Anda di halaman 1dari 34

ANALISIS TOKSIKOLOGI

FORENSIK DAN KLINIK


Determination of Chronic Abuse of The Anaesthetic Agents
Midazolam and Propofol as Demonstrated by Hair Analysis
Kelompok 3
Putu Wida Kawistari 1008505006
Putu Hediarta Widiana Putra 1008505080
Putu Yudha Ugrasena 1008505082
Kasus
Seorang perawat wanita di departemen anestesiologi berumur 44
tahun ditemukan tewas di rumahnya. Pada kasus ini, ditemukan sebuah
botol kosong Hypnovel (midazolam 5 mg/5 mL) dan jarum suntik di
dekat mayat. Pada tubuh korban tidak menunjukkan adanya tanda-
tanda kekerasan, tetapi terdapat beberapa bekas jarum pada lengan
dan kongesti paru pada saat otopsi. Darah femoral dan berbagai jenis
rambut dikumpulkan untuk investigasi toksikologi. Helaian rambut di
kepala (panjang 6 cm) dipotong sedekat mungkin dengan kulit
menggunakan gunting kecil pada bagian posterior vertex dan disimpan
dalam tabung plastik kering pada suhu kamar. Tidak ada penggunaan
kosmetik yang diaplikasikan ke rambut (misalnya pengeritingan,
bleaching, dying hair, dll). Sampel rambut ketiak dan kemaluan juga
dipotong sedekat mungkin dengan kulit menggunakan gunting kecil dan
disimpan dalam tabung kering pada suhu kamar. Warna untuk semua
spesimen rambut adalah coklat (Cirimele et al., 2002).
Tujuan
Tujuan Analisis
Untuk analisis agen anestesi dalam sampel rambut yaitu
midazolam dengan metode GC-MS mode ionisasi kimia negatif
(NCI) dan propofol dengan metode HS-GC/MS yang sensitif
dan spesifik dalam menyelesaikan kasus forensik.
Tujuan Aspek Forensik
Untuk membuktikan adanya penyalahgunaan senyawa
midazolam dan propofol yang terdapat pada sampel rambut
perawat wanita yang tewas di rumahnya.
Aspek Forensik
Dalam kasus ini, peran ilmu forensik digunakan untuk mengetahui
apakah kasus ini termasuk tindak kriminal sebagai masalah hukum
atau termasuk tindak kriminal masalah teknis.
Konsentrasi senyawa midazolam dan propofol dalam darah
korban tidak memenuhi untuk menimbulkan efek toksisitas.
Sehingga dicurigai bahwa korban telah menyalahgunakan agen
anestesi tersebut dalam jangka panjang. Untuk mengetahui
riwayat penggunaan obat yang kronis, sampel biologi yang
dapat digunakan adalah rambut.
Dengan bantuan ilmu forensik, dapat disimpulkan penyebabnya
adalah bunuh diri. Oleh sebab itu penyidik tidak perlu melakukan
penyidikan selanjutnya guna mencari siapa pelaku dari peristiwa
tersebut, karena kematian diakibatkan oleh perbuatannya sendiri.
Uraian Masalah
Masalah Analisis
Sampel biologis yang paling banyak digunakan dalam analisis
toksikologi adalah berupa urin dan plasma. Namun, eliminasi
obat dalam sampel tersebut terjadi dalam beberapa hari saja,
sehingga untuk mengetahui tepatnya tingkat toksisitas pasien,
biasanya diperlukan analisis toksikan yang berulang baik dari
darah maupun urin, sehingga dalam kasus ini digunakan sampel
rambut.
Diperlukan suatu metode analisis yang cepat, sensitif, dan
spesifik dalam penentuan midazolam dan propofol pada
sampel rambut.
