EVALUACINDELOSMTODOSDEUNINA
RECEPTORESPROTEICOSPARALADETECCINDE
ANTIBITICOSENLALECHECRUDADECABRA
TesisdeMaster
Valencia,Julio2012
DarjanivaFernndezMolina
DirectoraAcadmica:
MPilarMolinaPons
DirectoraExperimental:
MCarmenBeltrnMartnez
EstetrabajoformapartedelproyectoAGL200911524financiadoporelMinisteriode
CienciaeInnovacin
AGRADECIMIENTOS
ADiosyalaVirgen,porvivirenmicorazn,guiarmicaminoydarmevidaysaludparapoder
realizarmismetas.
Alosngelesquedesdeelcielomecuidanymeprotegen:Abuelos,tos,Sr.Armando.
AmisViejosMagdielyDarjaniva,ymishermanosMagdielyBrbara,nadadeestohubiese
sidoposiblesinUds.Graciasporsuinmensoapoyo,entrega,poreseamorconsentidorinigualable
que me dan, por cada palabra de nimo, por tener confianza en m y creer en mis sueos. Son el
mejorejemploaseguir.LosAmo.
ALuisAlejandro,porsuinmensoapoyoycompaaapesardeladistancia.Graciasporlograr
reducirconamoresoskmquenoseparan.
AlaUPV,porlaoportunidaddeserunaestudiantedetanprestigiosacasadeestudios.
Amidirectora,PilarMolinaPons,porsusconocimientosydedicacin.
ACristofolPeris,porsuapoyo.
AmisamigoshechosenEspaa:Ignacio,Carlos,Dyana,Hernn,JuanPabloyPaula,porsu
amistadinigualable,compaayapoyo.
AtodosmiscompaerosdelDepartamentodeCienciaAnimal:Tamara,Mila,Ion...
Graciaschicos!
RESUMEN
En los ltimos aos la calidad de la leche de cabra ha cobrado mayor relevancia, ya que la
industria exige una materia prima con caractersticas adecuadas para su transformacin, as como
porunamayorexigenciadelosconsumidores.
Debidoalaimportanciadelapresenciaderesiduosdemedicamentosenlalechetantopara
la salud pblica como para los procesos tecnolgicos de fabricacin de productos lcteos, la
legislacineuropeaestableceunaseriedecontrolessobreladeteccindeinhibidoresenlalechea
niveldeexplotacionesganaderas,centroslcteosylaboratoriosacreditados.
Los mtodos empleados en estos controles han sido desarrollados para leche de vaca y la
informacin es muy limitada para leche de otras especies, por lo que se consider interesante
realizarunestudiodeevaluacindelosmtodosdeuninareceptoresproteicosmsempleadosen
Espaa(CharmMRLBL/TET,BetaStarCombo,SNAPBetalactam,SNAPTetracycline,SNAPGentamicin
yTwinsensor BT)conlechecrudadecabra,enbasealaespecificidad(falsospositivos),capacidadde
deteccin(CC)deantibticosbetalactmicosytetraciclinasyelefectodelconservanteazidiolsobre
larespuestadeestosmtodosdecontrol.
Enelestudiodeespecificidad(resultadosnegativos/totalesx100)seanalizaronuntotalde350
Los mtodos de unin a receptores proteicos con muestras individuales de leche de cabra
ParacalcularlaCapacidaddedeteccin(CC)delosmtodosconsiderados,seanalizenprimer
CC era mayor que el LMR establecido para la sustancia en cuestin. Los LMR utilizados en este
estudiofueronlosestablecidosporlalegislacineuropeaenelReglamento(UE)37/2010.
La Capacidad de deteccin (CC) de los mtodos de unin a receptores proteicos para los
antibiticosbetalactmicosytetraciclinasenmuestrasindividualesdelechedecabra,varasegnel
mtodo y la sustancia evaluada. Para los betalactmicos, el SNAP Betalactam y el TwinsensorBT
mostraronsercapacesdedetectartodoslosantibiticosanalizadosanivelesinferioresoigualesal
LMR,mientrasqueelCharmMRLBL/TETnofuecapazdedetectarlacloxacilinaalLMRyelBetaStar
Combonilacefalexinanielceftiofur.Paraelgrupodelastetraciclinas,elmtodoCharmMRLBL/TET
detecttodaslassustanciasanalizadasanivelesinferioresalLMR,mientrasquelosmtodosSNAP
Tetracycline, BetaStar Combo y TwinsensorBT no fueron capaces de detectar la presencia de
clortetraciclinaaunaconcentracinequivalentealLMR.
Para evaluar el efecto del conservante azidiol sobre la respuesta de los mtodos de unin a
receptoresproteicos,seutilizaron20muestrasindividualesdelechedecabralibresdeantibiticos.
Lasmuestrasdelechesedividieronendosalcuotas,unasinconservanteyotraconazidiol,quese
analizaron con cada uno de los mtodos considerados. Posteriormente, las mismas muestras de
leche fueron adicionadas de penicilina G y oxitetraciclina en concentraciones equivalentes al LMR
(4g/Kg y 100g/Kg, respectivamente) y se analizaron nuevamente con los mtodos de cribado
seleccionados.
El conservante azidiol no tuvo ningn efecto sobre la respuesta de los mtodos de unin a
receptores proteicos evaluados (Charm MRL BL/TET, BetaStar Combo, SNAP y TwinsensorBT) con
muestrasindividualesdelechedecabraadicionadasonodeantibitico.Sinembargo,enelmtodo
SNAPBetalactamseobservquealagregarazidiolalasmuestrasdeleche,seretrasabalaaparicin
de los puntos de lectura lo que obliga a prolongar el tiempo de anlisis. Adems, la intensidad de
dichospuntosfuemenorenlasmuestrasdelecheadicionadasdeconservante.
Seguridad Alimentaria, es conveniente continuar con los estudios sobre mtodos de deteccin de
residuosdeantimicrobianos,afindeevitarlallegadadelechedecabraconresiduosdeantibiticos
alacadenaalimenticia.
ndicces
ndices
INDICEGENERAL
Pg.
I.INTRODUCCIN
1.LaCalidaddelalechedecabra
1.1AspectosGenerales
1.2Caractersticasfsicoqumicasycomposicindelalechedecabra
1.3Calidadhiginicosanitariadelalechedecabra
2.CONTROLDECALIDADYTRAZABILIDADDELALECHE
2.1Generalidades
2.2Tiposdecontrol
3.DETECCINDELAPRESENCIADERESIDUOSDEANTIBITICOSENLALECHE
3.1Importanciadelapresenciaderesiduosdeantibiticosenlaleche
3.2Sistemadedeteccin
3.3Mtodosdeuninareceptoresproteicos
3.3.1Fundamentoyprocedimientodelosmtodos
3.3.2Caractersticasdefuncionamientodelosmtodos
3.3.2.1Especificidad
3.3.2.2Capacidaddedeteccin(CC)
11
II.OBJETIVOS
15
III.MATERIALESYMTODOS
17
3.1DiseoExperimental
17
3.2Muestrasdeleche
17
3.3Sustanciasantimicrobianasymuestrasfortificadas
18
3.4Mtodosdeuninareceptoresproteicos
19
3.4.1BetaStarCombo
19
3.4.2CharmMRLBL/TET
20
3.4.3SNAP(Betalactam,TetracyclineyGentamicin)
21
3.4.4Twinsensor
22
3.5Anlisisestadstico
23
IV.RESULTADOSYDISCUSIN
25
1.Especificidaddelosmtodosdeuninareceptoresenlechedecabra
25
1.1BetaStarCombo
25
1.2CharmMRLBL/TET
27
1.3SNAP(Betalactam,TetracyclineyGentamicin)
28
BT
1.4Twinsensor
2.Capacidadde deteccin(CC) de antibiticos delosmtodosdeunin areceptores
proteicosenlalechedecabra
29
32
2.1BetaStarCombo
32
2.2CharmMRLBL/TET
33
II
ndices
2.3SNAP(Betalactam,TetracyclineyGentamicin)
35
2.4TwinsensorBT
3.Efectodelazidiolsobrelarespuestadelosmtodosdeuninareceptoresproteicos
enlechedecabra
36
37
3.1BetaStarCombo
37
3.2CharmMRLBL/TET
38
3.3SNAP(Betalactam,TetracyclineyGentamicin)
39
BT
3.4Twinsensor
41
V.CONCLUSIONES
44
VI.REFERENCIASBIBLIOGRAFICAS
47
III
ndices
INDICEDECUADROS
Pg.
Cuadro1.Parmetrosfsicosqumicosdelalechedevacaycabra
Cuadro2.Parmetrosdecalidadhiginicaenlalechecruda
Cuadro3.LmitesmximoderesiduosestablecidosenlaUninEuropeaenlaleche
9
19
25
25
27
27
29
30
32
33
34
35
37
IV
ndices
INDICEDEFIGURAS
Pg.
Figura1.ComponentesdelalechedecabraMurcianoGranadina
Figura2.Clasificacindelosmtodosdedeteccindeinhibidoresdelaleche
Figura3.Modelodecurvadosisrespuestaparaelclculodellmitededeteccindelos
mtodosdecribado
Figura 4. Estudio del efecto del azidiol sobre los mtodos de unin a receptores
proteicosenlechedecabra
11
18
Figura5.ProcedimientodelmtodoBetaStarCombo
20
Figura6.ProcedimientodelmtodoRosaCharmMRLBL/TET
21
Figura7.ProcedimientodelmtodoSNAP
22
BT
Figura8.ProcedimientodelmtodoTwinsensor
Figura9.EvolucindelaespecificidaddelmtodoBetaStarComboenlechedecabraalo
largodelperododelactacin.
Figura10.EvolucindelaespecificidaddelmtodoRosaCharmMRLBL/TETenlechede
cabraalolargodelperododelactacin.
