realizar el responsable tcnico o la persona por l
designada. Se comparan los resultados de otras semillas
encontradas por cada analista con el nmero real y exacto
de otras semillas incorporadas a la muestra. Para decidir
sobre la exactitud la diferencia entre el resultado del
analista y el valor real de la muestra ser igual o inferior a
1/2 (redondeados a la baja) del valor de tolerancia de Tabla
4B.
Tabla 2. Criterios de evaluacin
Ensayo Parmetro Valor
Conteo Exactitud
Tolerancia (Tabla 4B.
capitulo 4 ISTA)

Tambin se evaluar si el analista ha acertado en la
identificacin de la otras semillas al menos a nivel de
gnero para que el responsable tcnico considere si el
resultado es correcto, adems de exacto o no, o es necesaria
una nueva cualificacin del analista o simplemente aclarar
un resultado dudoso.
-Se realizar un informe de supervisin de ensayo de la
evaluacin de los controles que refleje los resultados de
cada una de las evaluaciones y el valor concreto de
tolerancia utilizado en cada caso.

2.2 Ejercicios de intercomparacin

Su finalidad es la de contrastar los resultados con otros
laboratorios. Se llevarn a cabo con una periodicidad anual
y en un periodo de aproximadamente 4 aos se cubrir
todas las familias de especies.
Tras la recepcin del informe enviado por el organizador,
el responsable tcnico evaluar los resultados obtenidos y
las diferencias con el resto de los laboratorios participantes.
Por regla general, el criterio de evaluacin ser una de
loas siguientes opciones:
-Se acepta el criterio de evaluacin definido por el
organizador.
-Se adoptar un criterio propio teniendo en cuenta:
1. Tipo de muestra (documentos normativos,
caractersticas del material, etc...).
2. Valores de Z-score:

Z < 2: resultado satisfactorio.
2 Z 3: resultado cuestionable
Z >3: resultado no satisfactorio

2.3 Muestras testigos en el ensayo de germinacin

Las nuevas adquisiciones de medios de crecimiento de
lotes diferentes deben cumplir los requerimientos para las
principales caractersticas fsicas y estar libre de efectos
negativos debido a sustancias txicas y microorganismos
nocivos.
Las caractersticas de composicin, retencin de agua,
pH, limpieza e inocuidad (libre de efectos fitotxicos y
efectos negativos debidos a microorganismos) se deben
comprobar. Ejemplos de los mtodos usados para medir
estas caractersticas se dan en el ISTA Handbook on
Seedling Evaluation. Los ensayos de control de calidad
pueden ser realizados por el laboratorio de ensayos de
semillas o por laboratorios especializados en suelos o
ensayos microbiolgicos.
Para comprobar el correcto funcionamiento de la tcnica
se utilizar una muestra testigo por cada especie ensayada
en cada cabina de germinacin con objeto de medir la
precisin de los ensayos de germinacin que se estn
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realizando en la cabina. Para ello se elegir una muestra de
alta germinacin (igual o mayor de 90%) de las que se
conservan en la cmara de conservacin como material de
referencia de la especie. De ella se elegirn al azar y se
pondrn a germinar una muestra de 100 semillas. Para
considerar vlidos los ensayos de la especie en cuestin
realizados en la cabina, el valor de germinacin de la
muestra testigo de 100 semillas deber ser como mnimo el
que corresponde en la Tabla 3 al % de germinacin del
material de referencia. Cuando no se disponga de semillas
de alta germinacin de una especie, se utilizar como
testigo, bien semillas de la misma especie ensayada de
buena germinacin (de 80% a 89%), o bien, semillas de
alta germinacin de otras especies de caractersticas
parecidas y mtodos de germinacin similares a la especie
ensayada. Cuando se ensayan simultneamente y en la
misma cabina varias especies del mismo gnero e incluso
de la misma familia botnica, por idntico mtodo de
germinacin, se podr utilizar para todas ellas un nico
testigo, de una de las especies ensayadas, de alta
germinacin ( 90%) o, en su caso, de buena germinacin
(de 80 % a 89 %).
En cualquier caso, si el testigo da un valor inferior al
mnimo se abrir un trabajo no conforme y segn los
resultados obtenidos en los ensayos realizados en la cabina
con ese testigo y la informacin recabada, el responsable
tcnico tomar una decisin sobre los ensayos y el testigo.

