Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

INTRODUCCIN

El colesterol es un esterol (lpido) que se encuentra en los tejidos corporales y en el

plasma sanguneo de los vertebrados. Se presenta en altas concentraciones en el hgado,
mdula espinal, pncreas y cerebro. El nombre de colesterol procede del griego kole
(bilis) y stereos (slido), por haberse identificado por primera vez en los clculos de la
vescula biliar por Michel Eugne Chevreul quien le dio el nombre de colesterina,
trmino que solamente se conserv en el alemn (Cholesterin). Abundan en las grasas
de origen animal.

La frmula qumica del colesterol se representa de 2 formas: C27H46O / C27H45OH.

Es un lpido esteroide, molcula de ciclopentanoperhidrofenantreno (o esterano),
constituida por cuatro Carbociclos condensados o fundidos, denominados A, B, C y D,
que presentan varias sustituciones:
1. Dos radicales metilo en las posiciones C10 y C13
2. Una cadena aliftica ramificada de 8 carbonos en la posicin C17
3. Un grupo hidroxilo en la posicin C3
4. Una insaturacin en los carbonos C5 y C6.

En la molcula de colesterol se puede distinguir una cabeza polar constituida por el

grupo hidroxilo y una cola o porcin no polar formada por el carbociclo de ncleos
condensados y los sustituyentes alifticos. As el colesterol, es una molcula tan
hidrfoba que la solubilidad de colesterol libre en agua es de 10-8 M y, al igual que los
otros lpidos, es bastante soluble en disolventes no polares como el cloroformo
(CHCl3).

Se realiz esta actividad experimental, con el objetivo de cuantificar la concentracin y

absorbancia de colesterol de una muestra problema. Posteriormente se llevaron las 3
muestras; el blanco, el estndar y el problema al espectofotometro para determinar sus
absorbancias cuya propiedad es identificar estas molculas a travs de un haz de luz que
ocasiona un cambio de nivel energtico en los electrones de la muestra, los que al
decaer al estado basal, emiten luz, pudiendo ser registrado por este instrumento. Una
vez con las absorbancias de cada muestra se podr determinar las concentraciones de
colesterol que sern interpretadas segn los parmetros clnicos establecidos.

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OBJETIVOS:
1.

Cuantificar la concentracin de colesterol en una muestra problema.

2.

Evaluar el efecto que puede tener en el organismo elevaciones en los niveles de

colesterol relacionar.

3.

Relacionar los conocimientos tericos con la aplicacin clnica de la prctica.

PARTE EXPERIMENTAL:
Se prepar un estndar con 10 L de colesterol de concentracin 200mg/dl enrazando
con reactivo a 1 ml, una Muestra Problema de la misma manera con una concentracin
de colesterol desconocida, ms el blanco que solo contena 1 ml de reactivo, para
determinar el 0 en el espectrofotometro.

Se Rotularon los 3 tubos y luego se cubrieron con papel para film, se agito cada uno y
se llevaron a incubacin a 37C por 5 minutos. Para finalizar el procedimiento, despus
de incubar se llevaron las muestras el espectrofotmetro y se determinaron las
absorbancias que fueron registradas para ser utilizadas en la formula adjunta en la gua
de laboratorio para la determinacin de la concentracin de la muestra de problema de
colesterol.

RESULTADOS
MUESTRA

| ABSORBANCIA

1. Blanco

|0

2. Estandar

| 1,63 | 0,325 |

| ABSORBANCIADILUIDA|

||

3. Muestra Problema | 0,936 | |

Determinacin de la Concentracin
C= 200 x A muestra (mg/dl) = 576 mg/dl
A Estndar

Inters de la prctica:
Es conocida la relacin existente entre elevados niveles de triacilglicridos y colesterol
en sangre y el desarrollo de arteriosclerosis y enfermedades coronarias. La importancia
de dicha relacin ha hecho prudente la recomendacin de que se reduzca la ingesta de

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grasas al 30-35 por 100 de los requerimientos energticos totales y que se reemplacen
los cidos grasos saturados por los insaturados.

