Marcadores Moleculares de ADN

Ctedra de Gentica y Mejoramiento Vegetal y Animal
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Marcadores Moleculares de ADN

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR E

INTRODUCCIN AL MEJORAMIENTO VEGETAL ASISTIDO
La base terica de la reaccin en cadenas de la polimerasa o PCR fue
expuesta en 1971 (Kleppl et al.), pero esta tcnica no produjo demasiado
inters hasta mediados de los aos 80
La tecnologa denominada Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR
(Polymerase Chain Reaction) fue desarrollada por Mullis y colaboradores a
mediados de la dcada del ochenta (Saiki et al., 1985; Mullis y Falcona, 1987).
El impacto causado en la ciencia por esta tecnologa fue tan grande que le
vali el premio Novel de medicina a Kary Mullis en 1993.
La tcnica esta basada en la replicacin in vitro del ADN, e imita el
proceso natural que ocurre en todas las clulas vivas.
Una clula para poder replicar su ADN requiere, entre otras cosas, de
enzimas que desenrollen la estructura de hlice y separen las cadenas del
ADN, una secuencia molde de ADN o templado de simple cadena a copiar, y
enzimas que catalicen la unin de los nucletidos a este ltimo.
Para poder imitar este proceso, la tcnica de PCR aprovecha las
propiedades de desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN y provoca, en
forma artificial, un aumento y descenso alternado de la temperatura (ciclos)
del cctel de reaccin (premix), por medio de un ciclador trmico o
termociclador.
En el cctel de reaccin o premix, se encuentran todos los elementos
necesarios para la replicacin: ADN, oligonucletidos cebadores o "primers",
una ADN polimerasa y nucletidos (dNTPs).
En la primer parte del ciclo, el aumento de la temperatura hasta 95 C,
produce la desnaturalizacin del ADN, es decir la separacin de las dos hebras
de la doble hlice.
En la segunda parte del ciclo comienza a descender la temperatura, lo
que permite la unin de las cadenas de simple hebra a los oligonuclotidos (10
a 30 bases) denominadas primers, que actan como cebadores para el inicio
de la replicacin. La temperatura en la que se produce la unin del primer a la

cadena molde de ADN se conoce como temperatura de annealing, y depende
del largo, de la composicin de bases del primer y oscila entre los 50 y 60 C.
Esta temperatura es mayor que la que permite la unin de las hebras de ADN
separadas (45C), por lo que el primer se hibrida antes con la cadena molde
durante el descenso de temperatura.
A diferencia de la replicacin de ADN celular, en la que los cebadores
reconocidos por la ADN polimerasa son secuencias de ARN, los cebadores
utilizados en la reaccin de PCR son secuencias de ADN.
En la reaccin de PCR, los primers (sintticos) tienen una secuencia que
les permite hibridar, en forma especfica, y amplificar la secuencia compredida
entre dos primers con la secuencia blanco que el usuario quiere amplificar.
Una vez que se produce la hibridacin de los primers, la enzima ADN
polimerasa cataliza la sntesis de una nueva hebra de ADN, incorporando a la
cadena en formacin, a travs de uniones fosfodiester, los nucletidos con las
bases complementarias a la cadena molde.
La enzima responsable de la replicacin en las clulas es la ADN
polimerasa. Esta cataliza la unin del grupo OH-3' del extremo del cebador,
con el grupo fosfato del deoxiribonucesido trifosfato que se incorpora a la
cadena en sntesis a travs de una unin fosfodiester.
En la clula la replicacin ocurren a temperatura constante e intervienen
distintas enzimas que catalizan todas las reacciones y que son sensibles al
aumento de la temperatura ya que, como son protenas, se desnaturalizan y
pierden sus propiedades a los 45C.
En al reaccin de PCR
estos procesos ocurren en un tubo de ensayo
sometido a variaciones de temperatura con un mximo de 95 C, y la

polimerizacin es conducida por una ADN polimerasa llamada Taq polimerasa
obtenida de bacterias termfilas (Thermus aquaticus). Esta enzima tiene su
temperatura ptima de catalizacin a 72 C.
En la utilizacin de esta enzima se bas el gran descubrimiento de Kan
Mullis. Las enzimas utilizadas para la unin de nucletidos en la reaccin de
PCR son obtenidas de bacterias que habitan en aguas termales, y son capaces
de resistir temperaturas tan altas como la necesaria para separar las cadenas
de ADN, es decir 95C. Gracias a esto, el termociclador puede realizar muchos