Uraian Masalah
Masalah Forensik
Ditemukan sebuah botol kosong Hypnovel (midazolam 5 mg/5
mL) dan jarum suntik di dekat mayat, serta tidak ditemukannya
tanda-tanda kekerasan pada tubuh korban, sehingga diduga
perawat tersebut meninggal akibat penyalahgunaan
midazolam dan propofol.
Apakah kasus tersebut termasuk tindak kriminal sebagai
masalah hukum atau tindak kriminal sebagai masalah teknis?
Tinjauan Pustaka
Midazolam
Midazolam, yang juga dikenal sebagai Hypnovel, merupakan
water soluble benzodiazepine yang terikat dalam albumin
plasma.
Midazolam termasuk psikotropika golongan IV yang pertama
kali dibuat tahun 1976 oleh Fryer dan Walser. Tujuan
pemberian utamanya adalah sebagai obat penenang atau
hipnotis serta digunakan dalam prosedur medis dan bedah.
Paparan midazolam terhadap pH darah juga mengubah
strukturnya dari water-soluble menjadi lipid-soluble yang mampu
melewati sawar darah otak untuk meningkatkan akses menuju
sistem saraf pusat.
Tinjauan Pustaka
Midazolam
Rumus molekul : C
18
H
13
ClFN
3
Berat molekul : 325,8 g/mol
Pemerian : Kristal tidak berwarna
Kelarutan : Larut dalam air
Titik leleh : 158-160
0
C
pKa : 6,2
Koefisien partisi : Log P (oktanol/air) 4,3
Tinjauan Pustaka
Propofol
Propofol merupakan derivat fenol yang banyak digunakan
sebagai anastesia intravena dan lebih dikenal dengan nama
dagang Diprivan.
Propofol digunakan untuk induksi dan pemeliharaan dalam
anastesia umum dengan pemakaian propofol, maka
didapatkan kesadaran yang lebih cepat kembali dengan
efek residul yang minimum pada sistem saraf pusat jika
dibandingkan dengan obat induksi lainnya.
Tinjauan Pustaka
Propofol
Rumus molekul : C
12
H
18
O
Berat molekul : 178,3 g/mol
Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air
Titik leleh : 19
0
C
pKa : 11,1
Koefisien partisi : Log P (oktanol/air) 3,79
Tinjauan Pustaka
Preparasi Sampel Biologis (Rambut)
Keuntungan tes rambut dibandingkan dengan urine atau darah
adalah mempunyai jendela pengamatan yang besar (minggu
ke bulan, tergantung dari panjang batang rambut, 2-4 hari
untuk obat dalam urine dan darah) serta mampu membedakan
antara chronic use atau single exposure. Biasanya analisis
rambut disertai juga dengan analisis urin atau darah. Analisis
rambut digunakan untuk mengetahui data jangka panjang
sedangkan analisis urin atau darah untuk informasi jangka
pendek.
Prosedur pengambilan rambut untuk analisis belum terstandarisasi.
Tinjauan Pustaka
GC-MS
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi
antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas
akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke
detektor. Spektrometri massa didasarkan pada pergerakan
partikel yang bermuatan (ion) dalam bidang listrik atau magnetik
berdasarkan rasio m/z dari ion tersebut
Pengoperasian GC/MS dalam mode SIM memungkinkan untuk
mendeteksi analit tertentu dengan meningkatnya kepekaan relatif
terhadap mode full scan. Dalam mode SIM, MS mengumpulkan
data massa lebih interest daripada mencari semua massa dalam
semua rentang.
Metode Analisis
GC/MS denganNCI deteksi
chromatograph (LC sistem
Alliance)
Tabung kaca head space
Kolom kapiler HP wax (30 m
0.25 mm I. D. 0.25 mm tebal
film)
Detektor selected ion monitoring
Dan beberapa peralatan lain
sesuai keperluan analisis.
Methylene klorida
Tetrahydofuran (THF)
Soerensen buffer pH 7,6
Diazepam deuerated
Diethyl eter / kloroform
N,O-
bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
1% trimethylchlorosilane.
