Anda di halaman 1dari 19

MAKALAH BIOLA

SOUTHERN BLOTTING


DISUSUN OLEH KELOMPOK II

Nama :
1. M. KASPAR MARUF 11. NYIMAS DESTI
2. M.GHAJALI 12. NOVITA COMIATI
3. MULYADI ANCAS 13. SAKDIAH
4. NOVIAN SUTAMI 14. RINCE
5. DIANTI PUTRI 15. ANA
6. WINDA FITRIANA 16. ERIZA SATIVA
7. SITI HARTATIK 17. FAUZIA IRIANI
8. MARIA SYAMSU 18. YURINA GERHANA
9. FITRA WAHYUNI 19. CHRISTIANI SIREGAR
10. TERESIA DEBORA 20. DIAH AGUSTIN


FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN KIMIA UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2014
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
Southern blotting merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah
secara elektroforesis dari gel ke membran. Metode ini diambil dari nama penemunya
yaitu Edward M. Southern (1975). Prinsipnya adalah kapilaritas, dimana bufer yang
merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke
membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka
fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran yang digunakan pada
proses southern blotting adalah membran nitroselulosa atau nilon. Metode ini
digunakan untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel
DNA dan untuk menentukan gen tertentu yang diisolasi dari suatu organisme terdapat
dalam bentuk yang sama dengan yang organisme lainnya.
Salah satu penelitian yang menggunakan teknik Southern blotting ini adalah
penelitian mengenai spesies Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL)
dan Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL). Fusarium oxysporum F.sp.
lycopersici (FOL) merupakan jamur patogen yang dapat menginfeksi bagian akar
atau pangkal batang tanaman. Gejala layu fusarium tampak pada bagian atas tanaman.
Penyakit tular tanah umumnya sulit dikendalikan karena memiliki kisaran inang yang
luas dan dapat bertahan hidup dalam tanah dengan waktu yang lama, serta gejala awal
sulit diidentifikasi, akibatnya penyakit sering dapat diketahui ketika serangan sudah
lanjut. Spesies ini telah dibedakan dengan melihat morfologinya menggunakan media
selektif. Walaupun dengan cara yang demikian tidak efektif namun untuk
mengidentifikasi jenis patogen dari fusarium oxysporum dengan melihat ciri-ciri
morfologinya menggunakan media selektif.
Selain dengan cara melihat morfologi untuk mengidentifikasi spesies dan sub
spesies. Tim peneliti sebelumnya telah menggunakan immonoassays untuk
mengidentifikasi spesies dan subspesies pada jamur. Beberapa teknik yang telah
digunakan meliputi amplified fragment length polymorphisms (AFLP), random
amplified polymorphic DNA (RAPD), restriction fragment length polymorphisms
(RFLP) dan direct amplification of length polymorphism.
Tim peneliti sebelumnya juga telah melakukan isolasi DNA dengan
menggunakan probe IGS untuk mengisolasi Fusarium oxysporum f. sp. radicis-
lycopersici (FORL) dan Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) yang
diperlakukan dengan cara yang berbeda untuk mengevaluasi dampak dari tiga
perlakuan DNA. Telah didapatkan lebih dari 95% kesamaan dari ketiga jamur
tersebut. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan menggunakan pra-elektroforesis
pada hasil analisis hibridisasi southern blot menggunakan digoksigenin (DIG) -IGS
fragmen yang merupakan probe dari PCR.

2.2 Rumusan Masalah
1. Apa yang dimaksud dengan teknik Southern Blot dan prinsip dari teknik
tersebut
2. Bagaimana penerapan teknik Southern Blot dalam sebuah penelitian
3. Bagaimana cara kerja dari teknik Southern Blot

2.3 Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini antara lain sebagai berikut :
1. Untuk mengetahui teori tentang teknik Southern Blot dan prinsip teknik
tersebut
2. Untuk mengetahui penerapan teknik Southern Blot dalam sebuah penelitian
3. Untuk mengetahui cara kerja dari teknik Southern Blot





BAB II
ISI

2.1 Metode Southern Blotting
Blot Southern merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah
secara elektroforesis dari gel ke membran. Blot Southern merupakan sebuah metode
yang sering digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk menguji keberadaan
dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA. Metode ini ditemukan oleh
seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang
mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh. Metode ini
mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan
ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan
hibridisasi dengan probe. Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen
DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe). DNA dipisahkan terlebih dahulu
dengan elektroforesis. Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita DNA untuk
mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang diinginkan. Blot Southern
mendeteksi DNA rantai tunggal dengan menggunakan DNA sebagai pelacak. Selain
Blot Southern, metode lain yang mirip dan dikembangkan dari Blot Southern adalah
Blot Western, Blot Northern, dan Blot Southwestern yang memiliki prinsip yang
sama, namun molekul yang akan dideteksi dan pelacak yang digunakan berbeda.
Kegunaan dari Blot Southern adalah untuk menganalisis keberadaan mutan yang ada
pada suatu organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang menjadi mutan pada
organisme tersebut.

