Anda di halaman 1dari 17

TUGAS MAKALAH BIOTEKNOLOGI

ISOLASI DAN PURIFIKASI SEBAGIAN DARI METABOLIT STRAIN


MUTAN BASILUS Sp. DENGAN AKTIVITAS ANTIBIOTIK TERHADAP
AGEN TUMBUHAN PATHOGENIK

NAMA KELOMPOK:
1. RATNA KUSUMAWARDANI (4001507007)
2. MARIA ULFAH (4001507009)
3. SUWAHONO (4001507032)
4. M. MUKHLIS (4001507015)
5. FADKAN (4001507011)

PROGRAM PASCA SARJANA


PENDIDIKAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2008
ISOLASI DAN PURIFIKASI SEBAGIAN DARI METABOLIT STRAIN
MUTAN BASILUS Sp. DENGAN AKTIVITAS ANTIBIOTIK TERHADAP
AGEN TUMBUHAN PATHOGENIK

Penggunaan mikroorganisme untuk tujuan biologi menjadi alternatif yang


efektif untuk mengontrol tumbuhan patogen. Beberapa contoh penggunaan
formulasi bakteri atau strain jamur dengan aplikasi biokontrol. Anggota dari
genus Basilus diketahui sebagai penghasil antibiotik. Kapasitas dari antibiotik
akan meningkat dengan mutagenesis yang liar. Menurut penelitian mutasi dari
strain basilus A47, antagonis tumbuhan patogen, untuk mengisi peningkatan strain
dengan kapasitas yang ditingkatkan untuk mensintesis metabolit dengan aktivitas
antibiotik. Strain mutan M40 diisi menggunakan agen mutagenik acridine orange.
Strain mutan memperlihatkan aktivitas antagonis yang lebih tinggi daripada tipe
A47 yang liar melawan tanaman patogen Botritys cinerea, Ralstonia
solanacearum dan Erwinia carotovora. Hasil akhir untuk mengisolasi metabolit
antibiotik diproduksi dengan strain M40 dan untuk menentukan sifat kimia dan
sifat antibiotik antara lain adanya ekstraseluler, temperatur stabil dan metabolit
yang mudah larut dalam etanol dan menyerap cahaya pada 212 nm. Karakteristik
ini digambarkan sebagai siklus antibiotik lipoprotein seperti iturin. Control biologi
dari tumbuhan patogenik sekarang menjadi sangat penting sejak penggunaan
pestisida kimia secara konvensional menjadi masalah yang sangat serius karena
mempengaruhi kesehatan manusia dan lingkungan. (Spurrier, 1990; Mendgen
dkk, 1992).
Isolasi strain dari permukaan buah raspberry yang segar menunjukkan
aktivitas antagonik yang sangat tinggi melawan beberapa strain dari Botritys
cinerea, dan panen tahap akhir tumbuhan patogenik anggur, berries dan buah
kecil yang lain sangat penting. Isolasi antagonis ini didesain sebagai A47 aktif
melawan Botritys cinerea invitro dan invivo ditunjukkan juga aktivitas yang
sama pada Ralstonia solanacearum dan Erwinia carotovora, pada kentang. Isolasi
A47 diidentifikasi sebagai endospora membentuk bakteri gram positif
digabungkan dengan genus Basilus (Gordon, dkk, 1973; Norris, dkk, 1983)
Tes bakteri, kestabilan suhu dan sifat kimia produk antibiotik disarankan
diisolasi sebagai strain B.substlis (Silva, 1992). Senyawa yang tahan panas diisi
dari hasil isolasi yang sama dimurnikan sebagian dan diaktifkan melawan jamur.
Senyawa ini diidentifikasi sebagai anggota iturin (Mc Keen,dkk, 1986) dan
mempunyai bagian sifat-sifat senyawa antibiotik yang sama diproduksi dengan
mengisolasi A47.
Senyawa iturin termasuk famili dari lipoprotein dari beberapa strain
B.substilis ketika tumbuh pada media cair. Senyawa-senyawa amfifilik adalah
cincin peptida dari residu tujuh asam amino meliputi invariabel D-Tyr2 dengan
sekuen kiral yang konstan LDDLLDL ditutup dengan C14-C17 alifatik β-asam
amino (Maget-Dana dan Peypoux, 1994). Mereka menunjukkan aktivitas anti
jamur yang sangat kuat melawan varietas dari tumbuhan patogeni jamur dan ragi
yang lebar.
Pusey dan Wilson mengisolasi strain B.substilis (B-3) dari tanah, aktif
melawan tumbuhan patogen Monilinia fructicola (Besson, dkk, 1987)
mengidentifikasi adanya antibiotik anti jamur dari kelompok iturin pada 30 strain
B.substilis dan mengidentifikasi 2 tipe baru dari iturin (D dan E), membedakan
dari iturin A dengan adanya group karboksil bebas dalam iturin D dan kelompok
karboksimetil dalam iturin E.
Beberapa data tentang alterasi genetik dari strain liar untuk meningkatkan
efek antagonis. Cara ini sangat bagus untuk memproduksi strain baru dan produk
untuk kontrol biologi dari tanaman patogen karena modifikasi genetik
menggunakan agen mutagenik merupakan tehnik yang sangat sederhana dan dapat
digunakan untuk insersi DNA asing dalam mikroorganisme antagonis. Objek dari
penelitian ini adalah:
1. Untuk memilih mutagenesis acak dari tipe A 47 strain B.substilis dengan
meningkatkan aktivitas dengan melawan tumbuhan patogen Botritys cinerea,
Ralstonia solanacearum dan Erwinia carotovora.
2. Untuk mengoptimasi kondisi kultur untuk produksi metabolit antibiotik
dalam sub merger fermentasi.
3. Untuk mengisolasi metabolit untuk aktivitas antibiotik.