Los lpidos de la dieta estn formados en un 90% de triacilglicridos y el resto son

steres del colesterol, esteroles vegetales, diversos fosfolpidos y otros.

Los lpidos de la dieta que pueden producir mayores riesgos de enfermedades

cardiovasculares son:

Colesterol:
Pertenece a un grupo importante de compuestos conocidos como esteroides. Es
insoluble en agua. Se encuentra en las membranas celulares (exceptuando las clulas
bacterianas). Tambin es un componente principal de la vaina de la mielina, la
membrana lipdica que envuelve a las fibras nerviosas de conduccin rpida, acelerando
el impulso nervioso.

El colesterol es sintetizado en el hgado a partir de cidos grasos saturados y tambin se

obtiene en la dieta.

Triacilglicridos:
Son lpidos compuestos (su molcula presenta dos o ms grupos diferenciados).
Constituyen la forma molecular de reserva energtica ms eficaz de manera que pueden
ser almacenados de esta forma en grandes cantidades de tejido adiposo.

Son altamente insolubles en agua y son hidrolizados enzimticamente por accin de las
lipasas como veremos en el apartado siguiente.

CLASIFICACION DE LAS DISLIPIDEMIAS:

Se utiliza una clasificacin clnica de estas patologas metablicas:
1) Hipercolesterolemia aislada
2) Hipertrigliceridemia aislada
3) Hiperlipidemia mixta
4) Dficit de HDL aislado

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Para cada categora debe agregarse la calificacin de primaria o gentica, o secundaria.

1) Hipercolesterolemia aislada:
Las principales causas genticas son la Hipercolesterolemia Familiar, la
Dislipidemia Familiar Combinada y la Hipercolesterolemia Polignica. Se asocia
a patologas como el hipotiroidismo, el sndrome nefrsico en etapa avanzada y
a la colestasis. Los principales factores ambientales son un consumo excesivo de
colesterol, grasas saturadas y trans-cidos grasos y el uso de andrgenos,
progestgenos y anablicos de origen andrognico.

2) Hipertrigliceridemia aislada:
En general, corresponden a defectos leves a moderados del metabolismo de
VLDL, ya que los defectos severos se expresan como hiperlipidemia mixta,
debido al contenido significativo del colesterol de las VLDL.

Como causas genticas, se reconoce a las Dislipidemias Familiares Combinadas,

los dficit leve de Apo C2 y lipasa liproteica perifrica y la sobre-expresin de
Apo C3. Como causas patolgicas secundarias, a la obesidad, Diabetes y a la
insuficiencia renal y al sndrome nefrsico en etapas tempranas. Como causas
ambientales, al consumo excesivo de hidratos de carbono especialmente
refinados y de alcohol, al uso de betas bloqueadores, estrgenos y diurticos
tiazidicos.

En el Sindrome de Resistencia a la Insulinia e hiperinsulinemia hay incremento

de la sntesis de VLDL y se acelera el catabolismo de las HDL. Este se
encuentra asociado a la obesidad de predominio abdominal y a la diabetes tipo 2
y entre sus componentes existe la dislipidemia que caractersticamente se
expresa como una hipertrigliceridemia con nivel de Col-HDL bajo. Los betas
bloqueadores y diurticos tiazidicos, acentan la resistencia insulnica. En la
diabetes tipo 1 y en la insuficiencia renal pueden encontrarse estas dislipidemias
a causa de una inhibicin del sistema lipasa lipoproteico perifrico.

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Los estrgenos administrados por va oral y el alcohol inducen un incremento de

la sntesis y secrecin de VLDL. Su efecto es dosis dependiente y magnificada
en la presencia de otras condiciones que alteren el metabolismo de las VLDL.
Una dieta rica en fructosa, glucosa, sacarosa o con una alta proporcin de
caloras glucdicas puede inducir hipertrigliceridemia aislada, en especial si hay
coexistencia con otros factores que modifiquen las VLDL.