2.2 Prinsip Southern Blot
Prinsipnya adalah kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak
diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran. Karena muatan
DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan
menempel (blot) pada membran. Membran yang digunakan pada proses blot southern
adalah membran nitroselulosa.
Tahap awal dari metode Blot Southern adalah pendigestian DNA dengan
enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih
kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran dengan elektroforesis agarosa.
Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, tahap
ini disebut dengan tahap blotting. Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas
dari gel agarosa. Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum, membran
diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk
memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer berlangsung
dengan memanfaatkan daya kapilaritas. setelah DNA ditransfer ke gel, membran
nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60
o
C-100
o
C) kemudian membran diberi
radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan
membran. Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel
radioaktif, tetapi dapat juga digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar.
Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan
dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA
yang ada pada membran. Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci
dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di
membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada film X-ray
melalui autoradiografi.








Gambar 1. Prinsip kerja southern bolt

2.3 Persiapan DNA untuk Southern Blot
1. Persiapan DNA Genom
Teknik yang digunakan untuk mempersiapkan DNA untuk southern blotting
tergantung pada jenis DNA yang sedang diteliti. Pengggunaan DNA genom, adalah
untuk mendapatkan molekul yang tidak terpecah-pecah secara ekstensif oleh
pergeseran selama proses ekstraksi, sehingga spesifik pembatasan fragmen dari 20 kb
lebih dapat diperoleh. Sel harus dibuka dengan kondisi yang gentle. Untuk sel-sel
kultur jaringan dan sampel darah, dilakukan inkubasi dalam buffer yang mengandung
detergen seperti sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk mengganggu membrane sel dan
melepaskan DNA. Bakteri yang dikelilingi oleh dinding sel, dibuka dengan
kombinasi lysozyme dan EDTA. Lysozym adalah enzim yang mendegradasi
beberapa senyawa polimer yang ada pada dinding sel bakteri, EDTA diperlukan
integritas dari struktur polimer.
Setelah dinding sel berhasil dipecah, dilanjutkan dengan proses ekstraksi
DNA genom dengan menghapus biokimia lain selain DNA genom dalam ekstrak
awal. Protease seperti proteinase K dimasukan ke dalam buffer untuk merusak sel,
memulai degradasi protein pada ekstrak, tetapi deproteinisasi dilakukan secara rutin
oleh ekstraksi fenol. Penambahan fenol atau campuran 1 : 1 antara fenol dan
kloroform mengakibatkan presipitasi protein. Setelah sentrifugasi, presipitasi protein
bermigrasi antarmuka antara fasa organik dan fasa air, sedangkan asam nukleat tetap
dalam fasa air.
2. Persiapan DNA plasmid atau bakteriofage
Teknik yang digunakan bertujuan untuk memperoleh DNA plasmid atau
bakteriofage dari bakteri klon. DNA plasmid dapat diperoleh dari beberapa teknik
yang mengeksploitasi perbedaan fisik antara plasmid dan DNA genom bakteri.
Plasmid menjadi molekul supercoiled dibandingkan DNA genom setelah gangguan
sel, hadir sebagai fragmen lama, fragmen linier. Sebuah metode yang popular
melibatkan treatment dari ekstrak sel dan alkali, dimana presipitasi DNA linier
meninggalkan plasmid supercoiled dalam larutan.

