MATERIALES Y MTODOS

1.

SD

1.1. MATERIALES.
1.1.1.

INSUMOS.

Agua Destilada

Efluente Cianurado

1.1.2.

1.1.3.

1.1.4.

AGENTES BIOLGICO

Fusarium solani var Minus ATCC26671.

Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC17440.

REACTIVOS QUMICOS

KCN.

NaOH 1N.

HCl 1N.

NaCl

Etanol

MATERIAL DE LABORATORIO

Placas Petri

Balones de 250ml

Cmara de Newbauer

Porta objetos

Cubre objetos

Pipetas

Micropipetas

1.1.5.

Propipeteadores

Tubos de ensayo

Matraces

Probetas

Fiolas

Bikers

Picetas

Mechero

Gradillas

Termmetro

Asa microbiana

Guantes

Algodn

EQUIPOS

Balanza

Potencimetro

Microscpio

Shaker

Estufa

Bao Mara

Centrfuga

Refrigerador

Cocina Elctrica

Autoclave

1.2. MTODOS.
1.2.1.

RECOLECCIN DE LA MUESTRA CIANURADA.

Las muestras fueron obtenidas a partir del efluente lquido de la poza de solucin
pobre (barrent), evacuada de la planta de beneficio de la Minera Paraso S.A.C.
como resultado del proceso de cianuracin de minerales de oro procedentes de

las pozas de vat leaching donde empieza el proceso de cianuracin de los pellets.
Se tomaron dos litros de la muestra a tratar en envases hermticos y rotulados,
evitando la recoleccin de slidos procedentes del proceso que predomina en la
relavera, utilizando guantes y mascaras como implementos de seguridad. Las
muestras fueron almacenadas a 4C, para mantener su estabilidad y su
composicin qumica al momento de la toma de muestra (Alpaca, 2003).
1.2.2.

CURVA DE CALIBRACIN DE CN-

Se obtuvo un sotck de CNK a 100ppm (100mg CNK L -1), pesando 10+- .mg de
CNK y enrazado en una fiola de 100ml con agua destilada desionizada, la
solucin homognea se guard en una botella mbar de boca estrecha, que sirvi
para la determinacin de la curva de calibracin, elaborando soluciones estndar
en tubos de ensayo cuyas concentraciones de 0, 0.05, 0.1, 0.5 y 1ppm se
efectuaron a partir de la solucin stock de CNK 100ppm utilizando la formula
V1xC1 = V2xC2, para obtener un volumen final de 5ml (Merck KGaA. 2001).
Para determinar la concentracin de cianuro se empleo el KIT Spectroquant
1.14800.0001 0001 (procedimiento anlogo a EPA 335.2 e ISO 6703), siguiendo
las instrucciones de la compaa.fabricante, que establece que para 5ml de
muestra se aadi 1 microcuchara del reactivo A (350mg del agente clorante), 1
microcuchara del reactivo B (20mg de cido 1,3-dimetilbarbiturico) y 3 gotas del
reactivo C (piridina), siendo necesario la disolucin completa de cada reactivo en
cada paso, trascurrido el tiempo de reaccin (5 minutos), las muestras fueron
llevadas a un espectrofotometro para obtener absorbancias a 586nm.
Los resultados de las cuatro repeticiones fueron trasferidos a una curva de
calibracin, donde las absorbancias obtenidas se colocaron en el eje de las
ordenadas y las concentraciones de los estndares en el eje de las abscisas, de
esta forma se obtuvo la ecuacin de la recta que se utilizo para la determinacin
de CN- en los relaves y los bioensayos.
1.2.3.

DETERMINACIN

DE

LA

CONCENTRACIN

DE

CN-

PROCEDENTES DE LOS RELAVES DE LA MINERA PARASO.

Debido a que la composicin de muestra no era traslucida, inmediatamente

despus de ser agitada para homogenizar su composicin, se observaron
partculas en suspensin.
Para evitar este inconveniente, se tom 1ml de la muestra en un eppendorf y se
centrifug a 10 000rpm por 10min, del sobrenadante se tom 25l que se diluyo
en 1ml de agua destilada, luego de homogenizada, se tomaron dos muestras de
25l y 50l para proceder a determinar la concentracin de CN -, utilizando el KIT
Spectroquant siguiendo las instrucciones de la compaa especificadas
anteriormente. Para obtener los datos en ppm, las absorbancias se sustituyeron
en la ecuacin de la recta patrn.
1.2.4.