Con excepcin del alcohol y de los estrgenos, las hipertrigliceridemias cursan

con una reduccin de los niveles del colesterol de HDL, en virtud de la
transferencia de triglicridos de VLDL hacia HDL. Esto incrementa la afinidad
de las HDL por la lipasa heptica, la que las lleva a catabolismo terminal. El
alcohol y los estrgenos estimulan la sntesis de Apo A1 y la sntesis de HDL y
en general, se asocian a elevacin de sus niveles.

3) Hiperlipidemias mixtas:
Pueden tener un origen gentico: Dislipidemia Familiar Combinada, Disbetalipoproteinemia, defectos severos relacionados con dficit de Apo C2 y lipasa
lipoprotena perifrica y por sobre-expresin de Apo C3.

Una de las caractersticas de esta forma de dislipidemia es su multicausalidad,

con concurrencia de factores genticos, patolgicos asociados y ambientales que
interfieren con el metabolismo de las VLDL y LDL. As por ejemplo, se puede
dar un defecto gentico del metabolismo de las VLDL asociado a obesidad o a
diabetes con una dieta alta en grasas saturadas o un paciente con una
hipercolesterolemia familiar que desarrolla una diabetes.

La Disbetalipoproteinemia, tiene una incidencia de 3 a 5 por mil. El defecto

gentico se expresa clnicamente en menos del 10% de los casos, requiriendo
para ello la asociacin con otra condicin que altere el metabolismo de las
VLDL. Tiene un elevado riesgo de cardiopata coronaria precoz y de
ateroesclerosis perifrica. Obedece a un dficit de Apo E, o a la presencia de la
condicin de homozigoto de isoformas Apo E2/E2, por lo que existe un defecto
de la captacin de remanentes de quilomicrones y de VLDL. Se expresa con una

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elevacin de los triglicridos y del colesterol total con una relacin cercana a 1.
Se identifica por una banda ancha que cubre la zona de beta y prebeta en la
electroforesis y en la ultracentrifugacin clsica con separacin de VLDL, LDL
y HDL, el colesterol se encuentra en forma predominantemente en las VLDL. Se
asocia a depsitos lipdicos tisulares (xantoma palmar) y frecuentemente, a
diabetes tipo 2 y a obesidad.

Los defectos severos del sistema lipasa lipoproteico, de Apo C2 y la sobreexpresin de Apo C3, se asocian a dislipidemias mixtas con triglicridos muy
elevados (>1000 mg/dl), quilomicrones en ayunas y colesterol de HDL muy
bajos. Existe una forma que se expresa en la infancia, se asocia a xantomatosis
eruptiva, lipemia retinales y hepatomegalia, que habitualmente no requiere de
una condicin agregada. Existe una forma de expresin en la edad adulta
asociada con alta frecuencia a diabetes tipo 2, obesidad y alcoholismo. Tanto la
forma infantil como la del adulto conllevan un elevado riesgo de pancreatitis
aguda. No existen evidencias concluyentes acerca del riesgo cardiovascular de
las formas infantiles, lo que es difcil de demostrar por su baja frecuencia. En
cambio, existe acuerdo que las formas del adulto significan un elevado riesgo de
cardiopata coronaria.

4) Dficit aislado de HDL

Un nivel de colesterol de HDL igual o inferior a 35 mg/dl significa un factor de
riesgo independiente de cardiopata coronaria. La reduccin de los niveles del CHDL puede resultar de un defecto de la sntesis de Apo A o de una aceleracin
de su catabolismo por un mayor contenido de triglicridos, producto de una
transferencia desde VLDL cuando stas estn elevadas.

Aunque existen el dficit de C-HDL aislado la gran mayora de los casos se

observa en las hipertrigliceridemias aisladas o hiperlipidemias mixtas. Si bien
los defectos genticos son infrecuentes, se presentan asociados a una cardiopata
coronaria precoz, con niveles de colesterol de HDL bajo 25 mg/dl. La
interrelacin entre triglicridos altos y C-HDL bajos, se expresa a niveles de
triglicridos inferiores a los niveles considerados aceptables para cada categora

Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

de riesgo cardiovascular global y no es infrecuente encontrar un nivel del CHDL igual o bajo 35 mg/dl y triglicridos en rangos aceptables.