Figura11.EvolucindelaespecificidaddelmtodoSNAPenlechedecabraalolargodel
perododelactacin
Figura12.EvolucindelaespecificidaddelmtodoTwinsensor BT enlechedecabraalo
largodelalactacin
Figura 13.EfectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoBetaStarComboparaleche
decabrasinantibitico
Figura14.LecturasobtenidasenelestudiodelazidiolenelBetaStarComboparaleche
decabraconpenicilinaGyoxitetraciclina
Figura15.EfectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoCharmMRLBL/TETparaleche
decabra
Figura16.EfectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoSNAPBetalactamparaleche
decabrasinantibiticoyconpenicilinaG
Figura17.EfectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoSNAPTetracyclineparaleche
decabrasinantibiticosyconoxitetraciclina
Figura18.EfectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoSNAPGentamicinenlechede
cabrasinantibiticoycongentamicina
Figura19.LecturasyTobtenidasenelestudiodelazidioldelmtodoTwinsensor BTen
lechedecabra
22
25
28
30
31
38
38
39
40
40
41
41
Introduccin
Introduccin
I.INTRODUCCIN
1. LACALIDADDELALECHEDECABRA
1.1.Aspectosgenerales
Lalechedecabraysusderivadossonrecursosalimentariosquehanrecibidoenlosltimosaos
una mayor atencin mundial. Su produccin se ha incrementado notablemente en las ltimas dos
dcadasyelloestcontribuyendocadavezms,amejorarlaeconomadeproductores,industriales
yaincrementarelaportenutricionalenvariossectoresdeconsumidores.
demanda por parte de la industria de una materia prima con caractersticas adecuadas para su
transformacin, as como por una mayor exigencia de los consumidores. Las industrias han ido
generalizando el pago de la leche a los productores en base a su calidad y, por otra parte, la
normativaeuropeavigenteestablecelaobligatoriedaddecontrolarlacalidaddelalechecrudaque
losganaderosproporcionanalaindustria.
La calidad de la leche cruda de cabra debe analizarse desde dos aspectos: el bioqumico, es
decir,caractersticasfsicoqumicasycomposicinqumica,yelhiginicosanitario.
1.2. Caractersticasfsicoqumicasycomposicindelalechedecabra
LalechedecabraproducidaenEspaasedestinaprcticamenteensutotalidadalaelaboracin
deproductoslcteosderivados,fundamentalmentequesos.Enesesentido,disponerdeinformacin
sobre las caractersticas y composicin qumica de la leche cruda resulta esencial para la industria
quesera,yaquelepermiteunamejoraydesarrollocontinuados.
EnelCuadro1sepresentanlosparmetrosfsicoqumicosqueseempleanenlavaloracinde
la calidad de la leche cruda de vaca y cabra, los cuales sealan ciertas caractersticas importantes
comosonelgradodefrescuraylacalidadhiginica(pHyacidez),ascomotambinladeteccinde
fraudesporadicindeagua(densidadypuntocrioscpico).
A su vez, la composicin qumica de la leche tiene una gran importancia ya que determina su
calidad nutritiva y muchas de sus propiedades. De igual manera, la aptitud tecnolgica de la leche
parasutransformacinenquesodepende,engranmedida,desucomposicin,especialmentedesu
contenido en grasa y protena que son los parmetros que presentan una mayor relacin con el
rendimientoquesero.
Cuadro1.Parmetrosfsicoqumicosdelalechedevacaycabra
Componente
Acidez(D)
pH
PuntoCrioscpico(C)
Densidad(g/ml)
Fuente:Luquet(1993)
Vaca
Cabra
16
6,6
0,521
1,028
14
6,7
0,549
1,033
Introduccin
Granadina.Losporcentajesdelafiguradebenconsiderarsecomovaloresmediosorientativos,yaque
comocomentaBoza(1997),loscomponentesdelalechedecabravarandeformanaturalalolargo
de la lactacin, vindose adems afectados por numerosos factores, como el tipo y la poca de
parto,laedaddelanimalylaalimentacin,entreotros.
Figura1.ComponentesdelalechedecabraMurcianoGranadina
Fuente:ElaboracinpropiasegndatosdeVert(2004)yACRIMUR(2010)
Se observa que el mayor componente en la leche de cabra es el agua con un valor medio de
86%.Asuvez,losslidostotalesrepresentanel14%ysusconstituyentesmayoritariossonlagrasay
lalactosacon5,14%y4,57%,respectivamente,seguidosdelaprotenaconun3,57%yporltimolas
cenizas0,72%.
Conrespectoaloscomponentesquepresentanmayorrelacinconelrendimientoquesero,la
leche de cabra tiene mayor contenido en materia grasa y protena bruta que la leche de vaca, sin
embargo, su contenido de protena coagulable es ligeramente ms bajo (Luquet, 1993; Quiles y
Hevia,1994).
1.3Calidadhiginicosanitariadelalechedecabra
alimentacinhumana(CE853/2004)realizaunavaloracindelacalidadhiginicadelalechecruda
enbaseasucontenidoengrmenestotales,clulassomticasyresiduosdeantibiticos.Asimismo,
estableceunosvaloresmximos(Cuadro2),paraquelalechepuedasercomercializadaenelmbito
delaUnineuropea(UE).
Introduccin
Cuadro2.Parmetrosdecalidadhiginicaenlalechecruda
Parmetro
Vaca
Recuentogrmenestotales(ufc/ml)1
100.000
Recuentoclulassomticas(cel/ml)2
400.000
Presenciadeantibiticos
OvejayCabra
500.0003
1.500.0004
Ausenciaderesiduosporencimadelos
lmitesdeseguridadestablecidosenlaUE
Mediageomtricaobservadaduranteunperiododedosmesesconunmnimodedosdeterminacionesalmes;2Media
geomtricaobservadaduranteunperiododetresmesescon,almenos,unadeterminacinalmes;3Cuandoelprocesode
elaboracindelosproductosderivadosnoincluyeningntratamientotrmico;4Cuandoelprocesodeelaboracindelos
productosderivadosincluyetratamientotrmico.
Fuente:Reglamento(CE)853/2004
Recuento de Grmenes Totales (RGT): En el caso de la leche de oveja y cabra, los lmites
correspondena500.000ufc/mlparalalechedestinadaalaelaboracindeproductosderivadossin
tratamiento trmico y a 1.500.000 ufc/ml para la leche destinada a productos que incluyan en su
elaboracinalgntipodetratamientotrmico;ambosvaloressonmuysuperioresalvalorlmitede
100.000ufc/mlestablecidoparalalechecrudadevaca.
Recuento de Clulas Somticas (RCS): constituye un buen indicador del nivel sanitario de los
animales,principalmenteenrelacinalapresenciademamitis.ElReglamento(CE)853/2004,sobrelas
normasdehigieneaplicablesalosalimentosdeorigenanimal,estableceparalalechecrudadevacaun
valormximode400.000cel/ml.Enelcasodelganadoovinoycaprinolasituacinnoesttanclaray
lalegislacinannohaestablecidolosvaloresmximosexigibles.
Presenciaderesiduosdeantibiticos:esotrodelosaspectosconsideradosenlalegislacinpara
valorarlacalidadhiginicadelalechecruda.Molinaycol.(2010)indicanque,laprincipalcausadela
presencia de estas sustancias en la leche es la utilizacin de medicamentos veterinarios a base de
antibiticos y sulfonamidas para el tratamiento de las enfermedades infecciosas del ganado,
especialmente la mamitis y que estos tratamientos, constituyen una prctica muy generalizada que
puedeocasionarlacontaminacindelalechesinosetomanlasmedidasdeproteccinadecuadas.
2.CONTROLDELACALIDADYTRAZABILIDADDELALECHE
2.1.Generalidades
Actualmente,enEspaa,elcontroldelatrazabilidadycalidadesdeobligadocumplimientopara
lalechecrudadevaca(RealesDecretos217/2004y1728/2007)ytambin,paralalechedeovejay
cabra(RealDecreto752/2011).
En estos Reales Decretos se establece la normativa bsica de control que deben cumplir los
operadores del sector de leche cruda de estas especies. En ellos, se regula la identificacin y el
registro de los agentes, establecimientos y contenedores que intervienen en el sector lcteo, as
comoelregistrodelosmovimientosdelalechecruda.Tambinsecrelaherramientaquepermite
establecerlatrazabilidaddelalechecrudadevacaenEspaa,elMdulodetrazabilidaddelabase
dedatosLetraQ(Leche,TRAzabilidad,Qualidad),queesunaaplicacininformticaintegradaenel
3
Introduccin
sistema de informacin Letra Q, donde estn registrados todos los agentes y contenedores del
sectorlcteo.
ElRealDecreto752/2011permitedesarrollarlosreglamentoscomunitariosrelativosalahigiene
2.2.Tiposdecontrol
El Real Decreto 752/2011 establece que deben existir controles obligatorios en las
explotaciones(autocontroles)antesdecargarlalechecrudaenlacisternadetransporte,dondeser
obligatorio realizar una verificacin de parmetros para comprobar que la leche rene las
caractersticas adecuadas. Se debe realizar una inspeccin visual comprobando el color, olor,
apariencia de la leche cruda y ausencia de contaminacin macroscpica. Tambin se medir la
temperatura de la leche en el tanque de fro, se comprobar la limpieza del tanque y si existe
sospechadedeterioromicrobiolgico,sepodrrealizarlapruebadelaacidezoladelaestabilidadal
alcohol.Ademssegnelplandemuestreoestablecido,serecogerunamuestradelecheparasu
envoallaboratorioytambinserealizarlapruebadedeteccindeinhibidoresinsitu.
De igual manera se efectan controles obligatoriosen los centros lcteos donde se realizarn
Cabe sealar que, a pesar de que en el Reglamento (CE) 853/2004 no se especifica un valor
umbralparaelrecuentodeclulassomticasenlalechedeovejaycabra,elRealDecreto752/2011
establece la obligacin de comunicar los valores de este parmetro con el fin de mejorar la
Introduccin
transparenciadelasrelacionesentrelosagentesqueformanpartedelacadenadeproduccinas
comoparalaobtencindeunbancodedatosreferenteaesteparmetro.