3. Teknik Blotting DNA
Setelah pemurnian DNA dengan salah satu atau lebih pembatasan
endonuklease yang merupakan fraksinasi dari elektroforesis agarose gel dan gel
kemudian diakukan pretreatment sebelum southern blot. Tujuan dari pretreatment ini
ada 2. Pertama, diharapkan untuk memecah molekul DNA dalam individual bands
gel menjadi fragmen yang lebih kecil, karena ragmmen yang lebih kecil mentransfer
lebih cepat daripada yang lebih besar. Hal ini dilalukan dengan merendam gel dalam
0,25 mol/L HCl selama 30 menit yang mengakibatkan jumlah pemurnian kecil
pembelahan ikatan -N-glycosidic antara basis purin (adenine atau guanine) dan
komponen gula nukleotida yang diikuti dengan pembusukan struktur gula dan
kerusakan rantai polinukleotida. Kedua, dengan menggunakan larutan alkali yang
mendenaturasi untai ganda molekul DNA oleh adanya kerusakan ikatan hydrogen,
molekul menjadi beruntai tunggal. Hal ini membantu untuk transfer dan mengikat
dengan membran, dan juga memastikan bahwa setelah mengikat memasangkan
komponen basa polinukleotida siap untuk hibridisasi dengan probe.
Jika sebuah membran nitrocellulose digunakan kemudian pretreatment alkali
diikuti dengan netralisasi gel oleh perendaman dalam buffer Tris-garam, langkah ini
menjadi penting karena DNA tidak terikat dengan nitrocellulose pada pH lebih besar
dari 9,0. Southern blot kemudian di set up, seperti gambar 1 dengan buffer transfer
high-salt, dengan formulasi 20 x SSC dimana 3,0 mol/L NaCl (garam) dan 0,3
mol/L natrium sitrat. Buffer yang sama jug dapat digunakan untuk transfer membran
nilon tetapi dengan nilon bermuatan positif sebuah buffer transfer alkali (0,4 mol/L
NaOH) digunakan karena telah dijelaskan sebelumnya hasil diperoleh dalam lampiran
kovalen dari transfer DNA kepada membran. Dengan tipe transfer tersebut,
pretreatment alkali tidak diperlukan. Blot kemudian dibiarkan sekitar 18 jam untuk
transfer high-salt, atau 2 jam untuk blot alkali.
Setelah blotting, transfer dibuka dan membran dibilas dalam 2 x SSC dan di
keringkan. Jika noda telah terbentuk pada nitrocellulose atau mebran tidak bermuatan
nilon, dan DNA secara longgar terikat dengan membran pada tahap ini. Kebanyakan
immobilasi permanen harus dilakukan oleh baking pada 80
o
C selama 2 jam dimana
hasilnya tidak dalam kovalen, tetapi semipermanen lampiran dari DNA menjadi
membrane nitrocellulose, atau radiasi UV yang mengakibatkan lampiran kovalen
menjadi membran nilon.
4. DNA / Hibridisasi DNA
Analisis hibridisasi didasarkan pada prinsip bahwa dua polinukleotida akan
membentuk hibida yang stabil dengan pasangan basa jika urutan nukleotida
seluruhnya atau sebagian komplementer. Sebuah fragmen pembatasan tertentu dalam
Southern blot,dapat dideteksi jika membran diperiksa dengan kedua molekul DNA
berlabelyang sama. Urutan fragmen yang sedang dicari, akan diperiksa jenis probe
hibridisasi yang dapat digunakan kemudian. Awalnya kita akan survei metodologi
yang digunakan untuk analisis hibridisasi.
5. Prehybridization dari Southern blot
Analisis hibridisasi dilakukan dengan merendam Southern blot dalam buffer yang
mengandung hibridisasi Probe, biasanya dalam sebuah tabung yang terus-menerus
diputar sehingga semua bagian dari membran yang terkena probe, atau alternatif
dalam kantong plastik tertutup yang ditempatkan pada pengocok. Hibridisasi
dilakukan dalam dua tahap.Pertama, membran prehybridized dalam larutan dirancang
untuk memblokir DNA yang tidak terpakai pada permukaan membran yang
mengikat.jika langkah ini diabaikan maka probe akan mengikat nonspesifik ke
permukaan membran dan sinyal yang dihasilkan dari hibridisasi pada fragmen
pembatasan tertentu akan sulit dan tidak mungkin untuk mengidentifikasi.
Larutan prehybridization mengandung polimer nonbiological senyawa seperti
polivinilpirolidon dan / atau biologis polimer seperti Ficoll (berbasis karbohidrat
senyawa), albumin serum sapi atau susu kering. DNA dari suatu organisme tidak
berhubungan dengan seseorang yang memiliki DNA telah dihapuskan juga dapat
digunakan (DNA sperma salmon adalah pilihan yang populer). Prehybridization
membutuhkan waktu antara 15 menit dan 3 jam pada 68 C, tergantung pada jenis
membran.
6. Tahap pencucian dan hibridisasi
Tahap kedua adalah hibridisasi yang sebenarnya, yaitu
dilakukan dalam buffer garam tinggi yang mengandung deterjen, biasanya 2
SSC11% SDS. Dua pendapat itu penting di tahap percobaan. Pertama, cukup Probe
DNA harus berhibridisasi ke fragmen pembatasan target untuk menghasilkan sinyal
yang jelas yang dapat dilihat oleh sistem deteksi yang sesuai untuk label dibawa oleh
probe. Yang paling menuntut aplikasi seperti deteksi dari satu salinan gen dalam
DNA genom manusia, cukup sensitivitas menjadi masalah jika maksimum jumlah
DNA genom dimuat ke elektroforesis gel (dalam praktek, sekitar 10 mg DNA per
lajur) dan Probe telah diberi label untuk aktivitas spesifik yang paling tinggi (4109