Metode dan Material


1. Isolasi.
Mikroorganisme patogenik digunakan sebagai target antibiotik Botrytis
cinerea VILL diisolasi dari buah rasberry segar, Erwinia carotovora dan
Ralstonia solanacearum.
2. Induksi, seleksi dan karakterisasi mutan bakteri ditetesi acridine
orange.
Disiapkan 8 tabung diberi 2 ml pepton dengan konsentrasi 0, 4, 8, 12, 16,
20, 24 dan 40 µL ditambahkan 1 mg/ml acridine orange. Semua tabung
diinokulasi dengan 50 µL dari kultur primer strain A47, pada konsentrasi sel
yang ekuivalen sampai 1,0 O.D pada 600 nm. Inkubasi dilakukan pada
temperatur 25˚C dalam shaker dengan putaran 150 rpm selama 24 jam.
Sampel dari masing-masing tabung diinokulasi dalam CPG media agar (10
g/L glukosa, 1 g/L asam amino casa, 10 g/L pepton, 15 g/L, pH = 7) dan
digunakan untuk menentukan koloni dan memilih mutan yang potensial
dalam menghasilkan produk yang banyak. Plate test diarahkan adanya
peluang dalam pemilihan koloni dengan kultur dari B. Cinerea, R.
Solanacearum dan E.carotovora. Inhibisi disebabkan oleh isolasi A47 yang
selalu digunakan sebagai control. Ukuran yang luas dari inhibisi disebabkan
oleh koloni mutan yang digunakan sebagaikriteria utuk menyeleksi koloni
yang dapat menghasilkan produk yang banyak.
Beberapa sifat-sifat dasar mikrobiologi dari penyeleksian strain mutan
seperti gram strain, glukosa dan fermentasi laktosa, pertumbuhan dalam
sitrat, produksi dari deaminasi fenil alanin, produksi indol, pemanfaatan
urea. Tes ini digunakan untuk membandingkan strain A47 yang liar.
3. Pemilihan Media Pembiakan dan Penentuan Pertumbuhan
Bakteri Jenis M40