3.DETECCINDELAPRESENCIADERESIDUOSDEANTIBITICOSENLALECHE
3.1Importanciadelapresenciaderesiduosdeantibiticosenlaleche
qumicasdebidosaltratamientodelosanimalescondiferentesfrmacos,ascomolosqueproceden
de la utilizacin de detergentes y/o desinfectantes. En estos momentos, los residuos ms
importantesqueaparecenenlalechesonlosresiduosdemedicamentosveterinarios,especialmente
los antimicrobianos que consecuentemente, son un riesgo para la salud pblica y los procesos de
industrializacinlechera(Litterioycol.,2004).
producir efectos negativos sobre la salud humana como afecciones alrgicas, gastrointestinales,
intoxicaciones y el desarrollo de resistencias a los agentes microbianos. (Anthony y col., 2001 y
DemolyyRomano,2005).
Por otro lado, desde una visin tecnolgica, inhibe los procesos bacterianos necesarios en la
propio ganadero o productor de leche, ya que puede llevar a la prohibicin por parte de las
autoridadessanitarias,delacomercializacindelalechecrudaalsercalificadacomonoaptapara
consumohumano,segnlaLegislacin.
ODonnell (2007) seala que los residuos de antibiticos deben ser monitoreados para evitar
Comoyasehacomentado,debidoaquelosresiduosdeantibiticosenlalecherepresentanun
riesgo potencial para los consumidores, para la industria lechera y para el ganadero, los pases
miembrosdelaUninEuropeaestnobligadosacontrolaroficialmentesupresenciaparaasegurar
queestnpordebajodellmitemximoderesiduos(LMR)establecido.
concentracinmximaderesiduodeunasustanciafarmacolgicamenteactiva(expresadoeng/kgo
g/kg sobre la base del peso en fresco) que puede permitirse en los alimentos de origen animal; se
establece para cada producto (carne, leche, etc.) y es especfica para cada especie animal (vacuno,
ovino,caprino,etc.)
EnelCuadro3,sepuedenobservarlosLmitesMximosdeResiduos(LMR)establecidosenlaUnin
Europeaparadiferentessustanciasantimicrobianasenlaleche.
5
Introduccin
Cuadro3.LmitesMximosdeResiduos(LMR)establecidosenlaUninEuropeaparalaleche.
Sustancia
Betalactmicos
Penicilina
Ampicilina
Amoxicilina
Penetamato
Nafcilina
Cloxacilina
Dicloxacilina
Oxacilina
Cefacetrilo
Cefalexina
Cefalonio
Cefoperazona
Ceftiofur
Cefquinoma
Cefapirina
Cefazolina
Tetraciclinas
Doxiciclina
Clortetraciclina
Oxitetraciclina
Tetraciclina
Sulfamidas
Sulfadiacina
Sulfadimetoxina
Sulfadimina
Sulfadoxina
Sulfanilamida
Sulfametazina
Sulfatiazol
LMR
g/kg(ppb)
4
4
4
4
30
30
30
30
125
100
20
50
100
20
60
50
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Leche
Todas*
Todas
Todas
Vaca
Vaca
Todas
Todas
Todas
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Todas
Todas
Todas
Todas
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Sustancia
Macrlidos
Eritromicina
Espiramicina
Tilmicosina
Tilosina
Lincomicina
Pirlimicina
Aminoglucsidos
Gentamicina
Kanamicina
Neomicina
Espectinomicina
Estreptomicina
Quinolonas
Danofloxacina
Enrofloxacina
Flumequina
Marbofloxacina
Otros
cidoclavulnico
Bacitracina
Baquiloprim
Cloranfenicol
Colistina
Dapsona
Florfenicol
Novobiocina
Rifaximina
Tianfenicol
Trimetoprim
LMR
g/kg(ppb)
40
200
50
50
150
100
100
150
1500
200
200
30
100
50
75
200
100
30
0
50
0
0
50
60
50
50
Leche
Todas
Vaca
Todas
Todas
Todas
Vaca
Vaca
Vaca
Todas
Oveja
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Vaca
Todas
Todas
Todas
Todas
Vaca
Vaca
Vaca
Todas
*Todas=lechecorrespondienteatodaslasespeciesganaderas
Fuente:ReglamentoUE37/2010
3.2SistemasdeDeteccin
(Figura2).Unaprimeraqueseconocecomoetapadecribadoydeconfirmacinpreliminardondese
utilizan,enespecial,mtodosmicrobiolgicoscualitativosconlafinalidaddedeterminarlapresencia
oausenciaderesiduosporencimadelosLMRy,tambin,mtodosespecficos(rpidos)queson
capacesdeidentificarsustanciasoinclusofamiliasdeantimicrobianosdeunaformamsespecfica.
Lasegundafaseesdeconfirmacinycuantificacindondeseempleanmtodosfisicoqumicosque
se utilizan para identificar de forma inequvoca la presencia de estos residuos en la leche y
determinarexactamentelacantidaddeanalitopresenteenlasmuestras(Beltrn,2010).
Introduccin
TambinlaUninEuropeaapartirdelaDecisin2002/657/CEEclasificalosmtodosanalticos
Los mtodos microbiolgicos de cribado fueron los primeros mtodos utilizados para la
deteccinderesiduosdeantibiticos.Estnbasadosfundamentalmenteenpruebasdeinhibicindel
crecimiento de un microorganismo especfico, empleando para la deteccin de esta inhibicin,
diversossistemascomoindicadoresdepH,redox,bioluminiscencia,etc.Estosmtodosaprovechan
lacapacidaddelasbacteriasdeproducircido,reducircolorantesoproducirhalosdeinhibicinen
unmediodecultivo,demaneraqueelresultadosepuedeinterpretarvisualmente.ElBRT,Delvotest
oEclipse,sonalgunosdelosmtodosmsutilizadoshoyendaytodosellosempleanelGeobacillus
stearothermophilus var. calidolactis, antes denominado Bacillus stearothermophilus (Nazina y col.,
2001),comomicroorganismodeprueba.
Figura2.Clasificacindelosmtodosdedeteccindeinhibidoresenlaleche
Fuente:Molinaycol.(2010)
Porotrolado,entrelosmtodosespecficoscualitativosutilizadosenlafasedecribado,existen
actualmenteenelmercadodistintostiposdemtodosenzimticos,inmunoenzimticos,deunina
receptores, etc., que permiten detectar de una forma ms especfica y por lo general mucho ms
rpida, la presencia de residuos de antibiticos y sulfonamidas en la leche (Roca, 2008). Entre los
mtodos ms importantes se encuentra el enzimtico Penzym y otro grupo de mtodos
inmunoenzimticos, ELISA o RIA, as como los mtodos de unin a receptores proteicos, de gran
desarrollo en la actualidad, entre los que destacan el mtodo ROSA Charm, BetaStar, SNAP y
TwinsensorBT.
Introduccin
Todosestosmtodosutilizadosparaladeteccinderesiduosdeantimicrobianosenlalechehan
sidodesarrolladosyevaluadosparaserutilizadosconlechedevaca.Enelcasodelalechedecabray
ovejaseempleanestosmismosmtodossinquesehayanllevadoacabo,enmuchoscasos,estudios
deevaluacinparasuusoenestasespeciesy,encasonecesario,unaadaptacinuoptimizacinde
lascondicionesoperativas.
3.3Mtodosdeuninareceptoresproteicos
3.3.1Fundamentoyprocedimientodelosmtodos
Losmtodosdeuninareceptoresproteicosllamadoscoloquialmentemtodosrpidos,son
mtodosquepermitenanalizarlapresenciaonodeantibiticosenlalechedeunamanerasencilla,
rpida,confiable,defcilinterpretacindelosresultadosyquenorequieredepersonalcapacitado
para su uso. Actualmente son los que se emplean con mayor frecuencia para los anlisis en las
explotacionesganaderasycentroslcteos.
LosmsutilizadosenEspaason:ROSACharm,BetaStar,SnapyTwinsensorBT.Todospresentan
diferentes versiones que son capaces de detectar antibiticos pertenecientes al grupo de los
betalactmicos y/o tetraciclinas o mtodos combinados que identifican simultneamente,
antibiticosdeambosgrupos.
Generalmenteutilizanlatecnologadeflujolateralyestnbasadosenlaunindelantibitico
problema a receptores proteicos conjugados a una enzima que son especficos para un antibitico
determinado(Mitchellycol.,1998).EnelmtodoBetaStaryTwinsensorBTlosreceptoresproteicos
estnenlazadosapartculasdeoro.
Sediferencianeneltiempodeincubacinquevaraentre5y9minutos,siendoelBetaStarelde
menortiempodeincubacin(5minutos),tambinenlatemperaturadeincubacinquevade40a
56C, as como en el formato en el que se presentan, mayormente en tiras reactivas u otros
dispositivoscomoeselcasodelSNAP.
Todos permiten efectuar la interpretacin visual de los resultados por la intensidad de las
Enlamayoradeestosmtodosdecontrolhaydosfasesdeincubacin,aexcepcindelmtodo
ROSA(RapidOneStepAssay)Charmquecomosunombreindica,realizatodoelanlisisensusolo
paso.Enelrestodelosmtodos,enlaprimerafaseseponeencontactolamuestradelecheconel
receptordandocomoresultadolainteraccindelosposiblesantibiticosquecontengalamuestra
conelreceptor.
Enlasegundafase,lamuestradelechejuntoconlosreceptoresestransferidaalatirareactivao
dispositivo que contiene una lnea control y una lnea para antibiticos betalactmicos y/o para
tetraciclinas (segn el grupo para el que sea especfico para un solo antibitico o combinado, que
permiteladeteccinsimultaneadeambosgruposdeantibiticos;enesteltimocasolatirareactiva
8
Introduccin
presentatreslneas(lneabetalactmicos,lneacontrolylneatetraciclinas).Alaadirlatirareactiva
en esta segunda fase del anlisis, es cuando la lnea especfica a antibiticos betalactmicos y/o
tetraciclinas captura todos los receptores especficos que no han interaccionado con el antibitico
durantelaprimerafase.
Lalneacontrolsirvecomoreferenciaparadeterminarsilamuestraesnegativaopositiva.En
general,silalneaespecficadecadaantibiticoesmsintensaquelalneacontrol,lamuestrase
consideranegativayporelcontrario,silalneadelosantibiticostieneunaintensidadmenorquela
lneadecontrol,lamuestraseconsideracomopositiva.