mg21 dpm untuk label radioaktif 32P). Masalah yang lebih besar akan dihadapi jika
label radioaktif selain 32P digunakan, seperti 35S, yang umumnya hanya cocok untuk
menyelidik DNA kurang kompleks seperti plasmid dibatasi atau bakteriofag klon,
atau jika Probe nonradioactive digunakan. Dalam keadaan ini beberapa peningkatan
sensitivitas dapat diperoleh dengan polimer inert seperti 10% dekstran sulfat atau 8%
polietilen glikol 6000 dalam larutan hibridisasi. Polimer ini diperkirakan menginduksi
molekul probe untuk membentuk jaringan sehingga jumlah yang lebih besar dari
DNA berhibridisasi ke situs target pada membran. Dalam penerapannya, 10 ke 100
pelipatannya meningkat dalam sensitivitas yang dapat dicapai. (Amasino, 1986).
Faktor kritis yang kedua yang harus dipertimbnangkan selama proses
hibridisasi adalah reaksi yang spesifik. Jika penelitian DNA telah dilakukan secara
hati-hati kemudian akan menggandung sebuah isi yang melengkapi komplementer
untuk semua atau sebagian dari fragmen restriksi blot yang sedang dicari. Jika ini
bagian hibridisasi dalam penelitian yang tidak melengkapi komplementari untuk
sebuah target, kemudian pada akhirnya dia memiliki daerah kesamaan yang kuat
sehingga hibridisasi stabil dapat terbentuk. Masalahnya adalah penelitian juga
memiliki potensial untuk hibridisasi ke beberapa fragmen DNA blott lainnya yang
mana ia mempunyai partikel komplementaritas. Penelitian hibridisasi itu tidak akan
pernah memberikan hasil yang tidak ambigu jika penelitiannya itu kesamaanya lebih
untuk fragmen rektriksi yang kedua dari yang diteliti sebelumnya. Tetapi,
permasalahan hibridisasi yang tidak spesifik masih dapat mucul ketika pencocokan
yang sesuai dengan adalah target yang spesifik ini dimaksudkan bahwa tahap
hibridisasi harus dilaksanakan pada stringency yang hasilnya didalam target hibrid
spesifik yang diteliti sisanya stabil sementara hibrid yang lain tidak stabil. Stringency
akan ditentukan oleh komposisi buffer hibridisasi dan temperatur pada saat
eksperimen tersebut dilaksanakan. Komposisi buffer yang relevan karena hibrid yang
stabil itu tegantung pada kekuatan ionik dan kehadiran agen pengganggu seperti
formamide yang mengganggu ikatan hidrogen. Temperatur yang relevan karena titik
lelehnya (Tl, temperatur paling tinggi dimana hibrid itu stabil) sepenuhnya pasangan
basa hibrid yang tinggi daripada yang satunya dimana beberapa psangan basa tidak
terbentuk karena penelitian dan target DNA tidak sepenuhnya komplemen. Bentuk
dari hibrid,dan ketidaksetabilan hibrid non spesifik dapat, disana dapat dicapai
dengan penggunaan komposisi yang tepat dari komposisi buffer dan temperatur
hibridisasi sebuah angka dari strategi yang berbeda itu mungkin. Jika pemeriksaan ini
panjangnya lebih dari 100 bp,untuk contoh fragmen restriksi clon, kemudian
identifikasi hibridisasi biasanya pada 68
o
c dalam larutan buffer garam tinggi, ini
mewakili kondisi kekuatan yang tinggi dibawah yang mana hanya stabil untuk
terbentuk, dengan sangat sedikit jika ada hibridisasi yang tidak spesifik. Dengan
strategi yaitu tahap pencucian yang dilaksanakan setelah dilaksanakan hibridisasi
dirancang dengan sederhana untuk menghapus non hibridisasi. Bagaimanapun, jika
oligonukleotida yang pendek di periksa ( 15-25 panjang nukleotida), kemudian cara
hibridisasi biasanya dibawah kondisi rendah dari kekuatan yang rendah (biasanya
pada suhu beberapa derajat di bawah Tm dihitung untuk hibrida yang diinginkan).
sehingga semua hibrida potensial, termasuk yang spesifik, mampu terbentuk.
Kekhususan yang kemudian dilakukan oleh serangkaian pencuci meningkatkan suhu
sehingga hanya hibrida yang diinginkan yang tetap berada di akhir dari prosedur.
Setelah mencuci, membran akan terbaca pada Prosedur deteksi yang tepat
untuk label yang telah digunakan, misalnya autoradiografi untuk radioaktif label.
Reprobing berikutnya mungkin jika membran 'dilucuti' dengan mencuci dalam buffer
suhu tinggi yang mengandung alkali dan deterjen untuk mengacaukan
hybridizedDNA. Prosedur ini tidak pernah sepenuhnya memuaskan karena sulit untuk
menghindari penghapusan beberapa DNA yang akan dihapuskan pada waktu yang
sama, bahkan membran nilon yang membawa ikatan kovalen terikat DNA hanya
dapat reprobed sepuluh kali atau lebih.
7. Aplikasi dan batasan dari teknik southern blot
Aplikasi dari sothern blot berbeda-beda dan tidak mudah di rangkum dalam sebuah
artikel. Terdapat dua contoh artikel penelitian yang cukup mengilustrasikan
bagaimana teknik itu dapat di aplikasikan.
8. Southern bolt pada identifikasi klon
Aplikasi sothern bolt yang paling sering terjadi selama penelitian di tujukan pada
idemtifikasi dan kloning sebuah gen yang spesifik. Genom DNA southern bolt di
gunakan untuk mengidentifikasi satu atau lebih fragmen restriksi yang mengandung