Tiga pembiakan cair yang berbeda telah digunakan untuk mempelajari


tingkat produktifitas zat-zat terlarang yang dikarenakan over produksi untuk
memisahkan M40. media tersebut adalah CPG (10 gr/L glukosa; 1 gr/L
asam casamino; 10 gr/L peptone; pH 7,0), CPM (10 gr/L mannitol; 1 gr/L
asam casamino; 10 gr/L peptone; pH 7,0) dan CPM Ca 2+ (10 gr/L mannitol;
1 gr/L asam casamino; 10 gr/L peptone; 5 gr/L CaCl 2 X 2 H 2 O; pH 7,0).
Media pembiakan terbaik telah dipilih berdasarkan ukuran daerah
tumbuhnya pathogen dalam lempeng agar-agar.
Pertumbuhan jenis M40 terjadi di dalam air kaldu CPM_Ca 2+ pada 200 rpm
dan 30 0 C untuk 250 h. Pembiakan dasar M40 dengan unit-unit pembentukan
koloni (CFU) 2,5 E + 9 telah ditambahkan ke dalam 500 ml media
CPG_Ca 2+ dan aliguot diambil antara 6 dan 12 h. Pertumbuhan tersebut
ditentukan dengan cara mengukur OD pada 600 nm, kaldu CPM_Ca 2+ yang
steril digunakan sebagai ruang hampa.
Ketika pertumbuhan bakteri dapat dicapai secara maksimal, pembiakan
tersebut dipisahkan dengan gaya sentrifugal pada 10.000 x g selama 30
menit. Butiran-butiran sel telah dibuang dan supernatant diasamkan menjadi
pH 2,5 dengan HCl 6 M.
Larutan tersebut diautoclave pada 0,75 atm selama 10 menit dan kemudian
dipisahkan dengan gaya sentrifugal pada 8000 x g selama 10 menit,
membuang endapannya. Supernatant disesuaikan pada pH akhir 7,3 dengan
penyangga pospat (1M, pH 8,0). Larutan ini dianggap sebagai supernatant
mentah.

Penentuan Unit-Unit Kegiatan Larangan (IAU) pada Metabolisme


Antibiotik dalam Supernatant Mentah.
Supernatant mentah diperoleh dengan cara pengolahan cairan M40 yang
diencerkan dengan penyangga posphat (1 M, pH 7,3) 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x,
8x, 9x, 10x, 11x dan 12x. Masing-masing pengenceran ini diuji terhadap E
carotova untuk menentukan tingkat konsentrasi larangan minimum pada
metabolisme antibiotic terhadap phatogen tumbuhan. Satu IAU ditentukan
sebagai pengenceran supernatant yang mencegah pertumbuhan in vitro
bakteri phytopathogen yang dinginkan.

Piring assay untuk membuat aktifitas bacteriostatic atau bactericidal


dari metabolite antibiotic dalam supernatant kasar.
Dari pencegahan assays diatur oleh E. Carotovora dan R. Salanacearum,
contoh dengan ujung cotton steril yang diambil dari permukaan agar dimana
tidak ada pertumbuhan pathogen yang diobservasi. Ujungnya merupakan
permukaan yang disangga ke piring agar CPG dan diinkubasi selama 48
jam. Tumbuh atau tidaknya, membuat perbedaan antara aktivitas
bacteriostatic dan bactericidal dari supernatant kasar dari isolasi M40.

Ketetapan suhu dan pengenceran pada methanol dari metabolite antibiotik


pada supernatant kasar.
1,5 supernatant kasar dibuang ke dalam tabung steril eppendarf, tabung
diperlakukan sebagai berikut :
a. ditaruh dalam suhu ruang.
b. air dipanaskan pada suhu 100 0 C selama 15 menit.
c. tabung reaksi dipanaskan pada suhu 120 0 C selama 20 menit.
Dari masing-masing tabung reaksi, fraksi 100 μL dites terhadap E. Carotova
untuk aktifitas pencegahan.
Disisi lain, metabolik antibiotik diekstraksi dari supernatant kasar dengan
volume methanol. Kedua fraksi larut dan tidak larut, diuapkan sehingga
kering, dicegh kembali dalam air murni dan di assay terhadap
phytopathogens.
Chromatography cairan terbalik dari metabolite antibiotik.
Fraksi methanol terlarut, diperoleh diatas, di chromathography pada μ-
bondapack C-18 kolom (3,9 x 300 mm) diseimbangkan dalam methanol
100%. Sampel dicampur dengan 100% methanol pada tingkat 0,7 ml/min
dengan total waktu 12 menit. Ujung-ujungnya dikumpulkan, diuapkan
hingga mongering dan di assay terhadap R. salanacearium. Peralatannya
dinamakan shimadzu LC-10A (Schreiber dkk.1988 : Guelner dkk. 1988).
Hasil
Produksi mutan menggunakan acridine jeruk sebagai mutagen.
Dua koloni diisolasi dari tegangan A47 yang dimutasi dengan acridine
jeruk dan lebih dari 20 cawan Petri yang diproduksi berisi banyak kumpulan
mutan dengan morphologi yang berbeda dari pertumbuhan pada agar CPG.
Kumpulan dari masing-masing cawan petri dipilih secara acak dengan kaca
pembesar yang steril dan dites untuk ativitas antogonis, lima mucous dipilih
dengan aktivitas yang meningkat dengan tegangan tinggi. Beberapa
tegangan dilabel pada M40, M16, M12 dan M4.Hasil dari pencegahan tes
terhadap B. cinerea dihadirkan dalam gambar 1a dan 1b, dimana efek
antagonistic yang lebih tinggi dari semua tegangan mutan dengan tegangan
tinggi sangat jelas. Tegangan M60 dipilih untuk pembelajaran yang lebih
lanjut karena menghasilkan zona pencegahan yang lebih besar pada B.
Cinerea (gambar 1b), Erwinia caratovora dan Ralstonia Solanacearum,
karena itu dicampur dengan mudah dan tumbuh dengan cepat pada media
CPG, CPM dan CPM_Ca 2+.