3.3.2Caractersticasdefuncionamientodelosmtodos
deben tener en cuenta para la validacin de mtodos analticos, siendo estas caractersticas la
especificidad, capacidad de deteccin (CC), lmite de decisin (CC), veracidad, robustez, y
estabilidad. Dependiendo del tipo de mtodo analtico a validar estas caractersticas son de
determinacinobligatoriaono(Cuadro4).
Cuadro4.Clasificacindelosmtodosanalticosenfuncindelascaractersticasdefuncionamiento
Mtodos
cualitativos
Mtodos
cuantitativos
S
E
S
E
Capacidad
de
deteccin
(CC)
+
+
+
+
Lmitede
decisin Veracidad
(CC)
Precisin
Robustez/
Especificidad estabilidad
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S=mtodosdecriba;E=mtodosespecficos;+=determinacinobligatoria
Fuente:Decisin2002/657/EC
3.3.2.1Especificidad
Tambinconocidacomoselectividad,estasociadaalapresenciaderesultadosconocidoscomo
falsospositivosyresultadegranintersparaevaluarlacapacidadanalticadeunmtodo.Parasu
determinacinsedebenanalizarunelevadonmerodemuestrasdelechequetienenquecumplir
una serie de condiciones, en especial, que procedan de animales no tratados con medicamentos
veterinarios(UNEENISO,2003ayb).
Introduccin
SegnSischoycol.(1993),laespecificidadsecalculacomolafrecuenciarelativaporcentualde
los resultados negativos obtenidos, dividido por el nmero total de muestras analizadas. Adems,
otrosautores,ladefinencomolacapacidaddeunmtodoparadetectarmuestrasnegativascuando
realmentesonnegativas(Trullolsycol.,2004).
Muchossonlosfactoresquepudieranintervenirenlaaparicinderesultadosfalsospositivos
enanimalesnotratados,comolaetapadelactacinylascaractersticaspropiasdelalechedecada
especiecomolacomposicin,presenciadeinhibidoresnaturales,etc.(Althausycol.,2003).
Otrofactoratenerencuentaeslapresenciadeconservantesenlaleche.Schiffmanycol.(1992)
Tambin Molina y col. (2003), estudiaron el efecto del uso de dos conservantes, dicromato
potsico y azidiol, sobre la respuesta de los mtodos BRT AiM y Delvotest en leche oveja y
determinaron que el dicromato potsico inhiba totalmente el crecimiento del Geobacillus
stearothermophilus mientras que con el azidiol, se obtena una menor especificidad analizando
muestras adicionadas de conservante (90,2%) que cuando se analizaban muestras sin conservante
(96,3%) en el mtodo BRT y tambin en el Delvotest, que present una especificidad de 91% con
muestrasdelecheconazidiolyde97,7%conmuestrasdelechesinconservante.
(1997)conmuestrasdelechedecabra,obtuvieronunaespecificidadde100%paraelmtodoSNAP
Betalactam.Tambin,Zengycol.(1998)conmuestrasdelechedecabra,indicanparaestemtodo
decontrolunaespecificidadsuperioral90%.
Berrugaycol.(2009)analizaronmuestrasdelechedeovejacondiferentesmtodosdeunina
receptores proteicos especficos a antibiticos betalactamicos y/o tetraciclinas (ROSA Charm BL,
TwinsensorBT y SNAP) y obtuvieron especificidades elevadas para la deteccin de betalactmicos:
99% para el mtodo SNAP Betalactam, 95% para el TwinsensorBT y 90% para el ROSA Charm BL.
Deigualmaneraparalastetraciclinas,laespecificidadenmuestrasdelechedeovejatambin
resultelevada:96%paraSNAPTetracycline,97%paraTwinsensorBTy99%paraelROSACharmTET.
Por su parte Reybroeck y col. (2010) en un estudio de validacin del mtodo BetaStar en su
versinsimplificada1+1,obtieneun100%deespecificidadalanalizarmuestrasdedistintostiposde
10
Introduccin
lechedevaca(UHT,esterilizada,reconstituidaenpolvo,descongelada)ytambinleche decabray
oveja.
3.3.3.2Capacidaddedeteccin(CC)
SegnlaDecisin2002/657/CE,seentiendeporLmitededeteccinoCapacidaddedeteccin
(CC)alcontenidomnimodeunasustanciaquepuedeserdetectado,identificadoocuantificadoen
una muestra, con una probabilidad de error . El error es la probabilidad de que la muestra
analizada sea realmente no conforme, aunque se haya obtenido una medicin conforme. En los
mtodosdecribado,elerrornodeberasermayoral5%(CRLs,2010).
Enelcasodesustanciasparalasquenosehaestablecidounlmitepermitido,lacapacidadde
ExistendiferentescriteriosparaelclculodelaCapacidaddedeteccin(CC)deunmtodode
cribadocualitativo.LasnormasUNEENISO(2003ayb)proponenunprocedimientodeclculoque
contempla la utilizacin de diferentes concentraciones de antibitico, con objeto de construir una
curvadosisrespuesta(Figura3)apartirdelasfrecuenciasrelativasderesultadospositivosparacada
concentracin de antibitico ensayada, realizando un total de 1020 repeticiones si la lectura de
resultadosesvisualyde35siesfotomtrica.
Figura3.Modelodecurvadosisrespuestaparaelclculodellmitededeteccindelos
mtodosdecribado
Fuente:UNEENISO13969y18330(2003a,b)
11
Introduccin
Entrelasconcentracionesdeensayodebeincluirseuncontrolnegativo,unaconcentracinque
sea al menos de 1,5 a 2 veces superior a la concentracin que se espera resulte positiva y una
concentracin equivalente al LMR, calculndose el Lmite de deteccin como la concentracin que
corresponde a la interseccin de la curva dosisrespuesta, con la lnea que representa el 95% de
resultadospositivos.
Porotraparte,loslaboratoriosdereferenciadelaComunidadeuropea(CRLs,2010)proponen
unas directrices de clculo en las que se determina la frecuencia de resultados positivos a una
concentracin de antibitico determinada (Screening Target Concentration), comprendida entre el
50yel100%delLMR,demaneraqueelCCsecorrespondeconlamenorconcentracinensayada
que produce un 95% de resultados positivos. A diferencia del procedimiento propuesto por las
normasISO(2003ayb),lamximaconcentracindeensayoesequivalentealLMRyelnmerode
repeticiones a realizar depende de la relacin que est tenga con el LMR: 20 repeticiones si la
concentracindeensayoesmenoroigualal50%delLMR,40repeticionessiestcomprendidaentre
el50yel90%y60repeticionessirepresentaentreel91yel100%delLMR.
Porotraparte,muchosautoresreseanlaCapacidaddeDeteccin(CC)delosmtodosconla
sensibilidad.Lasensibilidadesunparmetroqueresultadegranutilidadparaevaluarlacapacidad
deunmtodoparadetectarlapresenciadeundeterminadofrmacoaunnivelequivalentealLMR
enunamuestradeleche.
Paraelclculodelasensibilidad,laFederacinInternacionaldeLechera(IDF,1997)especifica
que debe determinarse sobre 30 rplicas de una misma muestra de leche, adicionadas de una
concentracin equivalente al LMR de la sustancia objeto de estudio. La sensibilidad se determina
como el cociente porcentual del nmero de muestras positivas al mtodo, respecto del total de
muestrasanalizadas.
Losmtodosdeuninareceptoresproteicosestnbasadosenlautilizacindereceptorescon
unaespecificidadajustadaenbasedelosnivelesdetoleranciadelosEEUUodeloslmitesmximos
deResiduosestablecidosenlalegislacineuropea.
Estos mtodos han sido evaluados con muestras de leche de vaca presentando unos buenos
Porsuparte,Permeycol.(2010),tambinobtienemuybuenosresultadosdesensibilidadconel
12
Introduccin
Sinembargo,laevaluacindelacapacidaddedeteccindeestosmtodosconlechedeovejay
de cabra es muy limitada y sera de gran importancia conocer la influencia de los factores que
puedeninterferirenlarespuestadeestosmtodosdecontrolconestetipodeleche.
Considerandolaimportanciadelapresenciaderesiduosdeantibiticosenlalecheylaescasa
13
Objetivos
Objetivos
II.OBJETIVOS
Dadalaimportanciadelapresenciaderesiduosdemedicamentosenlalechetantoparalasalud
pblica como para los procesos tecnolgicos de fabricacin de productos lcteos, la legislacin
europea establece una serie de controles sobre la deteccin de inhibidores en la leche a nivel de
explotacionesganaderas,centroslcteosylaboratoriosacreditados.
Los mtodos empleados para la realizacin de estos controles han sido desarrollados y
evaluadosparalechedevacasiendolainformacinparalalechedeotrasespeciesganaderasmuy
limitada.Porello,seconsiderinteresanterealizarunestudiosobrelaEvaluacindelosmtodos
deuninareceptoresproteicosparaladeterminacindeantibiticosenlalechecrudadecabra.
Deunamaneramsespecfica,losobjetivosdeestetrabajohansidolossiguientes:
Estudiarlaespecificidaddelosmtodosdeuninareceptoresproteicosmsempleadosen
Espaa(BetaStarCombo,CharmMRLBL/TET,SNAPyTwinsensorBT)enlechecrudadecabra.
Analizar el efecto del conservante azidiol sobre la respuesta de los mtodos de unin a
receptores proteicos (BetaStar Combo, Charm MRL BL/TET, SNAP y Twinsensor BT) en leche
decabraconysinantibiticos.
15
Materialesymtodos
Materialesymtodos
III.MATERIALESYMETODOS
3.1.DiseoExperimental
Dado que el presente estudio pretende evaluar el funcionamiento de los mtodos de unin a
receptoresproteicosmsempleadosenEspaaconlechecrudadecabra,eldiseoexperimentalse
planteenbasealestudiodelosparmetrossiguientes:
UnsegundoexperimentoparaestablecerlaCapacidaddedeteccin(CC)delosmtodosde
uninareceptoresproteicosutilizadosenesteestudio,paralosantibiticosbetalactmicosy
tetraciclinasmsempleadosenelganadocaprinolechero.