En aquellos casos en que se sospecha una reduccin de los niveles de C-HDL

dependiente de una alteracin del metabolismo de las VLDL, todos los factores
ya discutidos, como obesidad, diabetes, consumo excesivo de glcidos, beta
bloqueadores, diurticos tiazidicos pueden estn involucrados en su expresin.

3) Qu otro tipo de ensayo se lleva a cabo para determinar dislipidemias?

Diagnstico clnico:
Se basa en las alteraciones de los niveles sricos, de las lipoprotenas y de sus
lpidos y/o de la presencia de depsitos de ellos en la piel y tendones. La
determinacin cuantitativa de las lipoprotenas es compleja, de tal manera que el
diagnstico se hace con la evaluacin de sus lpidos componentes.

Lpidos Sricos:
1) Test de quilomicrones: El suero obtenido en condiciones de ayuno de 12
horas, se deja reposar durante 24 horas a 4o C. Cuando existen
quilomicrones aparece un sobrenadante cremoso en su superficie. En
condiciones normales este test es negativo.

2) Colesterol total: Su determinacin refleja el contenido de colesterol de todas

las fracciones lipoprotenas.
3) Triglicridos: Refleja el contenido de triglicridos de todas las fracciones
lipoproteicas.
4) Colesterol de HDL: La precipitacin qumica de las VLDL, IDL y LDL y la
ulterior determinacin del colesterol en el sobrenadante, permite cuantificar
el colesterol de esta fraccin.
5) Relacin Colesterol total/Colesterol HDL (C-total/C-HDL): Utilizando la
medicin del colesterol total y la del colesterol de HDL, se puede estimar

Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

esta relacin cuyo valor deseable como ndice de riesgo cardiovascular debe
ser menor de 4,5.
6) Determinacin semicuantitativa de Colesterol de LDL y de VLDL: Se estima
el colesterol de LDL, utilizando la frmula de Friedewald.
C-LDL = C-Total - (Triglicridos + C-HDL) 5

Todo ello expresado en mg/dl y siempre que los niveles de triglicridos sean
menores de 400 mg/dl. El C-LDL es considerado el mejor indicador clnico de
riesgo cardiovascular.

7) Electroforesis de Lipoprotenas: Mtodo semicuantitativo que permite

identificar la distribucin porcentual de las distintas fracciones lipoprotenas
e identificar la aparicin de quilomicrones, de remanentes de quilomicrones
y de IDL. En el individuo sano, se identifican 3 bandas: beta lipoprotenas
(LDL), prebetalipoprotenas (VLDL) y las alfa lipoprotenas (HDL). El
predominio porcentual de una de ellas, puede identificar el defecto
metablico. La aparicin de una banda en el punto de aplicacin corresponde
a la presencia de quilomicrones, lo que es patolgico en condiciones de
ayuno. La aparicin de una banda ancha que abarca beta y probeta es
sugerente de un acmulo anormal de IDL y/o de remanentes de
quilomicrones.

8) Ultracentrifugacin: En la prctica slo se utiliza para investigacin. Permite

separar las distintas fracciones lipoprotecas y cuantificar sus componentes e
identificar las elevaciones anormales de algunas lipoprotenas (IDL y/o
remanentes de quilomicrones).

Xantomas cutneos y tendinosos: Un porcentaje de las dislipidemias,

especialmente las ms severas, se manifiestan por depsitos
(xantomas) cutneos y tendinosos. Dentro de stos deben destacarse:

Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

Xantelasmas: placas solevantadas de color amarillento, ubicadas en

los prpados, pudiendo comprometer toda el rea orbital.

Xantomas eruptivos: se manifiestan como ndulos cutneos, aislados

o mltiples, de tamao variable (1 a 10 mm), de colores rojoamarillento, ubicados de preferencia en reas de flexin y en la
regin gltea.