ciclos de variacin de la temperatura, llegando hasta los 95 C sin que se
desnaturalice la enzima Taq polimerasa, lo que permite obtener millones de
rplicas (amplificacin) de un fragmento de ADN.
Antes del descubrimiento de la
Taq polimerasa, se utilizaba ADN
polimerasa de E. coli, la que se agregaba en cada ciclo a la mezcla de

reaccin, ya que durante el calentamiento a 95 0C, la enzima se degradaba.
Este procedimiento resultaba muy complicado y de difcil ejecucin. Otra de las
ventajas que tiene la Taq polimerasa respecto de la ADN polimerasa de E. Coli
es que su temperatura ptima de polimerizacin es de 72 C. Esto permite
utilizar temperaturas de annealing de los primers ms elevadas, eliminando
amplificaciones no deseadas que se producen por hibridaciones no especficas
de los primers (por ej. autohibridacin) y que se favorecen con la baja
temperatura de polimerizacin (370C) de la enzima de E. Coli.
En la actualidad existen varias empresas que comercializan Taq
polimerasa bajo licencia, y distintas variedades de polimerasas termoestables
de acuerdo a su utilizacin. Algunas son naturales y
otras son protenas
recombinantes, modificadas o no.

Resumiendo, el ciclado al que se somete el cctel de reaccin consiste
en elevar la temperatura hasta 95 C, manteniendo algunos segundos para
que se separen las cadenas del ADN molde. Luego, la temperatura desciende y
se mantiene aproximadamente un minuto a la temperatura de hibridacin del
primer (50-60C)
hibride.
Comienza
para que este encuentre a su regin complementaria e

entonces
un
nuevo
ascenso
de
la
temperatura,
mantenindose 1 a 2 minutos, (dependiendo del largo de cadena a

polimerizar), a 72 C para que la enzima Taq. polimerasa sintetice, en sentido
5'- 3', la nueva cadena, utilizando como molde las cadenas de ADN separadas.
Contina luego el ascenso de temperatura, proceso en que se detiene la
replicacin y, al llegar a los 95C se produce nuevamente la separacin de las
cadenas de ADN.
En los sucesivos ciclos, cada hebra doble cadena generara dos nuevas
cadenas sintetizadas sobre las viejas, originando
nuevos sitios de unin o
annealing para los primers. Esto implica que por cada ciclo se duplica la
cantidad de ADN blanco para la hibridacin de los primers.

El resultado final es que luego de un determinado "n" nmero de ciclos

en el tubo de reaccin existirn 2 n copias de la cadena de ADN por cada
cadena de ADN blanco existente al comienzo de la reaccin. Es decir, en el
ciclo 1, habr 2 copias nuevas de la cadena de ADN, complementarias a las
cadenas molde; en el ciclo 2 habr 4 copias, en el ciclo 10 existirn 1.024
copias, y en el ciclo 20 se tendrn 1.048.576 copias del ADN blanco.
La tcnica de PCR es relativamente simple, verstil, muy rpida y
econmica en comparacin con otras tcnicas de marcadores de ADN,
utilizadas en biologa molecular.
Las cantidades de ADN blanco necesario para producir la amplificacin
dependen de la frecuencia con que se encuentra dicha secuencia en el ADN en

estudio. Si queremos amplificar una regin genmica multicopia (varias copias
del gen en el genoma), bastarn unos pocos nanogramos de ADN total, en
cambio si pretendemos amplificar una regin genmica correspondiente a un
gen de copia nica, la cantidad de ADN total a utilizar puede variar desde los
100 nanogramos a 1 gr.
La reaccin se lleva a cabo en un tubo de microcentrfuga de 500 o de
200 l, segn el diseo del bloque del ciclador trmico. En este tubo se
encuentra la mezcla o premix de ADN, los dos tipos de primers que se unirn
al ADN, sealando el punto de comienzo de la polimerizacin, una mezcla de
los cuatro dexoxiribonuclesidos trifosfatos (dNTPs), buffer, C1 2 Mg (el Mg es
cofactor
de la enzima Taq polimerasa),y una pequea cantidad de Taq
Polimerasa. Una vez que la premix est preparada se lo coloca en el ciclador,

vulgarmente llamado PCR, y se programa con el nmero de ciclos a realizar
(entre 20 y 35), las temperaturas entre las que variar la reaccin y el tiempo
en que se mantendr cada temperatura.
Una vez terminado el programa, la corrida se realiza en
un gel de
agarosa (1,5-2%), con bromuro de etidio.