UntercerexperimentoparaevaluarelefectodelconservanteAzidiolsobrelarespuestade
los mtodos de unin a receptores proteicos con leche de cabra sin antibitico y con
antibitico(betalactmicosytetraciclinas).
3.2Muestrasdeleche
Para los experimentos, se utilizaron muestras individuales de leche procedentes del ordeo
mecnicodelamaanadelrebaodecabrasdelaRazaMucianoGranadinaexistenteenlaGranja
experimental de pequeos rumiantes del Departamento de Ciencia Animal de la Universitat
PolitcnicadeValencia.
Lasmuestrasserecogierondeanimalessanosynotratadosconningnmedicamentodesdela
segunda semana postparto hasta el final del perodo de lactacin (7 meses), con una frecuencia
quincenal.
Politcnica de Valencia para determinar su composicin qumica (grasa, protena bruta, lactosa, y
slidos totales) y su calidad higinica (recuento de clulas somticas y recuento de grmenes
totales), garantizando que cumplan con los requisitos de composicin y calidad sealados en la
norma UNEEN ISO 18330 (2003b) que establece las directrices para la descripcin normalizada de
los inmunoensayos de receptores para la deteccin de residuos de antimicrobianos en leche y
productoslcteos.
LacomposicinqumicadelalechesedeterminmediantelautilizacindelMilkoScanFT120
(Foss. Hillerd, Denmark), el recuento de clulas somticas con el equipo automtico Fossomatic
5000 (Foss. Hillerd , Denmark) y el recuento de grmenes totales, con el Bactoscan FC (Foss.
Hillerd,Denmark).ElpHsedeterminconunpHmetroconvencional(Crison.Barcelona,Espaa).
17
Materialesymtodos
Enelestudiodeespecificidadseanalizaronuntotalde350muestrasindividualesdelechede
cabra.Cadamuestraseanalizindividualmenteelmismodadesurecogidamediantelosmtodos
seleccionadosparaestetrabajosegnelprotocolodeejecucindescritoporcadafabricante.
Para medir la Capacidad de deteccin (CC) fueron seguidas las directrices de las Guas de
validacindelosmtodosdecribadoparaladeteccinderesiduosdemedicamentosveterinarios,
propuestasporloslaboratoriosdereferenciadelaComunidadeuropea(CRLs,2010).
Para evaluar el efecto del conservante azidiol sobre la respuesta de los mtodos de unin a
receptoresproteicos,seutilizaron20muestrasindividualesdelechedecabralibresdeantibiticos.
Lasmuestrasdelechesedividieronendosalcuotas,unasinconservanteyotraconazidiol(Figura4),
yseanalizaronconcadaunodelosmtodosconsiderados.Posteriormente,lasmismasmuestrasde
leche fueron adicionadas de penicilina G y oxitetraciclina en concentraciones equivalentes al LMR
(4g/Kg y 100g/Kg, respectivamente) y se analizaron nuevamente con los mtodos de cribado
seleccionados.
(n=20)
negativanegativanegativanegativanegativanegativa
+azidiol+PenG+PenG+Az+Oxi+Oxi+Az
Figura4.Estudiodelefectodelazidiolenmtodosdeuninareceptoresproteicosenlechedecabra
3.3Sustanciasantimicrobianasymuestrasdelechefortificadas
estudio de la sensibilidad de los mtodos de unin a receptores proteicos, junto a sus respectivos
LmitesMximodeResiduosestablecidosporlanormativavigente,sepresentanenelCuadro5.
Paralapreparacindelasmuestrasfortificadasdecadaunodelosantibiticosestudiados,se
siguieronlasrecomendacionesdelaFederacinInternacionaldeLechera(IDF,1991),demodoque
18
Materialesymtodos
elvolumenaadidodeladisolucindeunfrmacodeterminadonosuperaseel1%delvolumende
solucinfinaldelecheresultante.
Nombre
3.4Mtodosdeuninareceptoresproteicos
CharmMRLBL/TET,SNAP(Betalactam,TetracyclineyGentamicin)yTwinsensorBT.
apartadossiguientes.
3.4.1BetaStarCombo
ElmtodoBetaStarCombo(NeogenCorporation.Lansing,EEUU),esunmtododereceptores
Materialesymtodos
en un calentador suministrad
do por la casa comerrcial, durante un tiem
mpo de 2 minutos.
ormentesecolocalatirareactivadenntrodelvial yserealizaunasegundaaincubacin
ndurante
Posterio
osms.
3minuto
Alffinalizarelpeeriododeincubacin,seeextraelatiradelvial,sseretiralaeesponjitadel extremo
dela tirayserealizzainmediatamente desppuslainterpretacin de
elosresultaddos,biende
emanera
o mediante la utilizaccin del le ctor AccuSccan III Rea
ader (Neogeen Corporation). El
visual o
procedim
mientodeen
nsayodelm
todoBetaSttarCombose
eobservaen
nlaFigura5.
Figura5
5.ProcedimieentodelmttodoBetaSta
arCombo
Lainterpretaci
nvisualdelosresultadoosserealizad
delasiguientemanera:
asonmsinttensasoigu
ualquelabandadereferrencia,lamuestrase
Silaasbandasdeelamuestra
considerranegativa.
Si las bandas de la mu
uestra tieneen una
q la banda de referenncia, la
intensidaad menor que
muestraesinterprettadacomopositiva.
Sip
porelcontrarriolabandadereferenciianose
s consideraa como
ve reflejjada en la tira, el test se
invlido..
3.4..2CharmMR
RLBL/TET
El mtodo RO
OSA (Rapid One Step Assay) Ch
harm MRL BL/TET (Chharm Sciencces Inc.,
hussets, EEU
UU), permite la detecccin simultnea de antimicrobianoos betalact
micos y
Massach
tetraciclinasaniveleesdelosLMR
RsestableciddosenlaUninEuropea
a.Utilizalateecnologade
edifusin
o lateral y see presenta mediante
m
tirras de papel cromatogr
fico en la qque estn em
mbebidos
por flujo
todoslossingredienteesdelmtod
do.
Paraa realizar esste mtodo, se colocan en un tubo eppendorf, 300L de laa muestra de
e leche y
20
Materialesymtodos
Tran
nscurrido el tiempo de incubacin (16 minutoss) se proced
de a la lectuura de los re
esultados
tantodeeformavisuaalcomoatra
avsdellect orROSAPeaarlReader(C
CharmSciencces,Inc.).En laFigura
6seobservaelproceedimientoem
mpleadoparralarealizacindeestem
mtodo.
Figura6.ProcedimienntodelmtodoCharmM
MRLBL/TET
muestra se valorar
v
com
mo positiva oo negativa, dependiendo
d
o de la
La m
intensidaaddelasban
ndascolorea
adasdelasigguienteform
ma:
Silaabandadelamuestraessmsintenssaoigualquelabandaccontrol,
lamuesttraseconsideranegativa
a.
control,lamuestraeesinterpretadacomopossitiva.
Silaabandaconttrolnoseob
bservaobiennestincom
mpleta,elressultado
esinterp
pretadocomoinvalido.
3.4..3SNAP(Bettalactam,Te
etracycliney
yGentamicin
n)
El m
mtodo SNA
AP en sus versiones Betaalactam, Tettracycline y Gentamicin (IDEXX Labo
oratories,
Inc. Weestbrook, EEUU) ha sido desarrollaado para la deteccin de antibitticos betalacctmicos,
pectivamentee.Sepresen
ntaenempaquesindividdualesque contienen
c
tetraciclinas ygentaamicina,resp
muestra de le
eche y el
un tubo con la pasttilla del receptor, una piipeta de plstico para dosificar la m
dispositivodeltest.
mtodohay quecolocar400Ldelamuestrade lecheeneltuboque
Paraalarealizacindeestem
contienee los recepto
ores, agitar para disolveerlos y coloccar en el blo
oque calefacctor regulado a 45C
durante untiempod
de5minutosparaSNAPPBetalactam
mySNAPTettracyclineydde2minuto
osparael
E dispositivo SNAP tam
mbin se mantiene en el incubadoor, junto al tubo de
SNAP Gentamicin. El
mpo.
muestra,durantetodoestetiem
nscurridala primeraincu
ubacin,sevvierteelcontenidodeltubodentroddelpocillodeprueba
Tran
del dispositivo SNAP
P. La fluye a
a travs de la ventana de
d resultado
os haca el ccrculo de acctivacin.
n empieza a desaparece
er, se presiona el activaador y se realiza una
Cuando el crculo de activacin
Betalactamy SNAPTetraacyclinemien
ntrasque
segundaaincubacin quedura4 minutosparraelSNAPB
paraelSSNAPGentam
micin,esde7
7minutos.
Possteriormentee, se realiza la lectura de maneraa visual y con el lectorr SNAP sho
ot (IDEXX
ories, Inc.) que
q da como resultado un ratio co
omprendido entre 0y >5 indicando si la
Laborato
21
Materialesymtodos
muestra de leche es positiva o negativa. EEn la Figura 7 se muestrra el proceddimiento dell mtodo
SNAP.
Fig
gura7.ProceedimientodeelmtodoSN
NAP
ualmentesepuedeninte
erpretarlos resultados
Visu
delamaanerasiguien
nte:
Sieelpuntodem
muestraesm
msintensoooigualque
elpunto
ocontrol,lam
muestraseconsideraneggativa.
queelpu
untocontroll,lamuestra seconsideraapositiva.
3.4..4TwinsenssorBT
Elm
mtodoTwin
nsensorBT(Un
nisensor.Lieeja,Blgica)
es un aanlisis que involucra dos receptorres en una sola operaccin. Utiliza dos elemen
ntos que
ndenunpocilloqueconttieneciertaccantidaddeambosrecep
ptoresligadoosapartcula
asdeoro
compren
yunatirraquecomponeunconju
untodemem
mbranasdon
ndehaytreslneasdeca ptura(unalneapara
betalactmicos,unalneacontro
olyotraparaalastetracicllinas).