ACTIVACIN

CARACTERIZACIN

DE

Pseudomonas

pseudoalcaligenes ATCC17440.
La activacin de Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC17440 como se indica en
el manual de instrucciones del liofilizado, en condiciones estriles, fue inoculado
en 200ml de caldo nutritivo (que contena 5g de peptona, 3g de extracto de carne
y 15g de agar por litro de agua destilada) a 25C y dejado en agitacin durante
toda la noche.
La siembra en placas con agar nutritivo se realiz, con un inculo de 0.1ml, luego
de 24 horas a 25C, para obtener colonias que fueron utilizadas para realizar un
frotis sobre un portaobjetos de vidrio con una gota de agua destilada, trasfiriendo
una pequea cantidad del cultivo con un asa microbiana previamente esterilizada.
La suspensin formada fue pasada por la zona azul de la llama baja del mechero
hasta que el portaobjetos estuviera caliente y el agua se vaporizara, para
proseguir a colocar cristal violeta, trascurrido un minuto, el exceso fue lavado con
agua, el frotis se cubri con lugol por un minuto, lavando el exceso, la muestra se
decolor alcohol/acetona durante 30 segundos, para proseguir a lavar la muestra
se aplico safranina por un minuto, con abundante agua se lavo el colorante de
contraste, una vez seca la preparacin se observ al microscopio con aumentos
de 10X, 40X y 100X con aceite de inmersin (Koneman et al.,1997), para
examinar la morfologa microscpica de esta bacteria.

1.2.5.

ACTIVACIN Y CARACTERIZACIN DE Fusarium solani VAR

minus ATCC26671

Como sealaba el manual de instrucciones, para Fusarium solani var Minus

ATCC26671, en condiciones estriles, frente a un mechero se procedi a inocular
una pequea cantidad del material en un matraz conteniendo medio nutritivo, el
cual fue llevado a agitacin durante toda la noche a 25C, del mismo modo se
sembr en placas petri con agar de dextrosa y papa (que contena 20g de
dextrosa, 15g de agar por litro de infusin de papa), luego de cinco das de
crecimiento a 25C con una pipeta Pasteur se coloc una gota de azul de
lactofenol sobre un porta objetos, trasfiriendo una pequea porcin de filamentos,
extendindolo suavemente sobre una gota del colorante, se coloc una lmina
cubreobjetos y se presiono suavemente para expulsar las pequeas burbujas que
se formaban y llevar la muestra al microscopio utilizando objetivos de 10X, 40X,
100X y aceite de inmercin y distinguir las estructuras microscpicas del hongo
(Leslie J, et al., 2006.)
1.2.6.

PREPARACIN

DE

MUESTRAS

PARA

MICROSCOPIA

ELECTRNICA DE BARRIDO (MEB)

Se tomo una colonia representativa de P. pseudoalcaligenes para traspasarla a
un portaobjetos y lavar la muestra con PBS, posteriormente fue fijada con
glutaraldehido al 2% en PBS (buffer salino fosfato) a un pH 7.4, durante una hora,
luego la muestra se lav con PBS, para proceder a deshidratar la muestra con
alcoholes de 50%, 70%, 90% y 99.9%.
Terminado el procedimiento las muestras fueron llevadas al MEB para su
observacin. En el caso de F. solani, se procedi de la misma manera, variando el
tiempo de fijacin con glutaraldehido a 3 horas.

1.2.7.

OBTENCIN DEL INCULO FNGICO Y BACTERIAL.

De cada cepa se tomaron 10ml de la muestra activada, se inocularon en 90ml de

caldo nutritivo, llevado a agitacin 120 rpm en un shaker a 25C, al termino de las

primeras 24 horas se agregaron 200 l de una solucin concentrada de CNK

(5000 ppm) para obtener una concentracin final en el medio de 10ppm, para
inducir las clulas de ambos microorganismos a la actividad cianuro degradante.
Finalizadas las 72 horas se midi la absorbancia en un espectrofotmetro con
una celda de vidrio a 600nm, obteniendo una absorbancia de 0.8 (Del Carpio H,
et al., 2006).
1.2.8.

BIOENSAYOS

Los ensayos de biodegradacin se realizaron utilizando cianuro presente en el

residuo minero convenientemente diluido, llamado solucin real. La concentracin
de CN- inicial fue llevada a 50 y 100ppm, rangos de CN- que suelen ser
reportados en la mayora de canchas de relaves (Quiroz., 1998, Logsdon et al,
2001). Los matrases fueron agitados en un shaker a 120rpm, se escogi el pH
alcalino de 10, porque pareci ser el ms atractivo ? para las condiciones
experimentales, el cual se mantuvo constante para limitar la formacin de HCN y
demostrar la habilidad de los microorganismos que biodegradan cianuro
(Dumestre A, et al., 1997), por 5 das a 25C (Ezzi M et al., 2005, Campos M et
al., 2006). Las muestras fueron recolectadas cada 12 horas y congeladas para la
determinacin de cianuro residual e incremento de biomasa al finalizar el ensayo.
En este experimento no se incluye fuente alguna de azcar, debido a la reaccin
que existe entre el cianuro y los azucares reductores.
1.2.9.