Rambut Perawat (dari ketiak,
kepala, pubis) dengan panjang
berbeda
Rambut selain perawat (Blank)
Alat Bahan
A. Preparasi Larutan Stok Standar
Larutan Stok Midazolam, 1-OH-midazolam, dan Propofol
Larutan stok disiapkan dalam metanol pada konsentrasi 400 g/ml dan
disimpan pada suhu -20
O
C. Dibuat larutan kerja 400 ng/mL
Larutan Internal Standar (Diazepam terdeuterasi) untuk Midazolam dan 1-
OH-midazolam
Larutan stok Diazepam dibuat pada konsentrasi 100 g/mL. Dibuat
Larutan baku kerja internal sebesar 5 ng/mL
Larutan Internal Standar (THF) untuk Propofol
Disiapkan stok tetrahidrofuran (THF) pada konsentrasi 100 g/mL. Dibuat
larutan kerja baku internal sebesar 5 ng/mL
Pembuatan Buffer
KH
2
PO
4
(38,8 mL) (9,07 g/ml) dicampur dengan 61,2 ml (11.87 g/ml)
Na
2
HPO
4
dan diatur pH nya menjadi 7,6 dengan 1M NaOH. Buffer
disimpan selama 1 bulan pada temperatur hangat dalam termos gelap.
C. Penanganan Sampel Rambut (Prosedur Ekstraksi)
untuk Analisis Midazolam, 1-OH-midazolam
Untuk melakukan validasi metode, rambut kepala tanpa obat digunakan sebagai
spesimen kosong (blanko). Rambut perawat yang telah dilakukan pencucian
berturut-turut dalam metilen klorida dipotong-potong menjadi 3 bagian.
Dari akar 2 cm, 2-4 cm, dan 4-6 cm. Rambut dari ketiak dan pubis juga
dikumpulkan dan dicuci dengan metilen klorida.
Rambut kemudian dihaluskan dalam ball mill dan 50 mg bubuk rambut
diinkubasi dalam 1 ml larutan penyangga pH 7,6 semalaman pada suhu 40C
dengan diazepam deuterated digunakan sebagai standar internal sebesar 50 ng.
Setelah ekstraksi dengan 5 ml dietileter : kloroform (80:20 v/v), fase organik
diuapkan dan ekstrak kering diderivatisasi dengan 35 ml N,O-bis (trimetilsilil)
trifluoroacetamide dan 1 % trimetilklorosilan.
D. Penanganan Sampel Rambut (Prosedur Ekstraksi)
untuk Analisis Propofol
Setelah dicuci berturut-turut dalam metilen klorida, rambut dipotong
menjadi segmen kecil 1 mm dengan gunting.
Sebanyak 50 mg ditambahkan ke tabung 20 ml kaca head-space
dengan tetrahidrofuran (THF) sebagai standar internal dan
ditambahkan 1 ml larutan penyangga pH 7,6.
Tabung disegel dan diinkubasi semalaman pada suhu 40C.
E. Analisis Midazolam, 1-OH-midazolam dengan GC-
MS
Analisis dilakukan dengan menggunakan metode GC/MS dalam
mode NCI. Alikuot 1,5 l dari derivatisasi ekstrak diinjeksikan
dengan suhu injektor 250C ke kolom kapiler HP-5MS (30 m
0,25 mm ID 0,25 pM ketebalan Film).
Pemisahan dicapai dengan kecepatan alir konstan dari 1,0
ml/menit dari gas pembawa helium menggunakan suhu oven awal
60C dipertahankan selama 1 menit, kemudian naik 30C/menit
sampai 295C dan suhu akhir dipertahankan selama 6 menit.
Metana digunakan sebagai gas reaktan pada tekanan 1,3 Torr
dalam sumber ion. Spektrum massa yang direkam dalam mode full
scan 250-450 Amu.