Optimizacin de las condiciones de reaccin de PCR
La tcnica de PCR tiene mltiples aplicaciones, su utilizacin no tiene
restricciones en cuanto a especies animales o vegetales.
Por su versatilidad, no existe un protocolo que pueda ser aplicado a
todas las situaciones que se presenten en un laboratorio. Cada caso particular
necesitar de una puesta a punto de las metodologas y protocolos, aunque se
pueden considerar una serie de reglas generales acerca de los parmetros a
optimizar para llevar adelante con xito una reaccin de amplificacin.
La hibridacin depende del diseo de los primers (secuencia y largo) y de
las condiciones de reaccin (especialmente la concentracin del Mg+ 2 y la
temperatura). El control de estos factores disminuir las hibridaciones de los
primers en sitios no deseados y la autohibridacin o autoannealing.
La especificidad y la pureza del producto final van a depender de la
frecuencia relativa con que ocurra la extensin de la cadena a partir del primer
en el sitio deseado, versus la que ocurra en una posicin no deseada del ADN
templado.
6

Esencialmente, toda interaccin del primer con el templado lleva a la
obtencin de
productos de extensin cuya especificidad es muy difcil de
controlar durante los primeros ciclos, debido al exceso en molaridad de los

posibles sitios de annealing no deseados del ADN respecto de los sitios
deseados. Por ello es deseable que al menos en los primeros ciclos, las
condiciones de reaccin sean lo ms estrictas posible.
Una vez transcurridos estos primeros ciclos en el cctel de reaccin,
aumenta la molaridad de la secuencia blanco en forma exponencial, lo que
permite que las condiciones de reaccin se alejen un poco de las ideales sin
afectar los siguientes ciclos.
La concentracin de magnesio en la premix es uno de los factores ms
importantes que pueden afectar el comportamiento de la Taq polimerasa
durante la reaccin. Algunos componentes de la reaccin pueden actuar como
agentes quelantes del magnesio, como por ejemplo el EDTA del buffer TE en
que se suele diluir el ADN, los dNTPs y otras protenas, Esto disminuye la
concentracin de magnesio libre en el tubo de reaccin lo que puede llegar a
inactivar a la polimerasa. El uso de una concentracin excesiva de magnesio
reduce la fidelidad de polimerizacin de la enzima. Es importante determinar
en forma emprica la cantidad de magnesio total en el tubo de reaccin con los
reactivos que se usaran y tratar de no variar la forma de preparacin de los
componentes.
Es conveniente hacer, adems de la cuantificacin y caracterizacin del
ADN extrado, una serie de reacciones en la que se vare la concentracin de
Mg-2.
Fig. 1: Gel de corrida para optimizar la concentracin de Mg de la reaccin

Los primers deben tener, en lo posible, una longitud mayor a los 18

nucletidos con
un contenido de G+C entre 40 y 60 % para otorgarles
especificidad restringiendo el nmero de los posibles sitios de hibridacin.

Adems deben tener secuencias que no produzcan estructuras secundarias a
la temperatura de reaccin, como por ejemplo la autohibridacin por
complementariedad
de
las
bases
(los
extremos
3'
no
deben
tener
complementaridad entre ellos). Es conveniente que la temperatura de

annealing de ambos primers sea la misma pero si no es as, se debe elegir la
menor temperatura de annealing .
En el proceso de ajuste de la tcnica tambin se deber considerar la
eleccin de una temperatura de annealing apropiada para cada primer.
La cantidad de ADN molde o templado necesaria para la reaccin
depende de la complejidad y del tipo de secuencia a amplificar. Normalmente
en plantas se utiliza desde 10 ng hasta 200 ng dependiendo del rendimiento
de ADN propio de la tcnica de extraccin y de la especie.
La concentracin de Taq pol. influye en gran medida en los productos
obtenidos en la reaccin. Una alta concentracin no implica una mayor
cantidad de producto amplificado, es decir un mayor nmero de copias de
secuencia blanco. El exceso de Taq pol. y el aumento del tiempo de
polimerizacin (tiempo en que se mantienen los 72 0C) puede provocar
"artefactos" asociados con la actividad exonucleasa 5'--3' intrnseca que posee