gen yang sedang di cari dan, setelah kloning yang bersifat sementara di lakukan
identifikasi rekombinan yang di inginkan dari koloni atau hibridisasi. Southern bolt
dari klon DNA restriksi digunakan untuk menjelaskan tentang identifikasi klon dan
kemungkinan untuk menemapatkan fragmen restriksi yang lebih pendek,
mengandung urutan yang sesuai, dari DNA yang di kloning. Aplikasi terakhir ini
penting karena urutan gen bias mencapai beberapa kb panjangnya tetapi dari beberapa
kb tersebut di dalam sebuah klon mengandung identitas genomnya dari beberapa
ratus kb yang d siapkan dengan vector kapasitas tinggi seperti kromosom bakteri atau
jamur. Southern blot ini dapat di aplikasikan untuk identifikasi gen tentu saja penting
untuk penyelidikan hibridisasi yang sesuai, satu yang akan mendeteksisecara khusus
satu atau lebih fragmen restriksi yang mengandung gen yang akan di cari. Gen sudah
tersdia untuk di cloning sebagai cDNA yang digunakan sebagai penyelidikan untuk
identifikasi versi genom dari gen. secara alternative jika gen telah di cloning dari
organisme yang berhubungan satu dari urutan gen itu sama di dalam organisme yang
sedang di teliti, kemudian penelitian heterologous dapat di gunakan, dimana beberapa
non komplementaritas Antara penyelidikan dan target di toleril selama tahap
hibridisasi. Pndekatan dapat ini digunakan sebagai contoh untuk mengidentifikasi
homologues dari gen manusia di dalam genom atau primata lainnya, bahkan dapat
digunakan untuk spesies lainnya, sebagai contoh penggunaan gen drosophila sebagai
penyelidikan untuk sekuens yang sama. Kemungkinan lainnya adlah menggunakan
urutan asam amino dari kode protein dari gen yang di inginkan untuk mendesain
rancangan oligonukleotida campuran yang mengandung varietas dari sekuens sama
dan kombinasinya terlibat secara keseluruhan yang akan menjadi kode untuk sgmen
pendek dari sekuenss asam amino. Sebagai contoh oligonukleotida campuran 5-
AA(C/U)GA(A-G)AUGUU(C-U)UGGUA(C/U)GG-3 yang mana mengandung 16
sekuens yang berbeda, menutupi semua kemungkinan sekuens asam amino
asparagine glutamin- metionin- penilalanin- tryptopan tirosin glisin dan dapat di
gambarkan untuk mendeteksi kode urutan DNA untuk segmen protein ketika di
gunakan pada kekuatan yang cukup tinggi dalam ekperimens hibridisasi southern.
a. Southern bolt pada identifikasi klon
Aplikasi sothern bolt yang paling sering terjadi selama penelitian di tujukan pada
idemtifikasi dan kloning sebuah gen yang spesifik. Genom DNA southern bolt di
gunakan untuk mengidentifikasi satu atau lebih fragmen restriksi yang mengandung
gen yang sedang di cari dan, setelah kloning yang bersifat sementara di lakukan
identifikasi rekombinan yang di inginkan dari koloni atau hibridisasi. Southern bolt
dari klon DNA restriksi digunakan untuk menjelaskan tentang identifikasi klon dan
kemungkinan untuk menemapatkan fragmen restriksi yang lebih pendek,
mengandung urutan yang sesuai, dari DNA yang di kloning. Aplikasi terakhir ini
penting karena urutan gen bias mencapai beberapa kb panjangnya tetapi dari beberapa
kb tersebut di dalam sebuah klon mengandung identitas genomnya dari beberapa
ratus kb yang d siapkan dengan vector kapasitas tinggi seperti kromosom bakteri atau
jamur. Southern blot ini dapat di aplikasikan untuk identifikasi gen tentu saja penting
untuk penyelidikan hibridisasi yang sesuai, satu yang akan mendeteksisecara khusus
satu atau lebih fragmen restriksi yang mengandung gen yang akan di cari. Gen sudah
tersdia untuk di cloning sebagai cDNA yang digunakan sebagai penyelidikan untuk
identifikasi versi genom dari gen. secara alternative jika gen telah di cloning dari
organisme yang berhubungan satu dari urutan gen itu sama di dalam organisme yang
sedang di teliti, kemudian penelitian heterologous dapat di gunakan, dimana beberapa
non komplementaritas Antara penyelidikan dan target di toleril selama tahap
hibridisasi. Pndekatan dapat ini digunakan sebagai contoh untuk mengidentifikasi
homologues dari gen manusia di dalam genom atau primata lainnya, bahkan dapat
digunakan untuk spesies lainnya, sebagai contoh penggunaan gen drosophila sebagai
penyelidikan untuk sekuens yang sama. Kemungkinan lainnya adlah menggunakan
urutan asam amino dari kode protein dari gen yang di inginkan untuk mendesain
rancangan oligonukleotida campuran yang mengandung varietas dari sekuens sama
dan kombinasinya terlibat secara keseluruhan yang akan menjadi kode untuk sgmen
pendek dari sekuenss asam amino. Sebagai contoh oligonukleotida campuran 5-
AA(C/U)GA(A-G)AUGUU(C-U)UGGUA(C/U)GG-3 yang mana mengandung 16
sekuens yang berbeda, menutupi semua kemungkinan sekuens asam amino
asparagine glutamin- metionin- penilalanin- tryptopan tirosin glisin dan dapat di
gambarkan untuk mendeteksi kode urutan DNA untuk segmen protein ketika di
gunakan pada kekuatan yang cukup tinggi dalam ekperimens hibridisasi southern.