Perincian tegangan mutan pilihan


Tegangan mutan M40 bertipe mucous dan berbentuk besar, butyrous dan
koloni berbentuk bundar pada agar CPG. Dibawah mikrosop, selnya
berbentuk basil dan berbentuk tidak beraturan. Dikarenakan tegangan
tinggi, mutan M40, kemudian tumbuh pada citrate sebagai sumber karbon
(yang merefleksikan keberadaan premis citrate dalam sel) dan menggunakan
phenylalanine sebagai sumber nitrogen (yang merefleksikan kehadiran
phenylalanine). Hasil dari test ada pada Tabel 1.

Pemilihan kultur media yang tepat untuk pertumbuhan tegangan M40.


Fermentasi berjaln dengan menunjukkan mannitol lebih baik sumber karbon
daripada glukosa untuk produksi antibiotik, meningkatkan tegangan hingga
patogen mencapai dua kali lipat pada media CPG. Tambahkan ion kalsium
pada media CPM meningkatkan produksi antibiotik pada tegangan mutan
5,5 dan 2,5 kali dengan produksi antibiotik pada media CPG dan CPM.
Dari larutan supernatant kasar, aktivitas volumetric terhadap E. carotova 2,4
dan 11 IAU / 100 μL untuk media CPG, CPM dan CPM_Ca 2+ . Tambahan
jumlah volume untuk tes pencegahan adalah 100 μL, hasilnya dihadirkan
dalam tabel2.

Tujuan perkembanan bakteri pada media terpilih


Kultur utamadari 2,5 E + 9 CFU diimunisasi pada 50 mL dari media
CPG_Ca 2+ . Sisa pertumbuhan diobservasi lebih dari 5 hari pada media
CPG_Ca 2+ , dengan fase pertumbuhan lebih dari 80 jam. Pertumbuhan sel
maksimum diperoleh pada 114 jam dengan 6,1 E + 8 CFU / mL. Komposisi
dari antibiotik pada tegangan mutan dimulai selama fase pertumbuhan daan
konsentrasi maksimal diperoleh setelah akhir fase tersebut. Hasilnya
dihadirkan dalam gambar 2.

Ketetapan suhu dan kelarutan dalam methanol dari aktivitas antibiotik


supernatant kasar dari tegangan mutan M40.
Hasil stabilitas suhu dari antibiotik dihadirkan pada tabel 3. Perlakuan suhu
yang berbeda tidak mempengaruhi aktifitas antibiotik supernatant kasar,
zona pencegahan menjadi sama besar untuk porsi yang lebih besar
tergantung pada perlakuan yang berbeda dan juga untuk yang tidak
diperlakukan, digunakan sebagai control. Sehingga, antibiotik yang
dihasilkan adalah thermoresistant, karena satu-satunya yang dihasilkan oleh
tegangan tinggi A47. Hasil yang sama (data tidak ditunjukkan) didapatkan
menggunakan phytopathogaen lain sebagai target.

Antibiotik larut dalam methanol. Fraksi methanol terlarut aktif terhadap


phytopathogen dan tidak ada pencegahan yang diperoleh dengan fraksi
methanol tak larut.

Chomotography fase cairan terbalik dari aktifitas antibiotik.