Xantomas tuberosos: se manifiestan como tumoraciones, que pueden

llegar a tener un tamao de varios centmetros, de consistencia dura,
adheridos a planos profundos, con cambios variables de la piel
circundante y se ubican de preferencia en superficies de extensin del
codo y rodilla.

Xantomas tendinosos: afectan de preferencia al tendn de Aquiles y a

los tendones extensores de la mano. Se manifiestan como ndulos
duros en el trayecto tendinoso y en especial en la regin aquilina, con
engrosamiento y deformacin de la zona de insercin inferior.

Xantomas palmares: se manifiestan como placas y lneas sub

epidrmicas de color amarillento en la palma de las manos. - Arco
corneal: en los pacientes con hipercolesterolemias severas se observa
un arco bien delimitado que es patolgico en menores de 40 aos.

DETERMINACIN DE HDL Y LDL.

INTERES DE LA PRCTICA:
Desde el punto de vista clnico, se ha atribuido a determinadas lipoprotenas el papel de
factores esenciales directos en el desarrollo o en la prevencin de las enfermedades
cardiovasculares. De hecho, un incremento en los niveles plasmticos del colesterol
asociado a una de estas lipoprotenas, las LDL o de baja densidad, significa un mayor
riesgo de padecer coronopatia, como principal manifestacin de enfermedad
cardiovascular, mientras que un incremento del colesterol plasmtico asociado a las
lipoprotenas de alta densidad (HDL) supone una disminucin de dicho riesgo.

Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

Las lipoprotenas son esfricas, con una parte interior de naturaleza hidrofbica y
oleosa, y constituida por lpidos apolares (esteres del colesterol y triacilgliceridos),
recubiertos por una monocapa de lpidos anfipticos (fosfolpidos y colesterol libre),
que como tales tienen caractersticas detergentes, y por las apoproteinas especficas.

La unin de los lpidos del ncleo a la superficie exterior de fosfolpidos y apoproteinas

no es covalente, sino mediante puentes de hidrogeno y fuerzas de Van der Waals, lo que
hace que sea relativamente lbil y permita el intercambio de lpidos y apoproteinas entre
las distintas lipoprotenas sricas y entre stas y los tejidos.

Los distintos tipos de lipoprotenas son:

Quilomicrones: transportan triglicridos.
VLDL o lipoprotenas de muy baja densidad: transportan triglicridos.
LDL o lipoprotenas de densidad intermedia: Transportan colesterol.
HDL o lipoprotenas de alta densidad: Transportan colesterol.

La diferencia existente entre Las VLDL y Los quilomicrones se debe a que las VLDL
transportan triglicridos endgenos y los quilomicrones transportan triglicridos de la
dieta. Adems los quilomicrones son ms pequeos que las VLDL, y los quilomicrones
presentan menor cantidad de protenas. Debido a que los triglicridos de la dieta son
transportados por los quilomicrones y cuando se le realiza a un individuo un anlisis de
sangre este est en ayunas, esto quiere decir que los triglicridos medidos proceden de
las VLDL.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA UTILIZADA:

Para observar la existencia de HDL en las muestras; se utiliza el mtodo de
precipitacin.
Este mtodo consiste en la precipitacin de las lipoprotenas VLDL y LDL quedando en
el sobrenadante las HDL. Para ello, se utiliza una solucin de cido fosfotugstico que
precipita a las VLDL y a las LDL debido a la presencia de la apoprotena B-100 en ellas
mientras que en las HDL no se encuentran estas apoprotenas pero s la A-I y A-II.

La apoproteina A-I es la ms abundante dentro de las HDL mientras que La A-II es la

segunda ms abundante. La primera se sintetiza en el intestino y en el hgado. La

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Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

intestinal sale a la circulacin asociada a los quilomicrones pero una en la sangre es

transferida alas HDL, mientras que la heptica sale directamente a la circulacin unida a
las partculas nacientes de HDL, constituyendo una parte estructural fundamental de
estas lipoprotenas.