la Taq pol. Esto provoca que en el gel de corrida aparezca un chorreado
continuo en lugar de bandas discretas.
Insignificantes cantidades de un plsmido, restos de ADN de otras
reacciones o de nuestras propias clulas pueden ser amplificados. Es
importante entonces evitar las contaminaciones, por ejemplo, utilizando juegos
de micropipetas para uso general del laboratorio y otro para pipetear las
reacciones de PCR, o usando tips con filtro, que previenen los aerosoles que se
producen en la superficie interior del lquido dentro del tips. El uso de guantes
descartables de la contaminacin con clulas epiteliales que se desprenden a
diario de la piel, evitando que las nucleasas de nuestras clulas contaminen la
premix.

RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA (Amplificacin al Azar de ADN
Polimrfico)
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) resulta en la
amplificacin de porciones especficas del ADN templado, mediada por el
agregado de oligonucletidos iniciadores. Este proceso cclico tiene tres pasos
bsicos:
Desnaturalizacin trmica del ADN,
Annealing de los iniciadores al ADN templado
Extensin de los iniciadores por la enzima ADN polimerasa en presencia de

4 dNTPs y CI2Mg.
Los fragmentos de ADN son amplificados exponencialmente durante 25-
45 ciclos, separados por electroforesis y visualizados por el teido con bromuro

de etidio. En un comienzo la reaccin de PCR se lograba con el agregado a la
mezcla de reaccin del fragmento termosensible Klenow (Escherichia coli), en
cada nuevo ciclo.
Posteriormente, con el aislamiento de una enzima termoestable de la
bacteria Thermus aquaticus se pudo automatizar la amplificacin in vtro del
ADN en equipos termocicladores. El desarrollo de esta tecnologa permiti
contar con un nuevo set de
marcadores moleculares para comparar
organismos a nivel de ADN.

Los
marcadores
moleculares
RAPDs
son
obtenidos
tras
la
amplificacin por PCR de segmentos al azar del ADN, utilizando secuencias

arbitrarias de oligonucletidos iniciadores. Williams et al. (1990) fueron los
primeros en utilizar este procedimiento en el mapeo del genoma en
organismos vegetales, acuando el nombre de RAPDs a los productos
obtenidos. Welsh y McClelland (1990) al mismo tiempo desarrollaron esta
metodologa para aplicaciones de fingerprinting denominndolos AP-PCR
(arbitrarily
primed PCR), finalmente Caetano-Anolles
et al. (1991)
los
nombraron DAF (DNA amplification fingerprinting). Las diferencias en la

denominacin de estos marcadores dependen de las condiciones especficas
de la reaccin de amplificacin o de la separacin y deteccin de los productos
amplificados. Los iniciadores arbitrarios usados en RAPDs son usualmente de
10

9-10 pares de bases, con un contenido de GC de 50-80% sin secuencias
palindrmicas. El nmero de fragmentos de ADN amplificados es dependiente
del iniciador y del ADN genmico empleados. Las condiciones de la reaccin de
PCR limitan el tamao de los fragmentos obtenidos entre 100-3000pb.
Las diferencias a nivel de ADN entre individuos pueden deberse a:
1- Cambios de nucletidos que impiden la amplificacin por la
introduccin de un mismatch en el sitio de unin del iniciador,
2- Delecin del sitio de unin del iniciador,
3- Inserciones que aumentan demasiado la distancia entre los sitios de
unin de los iniciadores para permitir la amplificacin y
4- Inserciones o deleciones que cambian el tamao del fragmento
amplificado.
Estos tipos de polimorfismo hacen que los marcadores RAPDs sean
empleados para estudios de diversidad gentica, construccin de mapas
genticos, mapeo de caracteres en poblaciones segregantes, lneas isotnicas
y usando anlisis segregante en bulks, ADN fingerprinting, saturacin de
marcadores en regiones determinadas del genoma, anlisis de germoplasma.
Entre las ventajas de utilizar estos marcadores se encuentran:
1- un set universal de iniciadores puede ser empleado para todas las
especies.
2- no se necesitan sondas de libreras, radioactividad, transferencia de
southern o informacin de la secuencia del iniciador (solamente se requiere la
secuencia del iniciador para transferir la informacin).
3- se requiere muy poca cantidad de ADN templado (usualmente 525ng).
4- deteccin de polimorfismos mltiples
5- simplicidad experimental y el proceso puede ser automatizado.
Entre las limitaciones de estos marcadores se detallan:
la mayora son de herencia dominante
en muchos casos es discutible la reproducibilidad de los patrones de