Analit diidentifikasi berdasarkan waktu retensi
relatif mereka dan spektrum massa tertentu,
yaitu midazolam dengan waktu retensi 10,08
menit, m/z 325-327; 1 - OH - midazolam
dengan waktu retensi 10,64 menit, m/z 325-
413-415; diazepam-d
5
dengan waktu retensi
9,55 menit, m/z 289. Kuantifikasi dilakukan
setelah penentuan faktor respon terhadap
diazepam-d
5
.
Cont...
F. Analisis Propofol dengan GC-MS
Campuran yang telah homogen dianalisis secara langsung dengan sistem
operasi HS-GC/MS mode tumbukan elektron (electronic impact).
Untuk proses volatilisasi, tabung yang diberi tekanan selama 15 menit pada
80C dalam HS 40 (Perkin Elmer) dan aliquot dipindahkan ke kromatografi
gas (Hewlett Packard 5890) di bawah tekanan helium 100 kPa.
Kromatografi dioperasikan pada kolom lilin kapiler HP (30 m 0,25 mm ID
0,25 mm ketebalan film) menggunakan suhu oven berikut: 45C selama 3
menit, 10C/menit sampai 180C dan 30C/menit sampai 240C.
Deteksi dilakukan dengan detektor massa selektif Hewlett Packard 5971
menggunakan mode Selected ion monitoring (SIM).
Propofol diidentifikasi berdasarkan waktu
retensi dan kelimpahan relatif tiga ion
mengkonfirmasikan: propofol dengan waktu
retensi 18,34 menit, m/z 117-163-178; THF
dengan waktu retensi 2,13 menit, m/z 72.
Kuantifikasi Propofol dibuat setelah penentuan
faktor respon terhadap THF.
Cont...
Linieritas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang
memberikan respon yang secara langsung atau dengan
bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode
adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang
sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan,
keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Harmita,
2004).
Rentang linieritas Midazolam dan 1-OH-midazolam dibuat
pada konsentrasi 0,050 5 ng/mg hair (r = 0.97 and 0.96),
rentang linieritas propofol 0,1 10,00 ng/mg (r = 1.00).
F. Validasi Metode
Presisi
Presisi ditentukan dengan simpangan baku dan simpangan
baku relatif dari larutan sampel yang ditetapkan. Simpangan
baku ditentukan menggunakan rumus berikut:
Nilai presisi midazolam dan 1-OH-midazolam pada
konsentrasi 0.5 ng/mg masing-masing sebesar 6.3% dan
8.1%. Nilai presisi propofol pada konsentrasi 0,5 ng/mg
adalah 6,0%.
Akurasi
Data AUC dari pengukuran rentang linearitas digunakan kembali
untuk menentukan akurasi metode ini. Caranya adalah dengan
menghitung perolehan kembali Midazolam, 1-OH-midazolam dan
propofol yaitu mensubstitusikan nilai masing-masing AUC
pengukuran pada persamaan regresi y = bx + a. Jadi, perolehan
kembali dihitung dengan rumus :
Pada analisis Midazolam dan 1-OH-midazolam, nilai akurasi
adalah rata-rata persen perolehan kembali untuk konsentrasi 0,5
ng/mg sebesar 93,8% dan 90,2%. Persen perolehan kembali untuk
propofol konsentrasi 0,5 ng/mg sebesar 27%.
% 100
sebenarnya kadar
pengukuran hasil dari kadar
kembali Perolehan
LOD dan LOQ
Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) ditentukan dengan
menghitung simpang baku residual yang membandingkan hasil pengukuran
dengan hasil perhitungan. Rumus yang digunakan adalah:
Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)
Sb = simpangan baku residual
k = konstanta yaitu 3 untuk LOD atau 10 untuk LOQ
Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon
terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a + bx)
Nilai LOQ Midazolam, 1-OH-midazolam, propofol pada kasus ini adalah
1,05 ng/mg.