Paraalarealizacindeltestssecolocan2000Ldelech
heencadapo
ocillo,semeezclanysere
ealizauna
primera incubacin de 3 minu
utos de du racin, a una tempera
atura de 400C en el in
ncubador
ensor). A co ntinuacin, se sumerge la tira en ell pocillo perrmitiendo
temporizzado Heat Sensor (Unise
quelaleechefluyaattravsdeella
arealizando unasegundaincubacin
nduranteotrros3minuto
os.
Tran
nscurrido esste tiempo, se retira la tira del poccillo y se procede a la lectura visual de los
resultadosyconel lectorRead Sensor(Unissensor),indiicandosila muestraes positivaonegativaa
mtodoTwin
nsensorBT
betalactmicosy/ottetraciclinas.EnlaFiguraa8semuestrraelprocedimientodelm
Procedimiento
toanalticod
delmtodoTwinsensor
Figura8.P
BT
22
Materialesymtodos
Lainterpretacinvisualdelosresultadosserealizadelasiguientemanera:
Silasbandasdelamuestrasonmsintensaso
igualquelabandacontrol,lamuestraseconsidera
negativaalosdosantibiticos.
3.5 AnlisisEstadstico
Losclculosdelasmedias,desviacionesestndar,mximosymnimosdelacomposicindela
leche de cabra, del recuento de clulas somticas y de los grmenes totales, se realizaron con el
anlisis multidimensional del paquete estadstico Statgraphics 5.1 (2001). En el caso de las clulas
somticasydelosgrmenestotales,seempleoellogaritmodecimaldelrecuento.
Para analizar las posibles causas de los resultados falsos positivos obtenidos, se realiz un
Elmodeloutilizadofueelsiguiente:
Li=logit[Pi]=0+1[semana]+2[pH]+3[G]+4[P]+5[L]+6[ST]+7[logRCS]+8[logRGT]+i
Donde:
modelo;semanai=estadodelalactacin,pHi=valoresdepH,Gi=grasa;Pi=protena;Li=lactosa;STi=
slidos totales; logRCSi= logaritmo decimal del recuento de clulas somticas; logRGTi= logaritmo
decimaldelrecuentodegrmenestotalesyi=errordelmodelo.
23
ResultadosyDiscusin
ResultadosyDiscusin
IV.RESULTADOSYDISCUSIN
1. ESPECIFICIDADDELOSMTODOSDEUNINARECEPTORESPROTEICOSENLECHEDECABRA
1.1.BetaStarCombo
Para el clculo de la especificidad del mtodo BetaStar Combo se utilizaron un total de 350
muestrasdelechedecabralibresdeantibiticos.
En el Cuadro 6 se resume la composicin qumica y la calidad higinica de las muestras de
lechedecabrautilizadasenelestudiodeespecificidaddeestemtodo.Estosvaloresseencuentran
dentro del rango especificado por diferentes autores para la leche de cabra de raza Murciano
Granadina(QuilesyHevia,1994;Vert,2004;Boza,2007).
Cuadro6.Caractersticasdelalechedecabrautilizadaenelestudiodelaespecificidad
delmtodoBetaStarCombo
Parmetros
pH
Grasa(%)
Protena(%)
SlidosTotales(%)
RGT(x103ufcl/ml)
LogRGT
RCS(x103cel/ml)
LogRCS
Media
6,79
5,60
3,72
14,65
75
4,56
1.019
5,76
SD
0,09
1,16
0,48
1,55
200
0,40
1.536
0,42
Mnimo
6,50
3,23
2,44
11,05
10
4
75
4,87
Mximo
7,14
11,44
5,36
20,48
2.289
6,35
15.456
7,18
SD:Desviacinestndar;RGT:Recuentodegrmenestotales,SCC:Recuentodeclulassomticas
Cuadro7.ResultadosobtenidosenelestudiodelaespecificidadparaelmtodoBetaStarCombo
Clasificacinmuestras(1)
Negativas/Totalmuestras
Especificidad(%)
(1)
Betalactmicos
Visual
Lector
P
D
N
P
N
4
5
341
3
347
341/350
347/350
97
99
Tetraciclinas
Visual
Lector
P
D
N
P
N
3
1
346 3 347
346/350
347/350
98
99
Clasificacinmuestras:P=positiva,D=dudosayN=negativa
25
ResultadosyDiscusin
Para la deteccin de antibiticos betalactmicos, la especificidad calculada a partir de la
interpretacin visual de los resultados fue de 97% mientras que cuando se utiliza la lectura
instrumentalderesultados,laespecificidadaumentahastael99%.Seobservaqueconlautilizacin
dellectorseobtieneunmenorporcentajederesultadospositivosaldiscriminarmejorlasmuestras
deinterpretacinvisualdudosa,aunqueestadiferencianollegaserestadsticamentesignificativa
(p>0.05).
EstosresultadossonsimilaresalosobtenidosporSternesjyJohnsson(2003)enunmtodo
similar de la misma firma comercial para la deteccin rpida de betalactmicos en leche de vaca
(BetaStar,NeogenCorporation),quienescalcularonunaespecificidadde99.9%enmuestrasdeleche
de tanque. Ms recientemente, Borrs (2011), obtiene una menor especificidad para este mismo
mtodo(97%)conmuestrasindividualesdelechedevaca.
Enelcasodeladeteccindelosantibiticosdelgrupodelastetraciclinas,tambinseobserva
unamayorespecificidadcuandostasecalculaapartirdelalecturainstrumentalderesultados(99%
lectura instrumental vs 98% lectura visual) aunque en este caso la diferencia tampoco lleg a ser
estadsticamentesignificativa(p>0.05).
EnlaFigura9sepresentalaevolucindelaespecificidadcalculadaconlechedecabraapartir
delaslecturasinstrumentalesdelmtodoBetaStarComboalolargodelalactacin.Enellasepuede
observar que los resultados positivos obtenidos (3) se encuentran en el primer y ltimo mes de la
lactacintantoparalosantibiticosbetalactmicos(semanas4y26)comoparalosdelgrupodelas
tetraciclinas(semana6y24),aunqueelreducidonmerodeestosresultadosnopermiteningntipo
deconclusin.
Especificidad(%)
110
Betalactmicos
Tetraciclinas
100
90
80
70
2
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Semanadelactacin
Figura9.EvolucindelaespecificidaddelmtodoBetaStarComboenlechedecabra
alolargodelperododelactacin
26
ResultadosyDiscusin
1.2CharmMRLBL/TET
Las caractersticas de las 350 muestras individuales de leche de cabra empleadas para el
clculodelaespecificidaddelmtodoCharmMRLBL/TETsepresentanenelCuadro8.
Las muestras de leche de cabra utilizadas en este estudio presentaron una composicin
qumica y una calidad higinica similar a la sealada por otros autores (Quiles y Hevia, 1994; Vert,
2004;Boza,2007)paralalechedecabra.
Cuadro8.Caractersticasdelalechedecabrautilizadaenelestudiodelaespecificidad
delmtodoCharmMRLBL/TET
Parmetros
pH
Grasa(%)
Protena(%)
SlidosTotales(%)
RGT(x103ufc/ml)
LogRGT
RCS(x103cel/ml)
LogRCS
Media
6,78
5,74
3,82
15,0
74
4,5
975
5,68
SD
0,09
1,16
0,48
1,51
306
0,40
1.737
0,49
Mnimo
6,55
3,31
2,68
12,13
10
4,0
37
4,57
Mximo
7,13
10,61
6,03
20,48
4.829
6,68
16.837
7,23
SD:Desviacinestndar;RGT:Recuentodegrmenestotales,RCS:Recuentodeclulassomticas
EnelCuadro9sepresentanlosresultadosobtenidosenelestudiodeespecificidaddelmtodo
CharmMRLBL/TETconlechedecabra.Enlsepuedeobservarlaaltaespecificidadquepresentael
mtodo en este tipo de leche tanto para la deteccin de antibiticos betalactmicos como de
tetraciclinas (98% y 100%, respectivamente) segn la interpretacin realizada por el ROSA Reader
(CharmSciences,Inc.).
La especificidad calculada a partir de la interpretacin visual de los de resultados fue
ligeramente inferior aunque no llegaron a encontrarse diferencias estadsticamente significativas
(p>0.05).
Cuadro9.ResultadosobtenidosenelestudiodelaespecificidadparaelmtodoCharmMRLBL/TET
Betalactmicos
Tetraciclinas
Visual
Lector
Visual
Lector
P
D
N
P
D
N
P
D
N P D
N
(1)
Clasificacinmuestras
7
2 341
7
0
343 0
1 349 0
0 350
Negativos/Totalmuestras
341/350
343/350
349/350
350/350
Especificidad(%)
97
98
99
100
(1)
Clasificacinmuestras:P=positiva,D=dudosayN=negativa
27
ResultadosyDiscusin
Rocaycol.(2007)evaluaronelmtodoCharmMRLBL/TETenlechedevacayobtuvieronuna
especificidadde100%paraladeteccindeantibiticosbetalactmicos.Sinembargo,Muro(2008),
enmuestrasdelechedeoveja,sealaunaespecificidadparaestemtodode90%,valormuyinferior
al encontrado en el presente trabajo. En cuanto a la deteccin de tetraciclinas, la especificidad
calculada por estos autores para la leche de vaca y de oveja, respectivamente, fue ligeramente
inferior(99%)alaobtenidaenesteestudioparalalechedecabra.
EnlaFigura10serepresentalaevolucindelaespecificidaddelmtodoCharmMLRBL/TET
con leche de cabra, a lo largo del perodo de lactacin. En ella se observa que los reducidos
resultados falsos positivos obtenidos, se encuentran en los dos primeros meses de lactacin
(semanas4y8)yenlosdosltimos(semanas20,24y26).
.
Especificidad(%)
130
120
Betalactmicos
Tetraciclinas
110
100
90
80
70
2
10
12 14 16 18
Semanasdelactacin
20
22
24
26
28
Figura10.EvolucindelaespecificidaddelmtodoCharmMLRBL/TETenlechedecabraa
lolargodelperiododelactacin
1.3.SNAP
La especificidad del mtodo SNAP en tres de sus versiones (SNAP Betalactam, SNAP
TetracyclineySNAPGentamicin),sedeterminempleandomuestrasindividualesdelechedecabra
durante todo el periodo de lactacin. Las muestras utilizadas para el clculo de la incidencia de
resultadosfalsospositivosenestosmtodosdecribado,fueronlasmismasquelasempleadasen
elcasodelBetaStarComboysuscaractersticasserecogenenelCuadro6.