bandas en experimentos independientes
11

generalmente no son apropiados para detectar diferencias entre
genomas dadas por mutaciones simples o deleciones muy pequeas,
(0,001% del genoma o menos)
En los experimentos de RAPDs, para asegurar la reproducibilidad
de los patrones de bandas, se deben optimizar todos los parmetros, en
particular las concentraciones de ADN, CI2Mg e iniciadores, las condiciones del
ciclado (especialmente la temperatura de annealing), el tipo y cantidad de
ADN polimerasa termoestable y la precisin de las pipetas.
AFLPs
La tcnica denominada AFLP (Amplified Fragment Length Polimorfisms)
desarrollada hace poco tiempo (Vos et al., 1995), se basa en la amplificacin
de fragmentos de restriccin especficos por PCR.
Esta tcnica combina la confiabilidad de los RFLP con la potencia de la
PCR y cabe destacar que la misma ha sido masivamente adoptada por los
investigadores que trabajan en el rea de los marcadores moleculares en
plantas para realizar fingerprinting, mapeo gentico y clonado de genes.
Etapas de la tcnica:
1- Digestin del ADN con EcoRI y Msel y ligacin de los adaptadores
El ADN a utilizar debe ser de buena calidad, tanto en pureza como
en tamao, y debe estar cuantificado con la mayor precisin posible. El ADN
debe ser digerido en forma simultnea con las enzimas EcoRI y Msel en un
buffer en el cual la actividad de ambos enzimas sea alta y no provoque falsos
sitios de corte que influencien en la repetitibilidad de la tcnica. Los extremos
cohesivos dejados por el corte con las enzimas de restriccin se ligan a
pequeos oligonucletidos (de doble cadena y de secuencia conocida) que
poseen los extremos complementarios a estos, teniendo como resultado todo
nuestro ADN flanqueado por oligonucletidos conocidos en tres combinaciones
posibles:
a)AdapEco-ADN-AdapEco.
b)AdapEco-ADN-AdapMse.
c)AdapMse-ADN-AdapMse.
12

Estadsticamente se ha calculado (de acuerdo a la frecuencia de sitios de
corte que pueden existir para las dos enzimas) que la frecuencia de los
distintos fragmentos en tomate es de:
a)1 .000.000
b)200. 000
c)200
2)
Preamplificacin selectiva o PCR +1

En esta reaccin de PCR ocurre la amplificacin selectiva de los
fragmentos del ADN ligado a los adaptadores. Para ello se utilizan primers
complementarios a los adaptadores y que poseen en el extremo 3' una base
nucleotdica ms elegida al azar de modo de amplificar slo un subset de los
fragmentos ligados a los adaptadores.
3) Amplificacin selectiva o PCR +3
En esta reaccin de PCR ocurre la amplificacin selectiva de los
fragmentos del ADN ligado a los adaptadores y luego amplificados en la
preamplificacin (PCR+1). Para ello se utilizan primers cuya secuencia posee
en el extremo 3' dos bases nucleotdicas ms (elegidas al azar) que el primer
utilizado en la preamplificacin, o sea, tres en total.
4) Visualizacin de los productos de amplificacin
Los
productos
de
amplificacin
se
resuelven
en
geles
de
poliacrilamida desnaturalizantes (similares a los geles de secuenciacin). Una

forma de visualizarlos es marcando uno de los primers, ya sea con radioactivo
o con fluorescencia. Otra alternativa es la tincin del ADN con nitrato de plata
y el revelado con carbonato de sodio. En este ltimo caso, las bandas de ADN
aparecen de color gris acero sobre el fondo transparente del gel, lo cual
permite observarlas a simple vista con un transiluminador de luz blanca y
obtener fotografas por contacto.
Microsatlites
Los microsatlites son pequeos segmentos de ADN cuyas
secuencias
consisten en repeticiones en tandem de di, tri o tetra nucletidos. Los
arreglos ms
13