Tabla 3. Control de calidad para el ensayo de germinacin
% germinacin del material de
referencia
Mnimo % de germinacin del
testigo
90 87
91 88
92 89
93 90
94 91
95 92
96 94
97 95
98 96
99 97
100 99
Mnimo % de germinacin del testigo: menor valor dentro del intervalo de
confianza al 95% que para 400 semillas y el porcentaje de germinacin del
material de referencia se establece en la Tabla G9 (pgina 652; de
Miles,(1963)).
Cuando se utilizan materiales de referencia de buena germinacin (igual o
superior a 80 % e inferior a 90%) y de acuerdo con la Tabla citada, Tabla
G9, el testigo deber dar como mnimo un valor de germinacin 4 puntos
inferior al valor de germinacin del material original que tomamos como
referencia.

3.- Controles de calidad de los sutratos utilizados en el
ensayo de germinacin

Los sustratos que se utilizan en los ensayos de
germinacin teniendo como material base, papel, arena o
medio de crecimiento orgnico deben someterse a controles
peridicos para verificar su idoneidad.
3.1 Capacidad de retencin de agua

Estos controles se llevarn a cabo para calcular la mxima
cantidad de agua que debemos aadir al medio de
crecimiento.
El principio general es el de medir la mxima cantidad de
agua retenida por el sustrato y expresarla como un
porcentaje de peso seco del propio sustrato.
Todas la pesadas se harn con una cifra decimal.
Los pasos a seguir son los siguientes: (todas las medidas
de pesos se expresan en gramos).
-Calcular la humedad del sustrato (H): (expresada en tanto
por uno).
1. Poner la estufa a 130 C.
2. Desecar la cpsula durante 5 minutos en la estufa a
130 C, colocar con precaucin en el desecador hasta que
alcance al temperatura ambiente y luego pesar (P
0
) .
3. Tarar la balanza y posteriormente pesar
aproximadamente 5 gramos de sustrato (P1).
4. Colocar la cpsula con el sustrato en la estufa a 130 C
durante 1 hora.
5. Pasar al desecador con precaucin hasta que adquiera
la temperatura ambiente y pesar (P2).
La humedad expresada en tanto po uno ser:

H = (P
1
P
2
+ P
0
) / P
1
(1)

-Clculo de la capacidad de campo:
1. En un recipiente que tenga drenaje (maceta), se coloca
en la base un filtro que permita drenar el exceso de agua y
evite la prdida de sustrato. Colocar en la balanza y pesar
(M
0
).
2. Tarar la balanza con el recipiente en el plato y pesar
una cantidad determinada de sustrato (M
1
) .
3. Retirar de la balanza y aadir agua hasta saturar el
sustrato. Dejar drenar el exceso de agua de 12 a 24 horas,
tomando medidas para evitar la evaporacin (es decir,
taparlo). En este nivel, la humedad del sustrato es la
Capacidad de Campo.
4. Quitar la tapadera al recipiente, colocar en la balanza y
pesar (M
2
).
La cantidad de agua presente en el sustrato antes de
saturarlo es (H
2
O)
s
:

(H
2
O)
s
= M
1
x H (2)

El extracto seco del sustrato usado es (ES)
S
:

(ES)
S
= M
1
- (H
2
O)
s
(3)

La cantidad de agua presente en el sustrato en la
capacidad de campo es (H
2
O)
FC
:

(H
2
O)
FC
= M
2
M
0
M
1
+ (H
2
O)
s
(4)

La mxima cantidad de agua contenida en el sustrato
expresada como porcentaje de su peso seco es (H
2
O)
MAX
:

(H
2
O)
MAX
= [(H
2
O)
FC
/ (ES)
S
] x 100 (5)