Analisis HPLC memunculkan tiga definisi punak (Gambar 3). Sampel dari
masing-masing punak diuapkan hingga kering, pencegahan kembali dengan
air murni dan di assay terhadap R. Salanacearum. Fraksi nomor 2.

Diskusi
Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa bascillus Sp spesies, dinamai
sebagai A47, menghasilkan invitro aktif yang termostable metabolit
terhadap phytopathogen bascillus cinerea, E.carotovora dan R.
Solanaciacearum. Metabolite bisa memanas, tahan (propiase) larut dalam
methanol dan dikelompokkan sebagai antibiotik dari golongan iturin
menurut perangkat kimia dan antibiotiknya (Silva, 1992).
Pada percobaan ini benih liar A47, diakibatkan karena mutasi dengan
(acridine) orange dengan tujuan untuk meningkatkan kapasitas
(antagonostik) terhadap (phytopathogens). Pewarna acridine adalah
gabungan aromatik yang intercabce di dalam sepasang alas pada molekul
DNA sebagai bentuk penyisipan dan penghapusan (nucleoridic bases) atas
replikasi. (Kapuscinski dan Darzynkiewicz, 1984).

Tabel 2 Titrasi supernatants mentah dari CPG, CPM y CPM_Ca 2+ media


terhadap E. Carotova.

Size of inhibition zone (cm)


Dilutiion factor
CPG CPM CPM-Ca2+
1x 2,4 3,2 4
2x 1,2 2,6 3
3x 0 2 2,8
4x 0 1,4 2,7
5x 0 0 2,6
6x 0 0 2,2
7x 0 0 1,6
8x 0 0 1,5
9x 0 0 1,4
10x 0 0 1,2
11x 0 0 1
Gambar pertumbuhan bacterial dari benih mutan M40 dalam media cair
CPM-Ca 2+

Tabel 3. Efek dari perlakuan panas yang berbeda pada aktivitas antibiotic
supernatant mentah dari benih mutan terhadap E. Carotovora.
Treatment Diameter of inhibition zone (cm)
Suhu ruangan 20 ± 2 0 C, 20 menit 3,9
Water bath 50 ± 2 0 C, 20 menit 3,9
Autoclave 121 ± 1 0 C, 1 atm,20 menit 3,8
Gambar 3 chromatogram dari metabolite antibiotik diekstrakan dengan
methanol. Kolom C-18 keseimbangan dengan methanol dan eloted 100%
methanol pada 0,7 mL / menit. Selagi fase gerak hanya puncak no. 2
mengandung kegiatan antibiotik.

Setelah mutasi benih liar A47 dengan acredine orange, lima benih mutan
diisolasi dengan meningkatnya kegiatan petophagen target. Diantara
mereka, benih M40 dipilih untuk penelitian lebih lanjut. Benih ini
membentuk koloni mokous yang besar pada agar-agar CPG, cukup berbeda
dari koloni bentuk bintang dari benih liar. Perbedaan morfologi juga terlihat
di bawah mikroskop basillus lebih pendek pada benih M40 dibandingkan
pada benih liar. Benih juga berbiak secara beda pada tes biokimia. Benih
mutan M40 memberi tes phenylalanine positif, nampak kehadiran
phenylalanine dianase yang mungkin merefleksikan induksi sebagai hasil
altorasi ditingkat gen yang mengonrol transkipsi dari gen terstruktur untuk
enzim. Mungkin, gen struktur diatur secara negative pada benih liar,
menghalangi sintesis enzim. Benih mutan M40 mampu tumbuh pada citrate
sebagai sumber karbon tunggal, menampakkan kehadiran permease
kompleks bagi pengangkut citrate menuju sel (Davis dkk, 1980). Sementara
benih liar memberi tes negative bagi pemanfaatan citrate. Meskpun
demikian spectrum inhibition untuk pethopathogen target dari benih liar
tidak berubah terhadap mutasi.
Fermentasi kinetik dari benih mutan M40 menunjukkan fase pertumbuhan,
mencapai 6,1 E + 8 CFU / mm pada 114 h cultivasi. Sintesis antibiotik
mulai fase pertumbuhan dibuktikan oleh pencegahan yang dilakukan dengan
supernatant mentah dari benih mutan M40 yang di panen dari 80 – 120 jam,
tapi konsentrasi maksimal diperoleh setelah fase pertumbuhan. Sintesis
antibiotik pada peptid biasanya mulai pada akhir pertumbuhan eksponen,
mencapai konsentrasi maksimal setelah tumbuh sel berhenti (Bodanzky
Perlman, 1969). Telah disarankan bahwa banyak mikroorganisme bisa
mensistesis antibiotik pada saat fase pertumbuhan (haavik dan Thomassen,
1973, Barr, 1975, Haavik, 1976), yang mana sesuai dengan produksi kinetik
pada benih mutan M40. factor yang memicu terjadinya sistesis antibiotik
lebih dimungkinkan karena kelelahan dari nutrian yang terbatas diperlukan
untuk pertumbuhan sel. Keterbatasan ini biasanya merangsang deferensi
yang mana untuk kasus bassilus, berarti pembentukan induspora. Sporolasi
dihubungkan dengan sintesis dinding sel baru dan degradasi dinding
tersebut. Pada sel induk, dinding sel ini seperti antibiotik mengandung D
aniamino acid dan telah disarankan bahwa metabolisme diubah untuk
sintesis dinding sel dapat menyediakan bahan dasar untuk sistesis
antibiotik.