2.4 Aplikasi dan batasan dari teknik southern blot
Aplikasi dari sothern blot telah dilakukan pada berbagai penelitian salah
satunya pada (judul). Pada penelitian tersebut, metode southern blot digunakan untuk
Pengaruh perawatan DNA analisis hibridisasi Southern blot dari Fusariumoxysporum
F. sp DNA lycopersici dan F. spradicis-lycopersicigenomic.
1) Preparasi Probe DIG_IGS
DIG-PCR dilakukan untuk memperkuat fragmen IGS dari DNA genom jamur
template. Campuran 20 L PCR terdiri dari 2 L dNTPDIG konjugat (Boerhinger
Manneheim, Jerman), 2 L dari 10X standar penyangga Taq polimerase (New England
Biolabs, USA), 0,15 l DNA polimerase Taq, 0,5 L masing-masing 20 pmol / l yaitu
10 pmol dari Gambar Primers- 11 dan 12 (maju dan mundur), dan 1 L (10 ng) dari
setiap template DNA. MilliQ H
2
O selesai sisanya. Kondisi termal PCR adalah 94
o

C - 30 s, 58
o
C - 30 s, dan 72
o
C -1 menit untuk 35 siklus. Sebuah ekstensi akhir
pada 72
o
C adalah selama 7 menit. Produk PCR dianalisis pada 2% TAE-Agarose
gel untuk mengkonfirmasi keberhasilan atau sebaliknya dari reaksi.
2) Preparasi Sample DNA untuk Analisis Hibridisasi Southern
Sampel DNA yang diperoleh dengan metode non-Phenol-kloroform
ditentukan pengaruhnya pada blotting dan hibridisasi selanjutnya dideteksi dengan
menggunakan elektroforesis gel agarosa (Saitoh et al, 2006)
Salah satu bagian dari DNA genom menjadi sasaran pencernaan enzim
restriksi tradisional dengan menggunakan EcoRV (New England Biolabs Inc, USA),
yang menurut pencarian menggunakan program Genetix pada situs pembatasan dalam
urutan IGS template DNA. Sehingga diharapkan suatu single band akan diproduksi
jika hibridisasi berhasil. Kemudian ditambahkan 2 l masing-masing NE Buffer 3 (50
mM Tris -HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1,0 mM DTT, pH 7.9 pada 25
o
C),
Bovine Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) , dan EcoRV agar 14 l dari DNA
genomik (ca. 2,8 g) dalam tabung Eppendorf. Konten dicampur sebentar, kemudian
diinkubasi pada suhu 37
o
C semalam (sekitar 16 jam).
Bagian kedua (ca. 1400 ng) dipanaskan dalam air mendidih selama 6 menit
dan kemudian dingin langsung di atas es untuk mempertahankan sifat tunggal dari
DNA setelah untwining heliks yakni dua band yang diharapkan jika hibridisasi
berhasil. Bagian ketiga (1400 ng) pada gel tetap dalam bentuk asli. Dengan demikian,
hanya satu pita diharapkan jika hibridisasi berhasil
3) Transfer DNA Kapiler pada Membran Nytran Nylon
DNA dipindahkan ke membran Nytran Nylon dengan metode kapiler Elusi
dengan penyangga basa (0,4 M NaOH, 1 M NaCl) (Sambrook et al., 1989).
Kemudian DNA in situ didenaturasi dengan larutan asam lemah HCl (1 ml / 50 ml
H20) selama 15 menit, kemudian dicuci dengan air dan akan mentransfer DNA
selama sekitar 16 jam.
Prinsipnya, penyangga ditarik ke atas oleh gaya kapiler, meskipun gel DNA
terdenaturasi dan tersimpan di permukaan, namun membrane yang bermuatan positif
akan mempertahankan molekul DNA sehingga dapat mencegah DNA terikut bersama
penyangga (Sambrook, 1989).
4) Proses Prehibridisasi dan Hibridisasi
Transfer tumpukan dibongkar dan membrane filter dihapus dengan
menggunakan tang. Permukaan yang mengandung DNA ditandai dengan pensil
sebagai panduan. Membran dibersihkan secara singkat dalam 2 x SSC penyangga dan
selanjutnya dimasukkan ke antara dua lembar kertas dan di oven selama 2 jam pada
80
o
C. Membran dipindahkan ke kantong hibridisasi (ca.10 cm x 6 cm) dan 8 ml
buffer hibridisasi (2% memblokir reagen, 5 x SSC, 0,02% SDS 0.1% Sarcosyl).
Kemudian disegel setelah memastikan bahwa udara telah banyak keluar. Membran
kemudian diinkubasi pada 42
o
C dalam hibridisasi oven EYELA selama 1,5 jam.
Membran kemudian dihapus dan ditempatkan dalam kantong hibridisasi baru.
Sementara itu sekitar 15 menit sampai akhir langkah prehibridisasi, 8 l (2 l dari
masing-masing empat) dari probe IGS dalam tabung Eppendorf pada suhu 100
o
C
selama 10 menit. Kemudian pindahkan ke atas es, probe terdenaturasi ditambahkan
dengan isi kantong hibridisasi dan disegel, kemudian membran diinkubasi dalam oven
hibridisasi di 42
o
C semalam (ca. 16 h).