frecuentes en plantas son:
Dinucletidos
AT
Trinucletidos
74%
AG/TC
TAT
24%
AC/TG
1%
CG
0%
27%
TCT
25%
El largo del microsatlite depende del nmero de repeticiones del motivo

y existe gran variabilidad en l, lo que permite la existencia de un elevado
nmero de alelos por locus, llegando a encontrarse hasta 11 alelos. Se
especula
que
dicha
variabilidad
es
generada
por
entrecruzamientos
desiguales.
Para amplificarlos se disean primers a ambos lados del tandem de
repeticiones y
los productos de amplificacin se separar comnmente por
electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Los microsatlites se

visualizan por teido con nitrato de plata o por exposicin en placa
radiogrfica si se utilizan primers con marcado radioactivo.
Interpretacin del perfil de bandas de los marcadores RAPDs y AFLPs para la
caracterizacin de genotipos vegetales.
Toda nueva variedad a ser incorporada al mercado debe cumplir
con los requisitos de diferenciacin, uniformidad y estabilidad. Para ello al
testearlas se intenta una identificacin clara de los cultivares vegetales, como
tambin poder establecer las relaciones genticas existentes entre ellos y de
los nuevos cultivares derivados.
En estos tests se incluyen caracteres morfolgicos y marcadores
moleculares como protenas o a nivel de ADN. Particularmente el anlisis
estadstico de los perfiles de marcadores a nivel de ADN, pertenecientes a
distintos genotipos, usualmente consiste en tres pasos: el primero de ellos
corresponde a la clasificacin del perfil de datos o caracteres a analizar, el
segundo al clculo de las distancias genticas entre pares de genotipos y el
14

tercero a la suma de las relaciones genticas en el total de genotipos, las que
pueden ser esbozadas en un fenograma (Piepho y Laidig, 1997).
Los RAPDs y AFLPs corresponden a un tipo de marcador molecular
utilizado por el perfil de patrn especfico de bandas observadas en un gel. Con
estos marcadores se pueden establecer slo dos fenotipos presencia y
ausencia del producto de amplificacin (banda). Consecuentemente, cada
banda o producto de amplificacin corresponde a un dato binario o tambin
llamado de doble estado (Crisci y Lopez Armengol, 1983).
Para facilitar el tratamiento cuantitativo de estos datos binarios se
determin identificar la presencia de una banda en un genotipo con el nmero
1 y la ausencia de la misma en otro genotipo como 0. Determinndose para
cada amplificacin individual, que la banda ubicada ms cerca del ctodo
fuera designada como carcter 1 y los productos subsecuentes hacia el nodo
2, 3..., a continuacin. Esta designacin debe ser realizada para todas las
bandas obtenidas por cada iniciador y en todos los genotipos analizados.
A
continuacin
se
muestra
una
matriz
de
2x2
con
las
combinaciones posibles que pueden obtenerse al comparar dos genotipos para

un mismo carcter del tipo doble estado.
genotipo A
1
genotipo B 1
1,1 a 1,0 b
0,1 c 0,0 d
Una vez interpretados los perfiles de bandas obtenidos, como caracteres

cuantitativos, se emplearn los productos de amplificacin polimrficos nicos
y compartidos por los genotipos, para la elaboracin de una matriz bsica
binaria, de forma rectangular, que contenga a todas las OTU ("Unidades
Taxonmicas Operativas") en este caso a los genotipos y a los caracteres.
Ejemplo de una matriz bsica binaria de 7 genotipos y 5
caracteres:
15