Kami menemukan sintesis antibiotik dinaikkan pada saat benih mutan M40
ditumbuhkan pada media CPM yang mengandung manintol dari pada
glukosa sebagai sunber karbon. Kesepakatan dengan Besson dkk, 1987
melaporkan mannitol, proktosa dan sukrosa sebagai sumber karbon yang
lebih baik dibandingkan glukosa untuk sintesis iturin A pada B. Subtilis.
Penekanan katabolit adalah mekanisme mengatur sel untuk
mengordinasikan metabolisme karbon dan sumber energi, untuk
memaksimalkan efisien dan memanfaatkan nutrian serta mengendalikan
proses metabolisme. Fakta yang tercatat dengan baik bahwa glukosa
mendukung represi dari enzim yang terlibat dari katabolisme karbohidrat
(metabolic) pada angka yang lebih rendah sebagai hasilnya, suatu hierarki
pemanfaatan karbon dan sumber energi dihasilkan menurut sistesis
metabolit sekunder dikarenakan represi katabolit oleh glukosa baik
langsung maupun tidak (Fischer dan Sonenshein, 1991).

Ion kalsium pada level 0,5% memiliki efek signifikan pada produksi
antibiotik oleh benih mutan M40 pada CPM. Efek yang sama diamati yang
sama juga pada lactococcus Lactis IO-1 dimana tambahan ion kalsium ke
dalam media menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam produksi
antibiotic nissin Z (Matsusaki dkk, 1996). Bagaimanapun juga efek
kebalikan diamati oleh Besson dkk pada tahun 1987, yang melaporkan
tentang penambahan kalsium klorida dalam kultur media. Bassilus subtilis
mencegah pengeluaran iturin A cara menyeluruh. Mereka menyatakan
bahwa kalsium memodifikasikan permeability membrane sel dalam bassilus
akan menghambat pengeluaran iturin A. Bagaimana setelah penulis yang
sama membuktikan bahwa kalsium dan mangan menaikkan pengendapan
iturin A dan bassilum nissin L setelah pengeluaran ke media (Besson dan
Micel, 1991). Dalam kasus kita, peningkatan konsentrasi antibiotic dimedia
dapat menjadi konskuensi meningkat di dinding sel air dari tegangan mutan
M40 yang ditingkatkan oleh kalsium, dalam kesepakatan dengan Petit
Glatron dkk, 1993, yang mempelajari kapasitas dinding sel untuk
konsentrasi kalsium dan mengajukan bahwa peningkatan konsentrasi di
lingkungan mikro dan dinding sel dapat memainkan peranan penting dalam
tahap akhir sekresi.
Biosassay berdasarkan zona pembersih dalam piring agar digunakkan untuk
menentukan aktifitas antibiotic metabolit yang dihasilkan oleh tegangan
mutan M40 terhadap petophatogen bassilus cineria, E. Carotovora dan R.
Solanacearum. Pencegahan untuk memunculkan produksi antagonis yang
kuat oleh tegangan mutan M40 sangat menarik karena antibiotic dapat
menghasilkan hambatan yang tumbuh baik di procariot dan iocariot seperti
kasus untuk sintesis iturin oleh bassilus subtilis (Maget Dana dan Peypox,
1994). Menurut hasil kami antibiotic diproduksi oleh tegangan mutan M40
yang memiliki kemungkinan aktivitas jamur dan bakteri. Untuk iturin A dan
bassilumisin L dalam sel tadi adalah di membran plasma. Kedua antibiotik
biotic menaikkan sepleoplas lisin dan dengan cepat meningkatkan
permeabilitin pada kalium, yang telah diasosiasikan dengan aktivitas
jamurnya ( Besson dkk, 1984). Kemampuan antibiotic iturin untuk
meningkatkan permeability membrane dan juga mikroorganisme tergantung
pada formasi saluran ion dalam membrane sel. Dalam konteks ini struktur
ke tiga iturin – phospoliphid – sterol disarankan menjadi struktur yang
efisien secara biologis menurut Maget Dana dan Peypoux, 1994.