5) Proses Pencucian
Membran ditempatkan dalam sebuah piring Tupper dan dicuci dalam 60 ml 2x
SSC, 0.1% SDS (terbuat dari 6 ml 20 x SSC saham dan 600 l dari 10% saham SDS)
selama 30 menit dibagi menjadi 2 mencuci dari 15 menit masing-masing dengan 30
ml penyangga. Kemudian dicuci dengan 60 ml buffer (0,1 x SSC, 0.1% SDS) pada
68
o
C dalam oven hibridisasi. Konten ini dibagi menjadi dua bagian seperti
sebelumnya selama dua 15 mencuci menit pada 68
o
C. Pada suhu kamar membran
untuk sementara dipindahkan ke buffer (0,1 M Maleat asam, 0,15 M NaCl), sebelum
proses deteksi dimulai.
6) Proses Deteksi
Proses deteksi dimulai dengan penambahan 30 ml penyangga (6 ml dari 10%
susu Skim di 54 ml buffer 1, yaitu asam maleat dan NaCl) ke gel di piring Tupper)
untuk mengurangi kemungkinan untuk mengikat probe ke membran. Membran
diinkubasi selama 45 menit sebelum penambahan anti - DIG Fab Fragment (Roche
Diagnostics, Mannheim, Jerman) pada tingkat 1: 5.000 (yaitu 6 l / 30 ml untuk
menghalangi buffer) kemudian membran diinkubasi selama 45 menit. Pada akhir
inkubasi, buffer blocking dilepas saat membran dicuci dengan 30 ml larutan
penyangga (0,1 M Maleat asam, 0,15 M NaCl, Tween 20 0,3%) selama 15 menit.
Membran dipindahkan pada 3 penyangga (100 mM Tris-HCl, pH 9,5 100 mM NaCl,
50 mM MgCl2) sebelum proses visualisasi dengan larutan NBT / BCIP.