MEDIDA DE CRECIMIENTO CELULAR.

El crecimiento fungal y bacterial fue derterminado al termino de las 96 horas que

duraron los bioensayos, para ello se procedi a descongelar las muestras con
ayuda de un bao mara, que fueron recolectadas cada 12 horas, para determinar
la biomasa por turbimetria utilizando un espectrofotmetro con una longitud de
honda de 600nm, contrastando los resultados con un blanco que consista solo en
medio real.

1.2.10.

DETERMINACIN DE CN- RESIDUAL DE LOS BIOENSAYOS.

Las muestras para esta determinacin fueron tomadas cada 12 horas., luego de
colectar las muestras de una semana se procedi a la determinacin de cianuro
residual en el medio real, utilizando el kit espectroquant segn la indicacin
descrita lneas arriba, los resultados obtenidos fueron restados de la absorbancia
que se obtena del blanco que consista los reactivos del kit disueltos en agua
destilada y convertidos en ppm como se describe en el punto 2.2.2.

1.2.11.

DETERMINACIN DE LA RELACIN Yx s

Conforme las clulas crecen existe, como regla general, una relacin lineal entre
la cantidad de biomasa producida y la cantidad de sustrato consumido. Esta
relacin se expresa cuantitativamente utilizando el rendimiento de biomasa

Yx

(Doran P. 1995):

mg de clulas producidas
mg de sustrato consumido

Para ello fue necesario calcular el peso seco de cada muestra, obtenido por
diferencia de peso, tomando 1ml del cultivo filtrado a travs de papel filtro lento
previamente pesado Este se introdujo en una estufa a 80C y se volvi a pesar
luego de 24h. Para obtener los resultados del sustrato consumido fue necesario
restar la concentracin inicial de la concentracin residual (Luque. 2005).
1.2.12.

CINETICA DE BIODEGRADACIN.

Para determinar la cintica de ambos microorganismos durante las fases de

crecimiento. Suponiendo que la velocidad de crecimiento (Doran P. 1995),
corresponde a una cintica de primer orden para la fase exponencial de
crecimiento (rx =X), y teniendo en cuenta que hasta las 96 horas
aproximadamente no existen limitaciones al crecimiento, salvo la propia
concentracin de microorganismos viables, se puede considerar que mx,
siendo mx la velocidad la velocidad especfica mxima de crecimiento de la
poblacin. De esta forma, una vez integrado el balance de clulas viables,
despreciando la muerte celular, se obtiene (Luque. 2005):

 X
Xi

l n

mx t

1.2.13.

TIEMPO DE DUPLICACIN.

Las velocidades decrecimiento celular se expresan generalmente en trminos de

tiempo de duplicacin td. Empezando con una concentracin de clulas iniciales,
la concentracin a t = td es 2Xi, sustituyendo estos valores tenemos que el tiempo
de duplicacin es (Doran P. 1995):

td

1.2.14.

ln 2

ANALISIS ESTADSTICOS.

Se utiliz la prueba estadstica de Anlisis de Varianza para analizar si los

distintos tratamientos presentan diferencias significativas. Si los resultados
presentaron diferencias significativas, se examin si alguno de los tratamientos
fueron similares. Para este fin se utiliz la prueba de contraste de Tukey. La
significancia utilizada fue de P<0.01, ya que la prueba de Tukey es de alta
significancia. Esta prueba se realiz tanto para la prueba de variacin de la
concentracin de CN- a 50ppm y 100ppm y el uso de microorganismos puros y
asociados.
Las pruebas estadstica fueron realizadas en el programa SPSS 15.0 y los
grficos fueron efectuados con los programas Statistica 98 Edition y Prisma 4.0.

1.2.15.

DIAGRAMA DE FLUJO.
INICIO

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

OBJETIVO DE LA INVESTIGACIN

INVESTIGACIN BIBLIOGRAFICA

RECOLECCIN

CLASIFICACIN

SELECCIN DEL
MATERIAL
No
El Si
material es
correcto?

PLANIFICACIN EXPERIMENTAL

DETEMINACIN DE LOS MTODOS

EXPERIMENTALES

EJECUCIN DE LA EXPERIMENTACIN

ANLISIS Y EVALUACIN DE LOS

RESULTADOS

ELABORACIN DEL INFORME FINAL

FINAL

EVALUACIN