Los valores de especificidad calculada a partir de las interpretaciones visuales y las lecturas
instrumentales del mtodo SNAP Betalactam con leche de cabra se presentan en el Cuadro 10,
donde se observa una menor especificidad (93,4%) para las interpretaciones visuales que para las
instrumentales (95%), aunque no se encontraron diferencias significativas (p>0.05) en funcin del
tipodelecturautilizado.
28
ResultadosyDiscusin
Cuadro10.Resultadosobtenidosenelestudiodelaespecificidad
paraelmtodoSNAPBetalactam
Clasificacinmuestras(1)
Negativos/Totalmuestras
Especificidad(%)
SNAPBetalactam
Visual
Lector
P
D
N
P
N
18
5
327
18
332
327/350
332/350
93,4
95
(1)
Clasificacinmuestras:P=positiva,D=dudosayN=negativa
EstosresultadossonsimilaresalosobtenidosporZengycol.(1998)conmuestrasdelechede
cabra,quienescalculanparaestemtododecribado,unaespecificidadde96.1%.Sinembargo,son
muyinferioresalosobtenidosporContrerasycol.(1997)tambinconlechedecabra(100%)yalos
indicados por otros autores en leche de otras especies. As, Sternesj y Johnsson (2003) y Borrs
(2011)conmuestrasdelechedevaca,obtienenparaelSNAPBetalactamunaespecificidadde98%y
100%,respectivamente.Mientrasqueenmuestrasdelechedeoveja,Berrugaycol.(2009)calculan
paraestemtodounaespecificidadde99%.
Con objeto de determinar las posibles causas de la aparicin de este elevado porcentaje de
resultados falsos positivos en el mtodo SNAP Betalactam con muestras de leche de cabra, se
realizunanlisisestadsticodelosdatosmediantelaaplicacindeunmodeloderegresinlogstica
que considera como factores de variacin la semana de lactacin, el pH, los componentes
mayoritariosdelaleche,elrecuentodegrmenestotalesyeldeclulassomticas,dondesepuede
observarquenicamenteelRCStuvounefectosignificativosobrelaincidenciaderesultadosfalsos
positivos(X2=8,7503yp=0,0031)
La ecuacin resultante de la aplicacin del modelo de regresin logstica, que present un
buenniveldeajuste,fuelasiguiente:
Lijk=8.6232.023[logRCS]
(X2=1.1795yp=0,5545)
MaronCarraroyRodrigues(2000)tambinobservaronunefectosignificativodelRCSsobrela
respuestadelmtodoSNAPBetalactamenlechedecabrapero,adiferenciadeloindicadoporestos
autores, las muestras positivas obtenidas en este trabajo (n=18) presentaron un menor recuento
celular(5.500.29)queaquellasqueresultaronnegativas(n=332;5.790.42).
En cuanto a la especificidad del mtodo SNAP Tetracycline con muestras de leche de cabra,
esteparmetroresultde100%,conindependenciadelsistemadelecturaempleado(p>0.05).Este
valor es superior al obtenido por Berruga y col. (2009) en muestras de leche de oveja que fue de
96%,loquepuedeserdebidoalasdiferenciasenlacomposicindelalechedeambasespecies.
29
ResultadosyDiscusin
Respecto al mtodo SNAP Gentamicin, la especificidad calculada con muestras de leche de
cabra tambin ha sido de 100% no encontrando diferencias significativas (p>0.05) con respecto al
sistemadelecturautilizado.Enestecasonosehaencontradoningunareferenciabibliogrficaconla
quepodercompararlosresultadosobtenidosenestetrabajo.
En la Figura 11 se presenta la evolucin de la especificidad de las distintas versiones del
mtodo SNAP a lo largo del periodo de lactacin. En ella se puede ver que el mtodo SNAP
Betalactam presenta resultados positivos en gran parte de las semanas de ordeo consideradas,
presentandolosvaloresdeespecificidadmsbajos(88%)duranteelltimomesdelalactacin.
Betalactmicos
Tetraciclinas
Gentamicina
Especificidad(%)
110
100
90
80
70
2
10 12 14 16 18
Semanasdelactacin
20
22
24
26
28
Figura11.EvolucindelaespecificidaddelmtodoSNAPenlechedecabraalolargodela
lactacin
1.4.TwinsensorBT
Lasmuestrasanalizadasparaevaluarlaespecificidaddel mtodoTwinsensorBT conleche de
cabra,fueronlasmismasquelasutilizadasconelmtodoBetaStarCombo(Cuadro6).
A su vez, el Cuadro 11, presenta los resultados de la especificidad calculada para el mtodo
TwinsensorBTsegnlosresultadosobtenidosconlainterpretacinvisualylalecturainstrumentalde
laspruebasrealizadas.
Cuadro11.ResultadosobtenidosenelestudiodelaespecificidadparaelmtodoTwinsensorBT
Clasificacinmuestras(1)
Negativos/Totalmuestras
Especificidad(%)
(1)
Betalactmicos
Visual
Lector
P
D
N
P
D
N
21 19 310 23
24 303
310/350
303/350
89
87
Tetraciclinas
Visual
Lector
P
D
N P D
N
1
0 349 1
0 349
349/350
349/350
99.7
99.7
Clasificacinmuestras:P=positiva,D=dudosayN=negativa.
30
ReesultadosyD
Discusin
Laa especificidad calculada
a para la deeteccin de betalactmiicos en el m
mtodo Twin
nsensorBT
segnlaainterpretacinvisualde
elosresultaddoshasido de89%yaq
queseobserrvaronuntotalde40
ormes, de lo
os cuales caasi el 50% se
s correspon
nden con reesultados de
e dudosa
resultados no confo
ndo se utilizan los resulttados obten
nidos median
nte la utilizaacin del lecctor Read
interprettacin. Cuan
Sensor ((Unisensor), la especificidad es mennor alcanzando un valor de 87%. Al igual que en el caso
0%delos
anterior,,laproporciinderesulttadosdeduddosainterpretacinreprresentaalreddedordel50
muestrasnoconform
mesobtenida
asenesteesstudio.
Laas diferencias observada
as no fueronn estadsticam
mente signifficativas (p>00.05) y podrran estar
relacionaadasconlad
diferentepercepcinde lasbandasccoloreadasd
deltestporppartedelojo
ohumano
ydellecctorutilizado
o.As,8delosresultadoosquefueroninterpretadoscomon egativosme
ediantela
lecturavvisualdelas pruebas,fue
eronclasificaadoscomoligeramentepositivos(LPPOS)porellectory5
delasmuestrasclasiificadasvisua
almentecom
modudosas,resultaronp
positivasparaaellector.
En
n cualquier caso,
c
estos resultados ddifieren conssiderablemen
nte de los oobservados por
p otros
autores enlechede diferentese
especies.As,Berrugay col.(2009)yyMuro(20088)enleche deoveja,
e 95% para la deteccin
n de antibitticos betalacctmicos mediante el
obtuvierron una espeecificidad de
mtodo TwinsensorBT. Por su pa
arte, Borrs (2011) obtu
uvo una especificidad m
ms elevada (98%) en
muestrasdelechedeevaca.
En
nelcasode ladeteccin
ndetetracicllinas,laespe
ecificidadparaestemtoodoresultad
de99.7%
conindeependenciad
deltipodele
ecturaempleeado.Estosrresultadosso
onsuperioreesalosobten
nidospor
Berruga ycol.(2009
9)conleche deovejaypporBorrs(2
2011)enlecchedevaca, queobservaronuna
especificcidadde97yy98%,respectivamente.
En
n la Figura 12 se pre
esenta la evvolucin de
e la especifficidad calcuulada en ba
ase a la
interprettacininstru
umentalderresultadosdeelmtodoTTwinsensorBT alolargodeelalactacin.Enella
se obserrva que la especificidad para la deteeccin de an
ntibiticos betalactmicoos en leche de cabra
presentaa pequeas fluctuacione
es durante loos cuatro primeros mese
es de ordeoo para descender de
manera muyacusad
daapartirde
elquintomeesdelactacin,llegando
oaalcanzar unaespecificidadde
Especificidad(%)
tansloun48%eneelmomentodelsecado.
100
80
Betalactmicos
60
Tetraciclinas
40
2
8 10 12 14 16 18
8 20 22 24 26 28
Sema nadelactaccin
gura12.Evo
olucindelaespecificidadddelmtodo
oTwinsensorrBTenlecheddecabraalo
olargo
Fig
delalactaccin
31
ResultadosyDiscusin
Paraevaluarlasposiblescausasdelaelevadaincidenciaderesultadosfalsospositivosquese
producenespecialmenteenlosltimosmesesdeordeo,serealizunanlisisestadsticomediante
laaplicacindeunmodeloderegresinlogsticaqueconsideracomofactoresdevariacinelestado
delalactacinylasdiferentescaractersticasdelalecheestudiadas.
EnelCuadro12,dondesepresentanlosresultadosdelanlisisestadstico,seobservaelefecto
significativo(p<0.05)delasemanadelactacin,elpHdelalecheyelcontenidoenprotenabruta,
sobrelarespuestadelmtodoTwinsensorBTparaladeteccindeantibiticosdetipobetalactmico.
Cuadro12.Efectodelascaractersticasdelalechesobrelaincidencia
deresultadosfalsospositivosenelmtodoTwinsensorBT
2
94.5474
4.4962
5.0061
Parmetro
Semana
pH
Protena
p
<0.001
0.0340
0.0253
Laecuacinresultantedelaaplicacindelmodelologsticofuelasiguiente:
y=29.866+0.329[Semana]5.019[pH]1.071[Protena]
(X2=15.225yp=0,0016)
Aunquelosresultadosdelanlisisestadsticosugierenquelaincidenciaderesultadosfalsos
positivos en el mtodo TwinsensorBT con muestras de leche de cabra, estara relacionada con el
estadodelalactacin,elpHdelalecheysucontenidoenprotenabruta,laecuacindeprediccin
deresultadosfalsospositivosobtenida,nopresentaunadecuadoniveldeajusteconlosresultados
observadosenellaboratorio,loqueindicaraquelasdiferenciasencontradassonestadsticamente
significativas(p<0.05).