Se realiza tres veces este proceso con muestras al azar. La
media de las medidas se tomar como valor de referencia.
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3.2 pH del sustrato

El pH del sustrato debe estar entre 6.0 y 7.5. La medida se
har con un pH-metro calibrado.
Para medir el pH en arena o medio de crecimiento
orgnico se coge 1 volumen de ste (mnimo 5 ml) y se
mezclan con 5 volmenes de agua de la que se va a utilizar
en el ensayo de germinacin. La mezcla se agita durante 5
minutos y se deja reposar un mnimo de 2 horas y un
mximo de 24 horas. Despus se vuelve a agitar y se mide
el pH de la suspensin de la disolucin.
En papel el pH se mide sobre la superficie del papel una
vez que este est humedecido con el agua que se va a
utilizar en el ensayo de germinacin. El pH se mide por
contacto.
Se debe medir el pH en tres puntos aleatorios de la hoja
de papel. Estas medidas no debe diferir en ms de 0.5
unidades de pH. Se hace la media de las medidas y se
comprueba con las especificaciones.
Este control se llevar a cabo cuando se cambie el lote de
sustrato utilizado.

3.3 Conductividad

La conductividad debe ser menor de 40 mS/m (400
S/cm).
Para el papel, arena o medio de crecimiento orgnico, se
toman 20 gramos y se mezclan con 100 ml de agua, de la
que se utiliza para el ensayo de germinacin, a 20C 1C.
Despus de mezclar se deja durante 30 minutos antes de
filtrar a travs de papel de filtro.
La conductividad del filtrado se mide con un
conductmento debidamente calibrado.
Por cada lote se realizarn medidas a tres muestras
aleatorias. Si la diferencia entre repeticiones es mayor que
5 mS/m (50 S/cm) el lote debe ser rechazado.
La media de las medidas se utiliza para comprobar el
cumplimiento de las especificaciones.
Este control se llevar a cabo cuando se cambie el lote de
sustrato utilizado.

3.4 Limpieza y toxicidad

El proveedor debe garantizar que el material cumple las
caractersticas anteriores y adems el medio de
crecimiento debe estar libre de semillas, hongos, bacterias
o sustancias txicas que puedan interferir en la germinacin
de las semillas, el crecimiento de las plntulas o su
evaluacin.
Para verificar la limpieza e inocuidad del medio de
crecimiento se puede seguir alguna de las tcnicas
siguientes:
Se llevar a cabo un ensayo de germinacin con 400
semillas en el sustrato que se quiere comprobar y otro igual
en el sustrato de referencia (un medio de ensayo aceptado),
comprobando mediante un test de aceptacin si los
ensayos son compatibles (Tabla 5 C, parte 1 del captulo 5
de las Reglas ISTA). Las especies, muy sensibles a las
sustancias txicas, utilizadas en estos ensayos son entre
otras: Festuca rubra, Hordeum vulgare y Phleum pratense.
Los ensayos se evalan en un estado temprano, es decir,
en la fecha especificada para el primer conteo en la Tabla
5A de las Reglas ISTA o en una fecha anterior.
Se debe tener en cuenta adems la existencia de plntulas
con sntomas debido a sustancias txicas y las semillas no
germinadas, asi como sntomas especficos que pueden ser
races pequeas, o elevadas sobre el sustrato, pelos
radiculares agrupados, hipocotilo corto y grueso, y en
Poaceae tambin coleptilos aplastados y reducidos. En el
caso del papel a cada lote nuevo se le realizar un control
de ausencia de hongos. Para ello se humedece el papel y se
envuelve en una bolsa de plstico, que se introduce en una
cmara de germinacin (la temperatura puede estar entre 20
y 30 C), durante al menos 5 das y un mximo de 14.


Bibliografa

International Rules For Seed Testing. ISTA. Edition 2.011.
ISTA Handbook on Seedling Evaluation. Third Edition 2.006.
Handbook of tolerances and of measures of precision for seed testing.
(Proc. Int. Seed Test Association volume 28 (1963) n 3).Miles (1963).
Norma UNE-EN ISO/IEC 17025. Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y calibracin.