Perlakuan permal yang berbeda diadakan dengan supernatant dari kultur


tegangan mutan M40, demontrasi termosintasi pencegahan metabolit.
Pertumbuhan zona dihasilkan di piring bassilus cinerea E. Carotovora dan
R. Solanacearum. Merupakan bagi semua supernatant, pada suhu
independent yang subjectif. Hasil kesepakatan dengan termoresisten yang
dilaporkan dari antibiotic inturin dapat dihasilkan oleh bassilus.

Dengan memandang pada daya larut supernatant, mereka membedakan,


meskipun tidak secara signifikan, dari yang didapatkan untuk antibiotic
yang diisolasi dari jenis bacillus yang berbeda. Metabolite diproduksi oleh
tegangan mutan M40 yang larut di air dan methanol. Iturin dan
bacillomycin L larut dalam methanol dan campuran air methanol juga
(Besson dkk, 1977, Peypoux, 1978). Dalam hal ini, Bacillomicyn D tidak
larut dalam air dan kebanyakan soluents organic (Peypoux dkk, 1980).
Antifungal yang baru, antibiotic peptidolipia, iturin AL, diisolasi dari
tegangan B Subtilis, larut dalam methanol dan etanol dan hamper tidak larut
dalam air, cukup meskipun membiarkan deteksnya oleh difusi di agar.
(Winkelmann dkk, 1983). Selanjutnya, Schreiber dkk (1988) diisolasi dari
ulmus amricana, sebuah metabolit 500 D, larut dalam air, methanol, etanol
dan kloroform cukup mirip dengan metabolit antifungsi yang digambarkan
oleh Mckeen (1986).

Strategi isolasi dan pemurnian antibiotic dihasilkan oleh tegangan mutan


m40 yang nerupakan fase kebalikan HPLC. Kromatogram sederhana penting
dalam prosedur ini, hanya tiga puncak yang didapatkan dan aktifitas
antibiotic hanya dalam salah satunya. Prosedur ini telah terlebih dahulu
digunakan untuk memumikN ntibiotik yang lainnya (Azevedo dkk, 1993,
Razafindralambo dkk, 1993, Eshita dkk, 1995, Kajimura dkk, 1995).

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan struktur kimia dari


antibiotic yang dihasilkan oleh tegangan mutan M40 dalam keluarga iturin.
Aspek lain, yang memerlukan pengerjaan lebih lanjut, adalah merupakan
studi yang teliti dalam hal kinetic produksi antibiotic dan pengoptimalan
rancangan media dan pemulihan produk. Lebih banyak pengetahuan
diperlukan dalam mekanisme biokontrol petophatogen untuk
mengembangkan strategi rasional dalam penerapan antagonis dan
metabolitnya dalam agroekosistem. Sekali diuraikan strateginya keahlian
genetic dapat meyediakan cara yang efisien untuk mengumpulkan
karakteristik yang diinginkan dari organisme yang berda-beda hanya satu
organisme secara ekologis diadaptasi ke system tertentu. Hal ini dapat
diselesaikan dengan mengkloning gen biosintesis disebuah organisme
kompeten seperti Rizobium atau anggota Rizospora yang lain.
Pengkloningan gen seperti itu secara langsung ke dalam sel tanaman juga
merupakan pilihan yang menarik. Masih banyak hal yang harus dikerjakan
sebelum sound system dikembangkan untuk melindungi tanaman dari
predator mereka tanpa mengancam kesetimbangan biologis diantara spesies.
Penggunaan bioantagonis sungguh hal yang menjanjikan.