7) Visualisasi pada Band
Membran dipindahkan ke kantong hibridisasi untuk pengembangan warna.
Visualisasi band hibridisasi dapat dicapai dengan penambahan NBT / BCIP dari
larutan stok untuk konsentrasi akhir 2% dalam larutan substrat. Dalam hal ini, 160 l
larutan pewarna ditambahkan ke 8 ml larutan substrat dan campuran dituangkan
kedalam kantong hibridisasi yang mengandung membrane, kemudian disegel dan
disimpan dalam gelap selama sekitar 30 menit.



















BAB III
KESIMPULAN
Southern blotting adalah teknik yang memungkinkan fragmen restriksi
tertentu untuk dideteksi berdasarkan dari banyaknya fragmen restriksi lainnya. Ini
melibatkan transfer fragmen-fragmen DNA dari gel elektroforesis ke nitroselulosa
atau membran nilon seperti ikatan DNA yang menyediakan pola dalam gel yang
diproduksi dalam membran.pemeriksaan hibridisasi kemudian digunakan untuk
mendeteksi fragmen destriksi yang akan dicari. Metodologi dasar dari southern
blotting tidak hanya mengubah dari teknik awal pendeskripsian pada tahun 1975
tetapi memodifikasi ini telah diperkenalkan dengan tujuan mempercepat proses dan
mencapai lebih dari tranfer yang tepat. Southern blotting mepunyai banyak aplikasi-
aplikasi dalam biolog molekuler, meliputi identifikasi dari satu atau lebih fragmen-
fragmen retriksi yang berisi gen atau DNA squencing lainnya yang sesuai, dan dalam
deteksi dari RFLP digunakan dalam kontruksi dari lokasi genom.


DAFTAR PUSTAKA
Ausubel FM,Brent R,Kingston RE et al. (eds) (1993) Current Protocols in Molecular
Biology. New York: John Wiley.
Brown TA (1995) Gene Cloning: An Introduction,3rd edn. London: Chapman &
Hall.
Brown TA (1998) Molecular Biology Labfax. London: Academic Press.
Dyson NJ (1991) Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis. In:
Brown TA (ed.) Essential Molecular Biology: A Practical Approach,vol. 2,pp.
111156. Oxford: Oxford University Press.
Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor,NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
Watson JD,Gilman M,Witkowski J and ZollerM(1992) Recombinant DNA,2nd edn.
New York: WH Freeman