Hasil dan Pembahasan
Uji skrining pada darah immunoassay, kromatografi
cair ditambah dengan detektor diode array (HPLC-
DAD) dan GC/MS baik dengan deteksi NCI untuk
midazolam atau Head Space (HS) preparation untuk
propofol.
etanol terdeteksi dalam sampel darah pada 0,38 g/l.
Hasil analisis untuk anestesi di darah femoral adalah
midazolam 45 ng/ml, 1 -OH-midazolam 1 ng/ml dan
propofol 39 ng/ml ------------ kadar dalam darah lebih
rendah dari rentang terapi anestesi dugaan
penyalahgunaan kronis.
Cont..
Pencucian dengan metilen klorida untuk
menghilangkan pengotor-pengotor selain
analit pada sampel.
Pemotongan rambut menjadi beberapa bagian
dari akar untuk mengetahui deposisi analit
ada pada bagian rambut yang mana yang
ditunjukkan dengan kadar tertinggi analit
pada bagian rambut tertentu.
Cont..
Analisis Midazolam dan 1-OH-midazolam
derivatisasi GC/MS negative chemical ionization
(NCI) menghilangkan gangguan bahan kimia
sehingga menyediakan kemampuan untuk mengukur
dalam matriks yang kompleks.
Headspace (HS) GC/MS analisis dengan kuat,
teknik sepenuhnya otomatis untuk penentuan melacak
senyawa organik volatil dengan jumlah sedikit
menghindari kesalahan karena kontaminasi silang
dengan gelas dan hilangnya komponen volatil selama
transfer sampel.
Cont..
Linearitas: untuk midazolam konsentrasi mulai
0,05 - 5,00 ng/mg (r = 0,97 dan 0,96) dan
propofol konsentrasi mulai 0,1 - 10,00 ng/mg (r
= 1,00).
Presisi & perolehan kembali: midazolam 6,3 dan
93,8%; 1-OH-midazolam 8,1 dan 90,2%;
propofol 6,0 dan 27% (untuk konsentrasi 0,5
ng/mg).
Rasio signal-to-noise: midazolam 35 pada titik
kalibrasi terendah 0,05 ng/mg; propofol pada
titik kalibrasi terendah 0,01 ng/mg.
Tabel 1. Hasil analisis dari midazolam, 1-OH midazolam (1-OH-
M) and propofol pada tipe rambut yang berbeda
Cont..
Hasil kromatogram ion mode deteksi NCI: identifikasi
midazolam waktu retensi 10,08 menit, m/z 325-327, 1-
OH-midazolam dengan waktu retensi 10,64 menit, m/z
325-413-415, diazepam-d
5
dengan waktu retensi 9,55
menit, m/z 289.
Kuantifikasi dilakukan setelah penentuan faktor respon
terhadap diazepam d
5
.
berdasarkan waktu retensi dan kelimpahan relatif tiga ion
dengan hasil waktu retensi propofol 18,34 menit, m/z 117-
163-178, THF dengan waktu retensi 2,13 menit, m/z 72.
Kuantifikasi Propofol dibuat setelah penentuan faktor
respon terhadap THF.
Kesimpulan
Penyalahgunaan agen oleh staf medis untuk tujuan
hiburan sudah banyak diketahui tetapi bukti analisis
sering kurang. Etanol yang ditemukan dalam darah
juga dapat menjadi pemicu kematian dalam kasus ini.
Dalam situasi ini, analisis rambut dapat menjadi
pengatasannya. Hasil analisis yang dilakukan
menunjukkan GC / MS-NCI dapat digunakan untuk
mendeteksi agen anastesi dalam rambut manusia. Sifat
fisiko-kimia propofol mendukung untuk dilakukannya
headspace preparation dari spesimen rambut dan
dilakukan pengembangan metode asli yang tidak
memerlukan prosedur ekstraksi yang lama.