La apo B es una apoproteina cuya estructura no es bien conocida debido a su gran

tamao, a su alta insolubilidad en medio acuoso y a que forma agregados y se oxida con
facilidad. Existen en dos formas, La B-100 y la B-48 como la que nos incumbe es la B100 se ahondara en su estudio.

La apo B-100 es una protena de 4536 aminocidos que se sintetiza en el hgado, y se

encuentra en las VLDL, IDL y LDL. Esta apoprotena constituye el factor de
reconocimiento de las LDL por receptores especficos que se encuentran tanto en el
higado como en tejido extra hepticos, y de esta forma desempea un papel fundamental
en la captacin del colesterol transportado en dichas lipoprotenas en los tejidos.

Existen varios tipos ms de apoproteinas que son la apo-C, apo-E, apo-D y apo-F.

Para realizar la precipitacin se utiliz como reactivo cido fosfotugstico 0,44 mM;
MgCl2 20 mM.

PROTOCOLO:
Para realizar la medicin de la precipitacin se utiliza la tcnica de espectrofotometra
donde las muestras en este caso se van a poner en tubos.

Para realizar la precipitacin se hicieron los siguientes pasos:

Se coge de la nevera un eppendorf que contiene control patolgico de HDL adems

tambin se coge los tubos con las tres muestras utilizadas en las determinaciones
anteriores. El control de HDL se utiliza al igual que el control patolgico de las
determinaciones anteriores donde si cae dentro del intervalo de confianza propio para
HDL, la medicin puede continuar.

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Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

Se pipetean con micro pipeta en cuatro eppendorf 100 de las 3 muestras y del control
de HDL (uno por cada sustrato), despus se le aade la solucin precipitante (250
l), al aadir estos volmenes se ha realizado una dilucin
que a la hora de medir se debe tener en cuenta es decir se tiene un factor de dilucin que
ser de 3,5 ya que se parte de 100

l y se llega a 350 l. Se

agita los cuatro eppendorf en vortex durante 10 segundos y se deja incubar durante 10
minutos.

Despus de los 10 minutos, se dejan otros 10 minutos dentro una centrifugadora donde
al sacar los eppendorf se observara un sobrenadante donde se encuentran las HDL y una
parte slida en el fondo del eppendorf donde estarn las LDL y VLDL.

El sobrenadante donde se encuentran las HDL se extrae de los eppendorf 250

l por cada uno de ellos y se pasan a otros eppendorf.

Ahora, primero se coge de la nevera el blanco, el calibrador y el control patolgico que

va a tener la misma utilidad que en las determinaciones de colesterol y triglicridos. La
medicin se realizara por duplicado al utilizar tubos. Se debe poner por cada tubo un
sustrato es decir 15

l de blanco, calibrador, control

patolgico, control de HDL y las tres muestras adems de 1 ml de solucin de colesterol

que presenta la misma utilidad que en las determinaciones anteriores.

Los tubos son llevados al espectrofotmetro que da los valores de absorbancia y

concentracin que ayudan a hallar la cantidad de colesterol que hay en las muestras,
cuyos datos sern explicados en apartados siguientes.

DISCUSIN:
Se determin la concentracin de colesterol de la muestra problema utilizando la
formula antes mencionada, lo que arrojo un valor de 576 mg/dl, lo que se interpreta
clnicamente como un nivel elevado de colesterol lo que conlleva a un aumento en el
riesgo de enfermedades coronarias, hipertensin arterial, aterosclerosis entre otras.

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Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

CONCLUSIN:
Tras obtener los resultados en el laboratorio, pudimos concluir que niveles elevados de
colesterol son un factor que aumenta la incidencia de patologas crnicas no
transmisibles como la hipertensin arterial, aterosclerosis, dislipidemia y enfermedades
coronarias. Adems es importante recalcar que el conocimiento de las tcnicas de
determinacin de valores de las concentraciones de colesterol o cualquier otra molcula
y su interpretacin clnica permiten y contribuyen a una formacin integral como
futuros mdicos y al buen ejercicio de la Medicina.

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Determinacin de colesterol mtodo espectrofotomtrico

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