Para expresar de manera cuantitativa el parecido entre distintos

genotipos existen varios coeficientes de similitud. Estos coeficientes son
operaciones
matemticas
que
permiten
calcular
las
similitudes
las
diferencias entre taxa. A todos ellos se los puede dividir en cuatro grupos: de
distancia1 de correlacin, de asociacin y de similitud probabilstica. El tipo de
estadstico aplicable a un grupo de datos, para el anlisis de las relaciones
genticas entre OTU, depende del tipo de datos evaluados. Especficamente,
los coeficientes de asociacin miden las coincidencias y diferencias en los
estados de los caracteres entre dos OTU. Esta medicin exige caracteres de
tipo doble estado.
Al comparar dos OTU para un carcter doble estado pueden
presentarse cuatro posibilidades (ver matriz 2x2): que las dos OTU presenten
el carcter comparado (caso a), que slo una u otra lo presente (casos b y c), o
bien que el carcter est ausente en ambas (caso d). En la mayora de los
anlisis genticos, con datos doble estado, se utilizan medidas que ignoran, al
comparar dos OTU, la doble ausencia del carcter evaluado (caso d), como
componente a favor de similitud. Los dos coeficientes de asociacin que,
reuniendo stas caractersticas, son ms ampliamente usados como medidas
de similitud en anlisis genticos son: el ndice de Nei (Nei y Li, 1979) y el
ndice de Jaccard (Jaccard, 1908). En la extensa bibliografa de estudio para la
caracterizacin de cultivares vegetales se utilizan indistintamente ambos
ndices con datos provenientes de RAPDs, AFLPs, RFLPs e isoenzimas.
Los ndices de Nei y de Jaccard, se diferencian porque el primero le
otorga un peso doble a la posibilidad de que ambas OTU presenten al carcter
16

comparado. Por ello, ha sido sugerido (Link et al., 1995; Piepho y Laidig, 1997)
que es ms apropiado utilizar para datos de RFLPs e isoenzimas el ndice de
Nei, mientras que para caracteres de RAPDs y AFLPs el ndice de Jaccard. La
razn descripta por Piepho y Laidig (1997), es que los marcadores RAPDs y
AFLPs al ser dominantes determinan la presencia o ausencia de una banda en
cierta posicin, correspondiendo usualmente cada posicin de banda a un
locus.
En cambio, los marcadores RFLPs e isoenzimas por ser codominantes
producen fragmentos de tamaos variables dados por diferentes alelos de un
gen. Por lo tanto, en cultivares idnticos, con marcadores codominantes, el
locus se manifestar
con slo una posicin de banda en el gel, siendo
conveniente darle un peso doble como lo expresa el ndice de Nei.

Es as como la estimacin del parecido taxonmico, con caracteres
RAPDs y AFLPs se realizar comparando los genotipos de a pares mediante el
coeficiente de asociacin de Jaccard (J), los valores de similitud obtenidos con
este estadstico varan entre 0 (mnima similitud) y 1 (mxima similitud):
JXY= n11/(n-n00) = n11 / (n0l+nl0+n11)
Siendo:
n1 1= nmero de bandas de igual peso molecular compartidas por los
individuos x e y
n= nmero de bandas totales.
n00= nmero de bandas presentes en el total y ausentes en los
individuos x e y,
n0l =nmero de bandas ausentes en el individuo x y presentes en el
individuo y
n10= nmero de bandas presentes en el individuo x y ausentes en el
individuo y
Se generar as, a partir de la aplicacin del coeficiente de Jaccard
a la matriz
bsica binaria, una nueva matriz llamada de similitud, de forma
triangular, con los
coeficientes de similitud obtenidos tras la comparacin entre pares de
genotipos.
17

Ejemplo de una matriz de similitud, obtenida tras aplicar el
coeficiente de
Jaccard a la matriz bsica de datos:
A
1,00
0,67 1,00
0,25 0,50 1,00
0,67
1,00 0,25 1,00
0,67 0,50 0,20 0,67 0,25 1,00
0,67
0,25 0
1,00
0,50 0,50 0,67 0,25 0,50 1,00
Para expresar las relaciones taxonmicas entre la totalidad de las

OTU, con la matriz de similitud se practicar una tcnica de agrupamiento
llamada del Ligamiento promedio, utilizndose la media aritmtica no
ponderada
(UPGMA,
"Unweighted
pairgroup
method
using
arithmetic
averages") (Crisci y Lopez Armengol, 1983).

La estructura taxonmica obtenida a partir del anlisis de
agrupamiento practicado a la matriz de similitud se representar grficamente
en una estructura arborescente o fenograma.
Ejemplo del fenograma obtenido aplicando la tcnica UPGMA a la
matriz de similitud:
18

Apunte preparado por la Ing. Martha Lucrecia Bonell (Profesional
Adscripta a la Ctedra de Gentica y Mejoramiento Vegetal y Animal) Ao 2000
19

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