2.
RECEPTORESPROTEICOSENLALECHEDECABRA
2.1 BetaStarCombo
EnelCuadro13sepresentalaCapacidaddeDeteccin(CC)delmtodoBetaStarComboen
leche de cabra. Como se puede observar en dicho cuadro, este mtodo permite la deteccin de
todoslosantibiticosbetalactmicosensayadosaconcentracionesinferioresalLMRestablecidoen
lalegislacin,conexcepcindelacefalexinaydelceftiofurquepresentaronunvalordeCCsuperior
alLMR.
Con respecto a la deteccin de las tetraciclinas en la leche de cabra, el mtodo BetaStar
Comboresultsermuysensiblealaoxitetraciclinayalatetraciclina,presentandounvalordeCC
inferioralLMRparaestassustancias.Sinembargo,laclortetraciclinanofuedetectadaaningunade
lasconcentracionesensayadassiendoportantosuCCmayorqueelLMR.
32
ResultadosyDiscusin
En otros estudios llevados a cabo con leche de vaca y con el mtodo BetaStar (Neogen)
indicado para la deteccin rpida de residuos de antibiticos betalactmicos, Zvirdauskien y
Salomskiene (2007) coinciden con Suhren y col. (2004) en que BetaStar es un buen mtodo para
detectarpenicilinaG,amoxicilinayampicilinaaconcentracionesinferioresalLMR.
Ms recientemente, Reybroeck y col. (2010) validaron el mtodo BetaStar en leche de vaca
siguiendounprocedimientosimplificadodeensayoenelquesereducaeltiempodeincubacinde5
minutos (3+2) a tan slo dos minutos (1+1) y tambin observaron resultados similares a los
obtenidos en este trabajo. De todos los betalactmicos ensayados, slo la cefalexina y el ceftiofur
presentaronunaCapacidaddeDeteccinsuperioralLMR
Cuadro 13. Capacidad de Deteccin (CC) del mtodo BETASTAR COMBO para antibiticos
betalactmicosytetraciclinasenlechedecabra.
Grupo
Antimicrobiano
Nombredel
Antibitico
LMR
(g/Kg)
Amoxicilina
lactmicos
Tetraciclinas
Ampicilina
Cloxacilina
4
30
PenicilinaG
Cefalexina
100
Cefalonium
Cefapirina
Cefoperazona
20
60
50
Ceftiofur
100
Clortetraciclina
100
Oxitetraciclina
100
Tetraciclina
100
Concentracin
evaluada
(g/Kg)
2
3
2
15
2
3
50
75
100
10
30
25
50
75
100
50
75
100
50
50
75
Negativas/
muestras
totales
6/20
0/40
1/20
0/20
5/20
0/40
20/20
40/40
57/60
0/20
0/20
0/20
16/20
36/40
52/60
19/20
34/40
21/60
0/20
2/20
0/40
Resultados
CC
Positivos
(g/Kg)
(%)
70
3
100
95
2
100
15
75
3
100
0
0
>100
5
100
10
100
30
100
25
20
10
>100
13
5
15
>100
65
100
50
90
75
100
2.2CharmMRLBL/TET
El Cuadro 14 resume los resultados del estudio de evaluacin de la Capacidad de Deteccin
(CC)delmtodoCharmMRLBL/TETparaalgunosantibiticosbetalactmicosyotrosdelgrupode
lastetraciclinas,conlechedecabra.
33
ResultadosyDiscusin
Cuadro 14. Capacidad de Deteccin (CC) del mtodo CHARM MRL BL/TET para antibiticos
betalactmicosytetraciclinasenlechedecabra.
Grupo
Antimicrobiano
lactmicos
Tetraciclinas
Nombredel
Antibitico
LMR
(g/Kg)
Amoxicilina
Ampicilina
Cloxacilina
30
PenicilinaG
Cefalexina
Cefalonium
Cefapirina
Cefoperazone
Ceftiofur
4
100
20
60
50
100
Clortetraciclina
100
Oxitetraciclina
Tetraciclina
100
100
Concentracin
evaluada
(g/Kg)
2
3
4
2
3
4
Negativas/
muestras
analizadas
20/20
12/40
3/60
10/20
13/40
2/60
Resultados
CC
Positivos
(g/Kg)
(%)
0
70
4
95
50
68
4
97
15
19/20
23
36/40
10
30
2
50
10
30
25
50
50
75
50
50
51/60
0/20
0/20
0/20
0/20
0/20
0/20
4/20
2/40
0/20
1/20
15
100
100
100
100
100
100
80
95
100
95
>30
2
50
10
30
25
50
75
50
50
Como se puede observar en el Cuadro 14, la Capacidad de Deteccin (CC) del mtodo
Charm MRL BL/TET para los antibiticos betalactmicos, fue inferior al LMR establecido en la
legislacin para el caso de la penicilina G y las cefalosporinas cefapirina, cefoperazona, ceftiofur y
cefalexina,loqueindicaunaelevadasensibilidaddelmtodoparaladeteccindeestassustancias.
Enelcasodelaamoxicilina,laampicilinayelcefalonium,elCCcalculadoresultigualalvalordel
LMR.Porelcontrario,elmtodoCharmMRLBL/TET,nofuecapazdedetectarlacloxacilinaauna
concentracinequivalentealLMRestablecidoparaestasustancia(CC>30g/Kg).
En el caso de las tetraciclinas, el mtodo Charm MRL BL/TET detect la presencia de estas
sustanciasenlalechedecabraaunaconcentracininferioralLMRestablecido(100g/Kg),siendoel
CCde75g/Kgparalaclortetraciclinayde50g/Kgparalaoxitetraciclinaylatetraciclina.
Muro (2008), seala que el mtodo Charm MRL BL/TET en leche de oveja present una
sensibilidad elevada (90100%) a antibiticos betalactmicos como ceftiofur, cefalexina y
cefoperazona; con respecto a las tetraciclinas fue el mtodo fue 100% sensible a la oxitetraciclina,
87%atetraciclinaypresentunasensibilidadmuybaja(23%)paralaclortetraciclina.
34
ResultadosyDiscusin
PorsuparteRocaycol.(2007),enestudiosenlechedevacasealun100%desensibilidad
parapenicilinaG,cefalexinaycefoperazonayenelcasodecloxacilinaobservresultadossimilaresa
losresultadosobtenidosenestetrabajo.
En otro mtodo de la misma casa comercial, Charm MRL 3BL, diseado para la deteccin
rpida de antibiticos betalactmicos en leche, Reybroeck (2011) con muestras de leche de vaca,
obtuvoresultadoscoincidentesconlosobservadosenesteestudioaexcepcindelacloxacilina,que
spudoserdetectadaaunaconcentracininferioralLMRestablecido.
2.3SNAP(Betalactam,TetracyclineyGentamicin)
LosresultadosobtenidosenladeterminacindelCCparalastresversionesdelmtodoSNAP
evaluadasconmuestrasdelechedecabra,seresumenenelCuadro15.ElmtodoSNAPBetalactam
fuecapazdedetectartodoslosantibiticosbetalactmicosensayadosaconcentracionesinferioresal
LMRestablecidoenlalegislacin.
Cuadro15.CapacidaddeDeteccin(CC)delmtodoSNAP(SNAPBetalactam,SNAPTetracycliney
SNAPGentamicin)paraantibiticosbetalactmicosytetraciclinasenlechedecabra.
Nombredel
Antibitico
LMR
(g/Kg)
Amoxicilina
Ampicilina
Cloxacilina
PenicilinaG
30
4
Cefalexina
100
Cefalonium
20
Cefapirina
60
Cefoperazone
50
Ceftiofur
100
Clortetraciclina
100
Oxitetraciclina
Tetraciclina
Aminoglucsidos Gentamicina
100
100
100
Grupo
Antimicrobiano
lactmicos
Tetraciclinas
Concentracin
evaluada
(g/Kg)
2
3
2
3
15
2
50
75
10
15
30
25
38
50
50
75
100
50
50
50
Negativas/
muestras
totales
2/20
1/40
2/20
0/40
1/20
0/20
19/20
0/40
20/20
0/40
0/20
20/20
0/40
0/20
20/20
40/40
60/60
0/20
0/20
0/20
Resultados
CC
Positivos
(g/Kg)
(%)
90
3
98
90
3
100
95
15
100
2
5
75
100
0
15
100
100
30
0
38
100
100
50
0
0
>100
0
100
50
100
50
100
50
35
ResultadosyDiscusin
En el caso de los antibiticos del grupo de las tetraciclinas, el mtodo SNAP Tetracycline,
present un valor de CC por debajo del LMR para el caso de la oxitetraciclina y de la tetraciclina
peronopudodetectarlapresenciadeclortetraciclinaenlalecheaunaconcentracinequivalenteal
LMR(100g/Kg).
Porltimo,elSNAPGentamicindetectlapresenciadegentamicinaenlalechedecabraauna
concentracinequivalentea0.5xLMRestablecidoparaesasustancia.
Suhrenycol.(1998)realizaronunestudioconmuestrasdelechedevacaparadeterminarla
sensibilidad del SNAP Betalactam a diferentes sustancias observando que todos los betalactmicos
ensayados fueron detectados a una concentracin inferior al LMR excepto la amoxicilina, que slo
pudoserdetectadaaconcentracionescomprendidasentre1.5y2.7veceselLMR.
Borrs(2011)enlechedevacaindica queelmtodoSNAPBetalactames muysensible para
sustancias como la cefoperazona y la cefalexina, mientras que para ampicilina y la cloxacilina
presentanunasensibilidadmuybaja(20%y40%,respectivamente).Asuvez,Muro(2008)enleche
de oveja, seala que la sensibilidad de este mtodo es de 100% para el ceftiofur, cefalexina y
cefoperazonamientrasquepresentaunamenorsensibilidadparalapenicilinaylaampicilina(80%y
53%, respectivamente). En el caso de las tetracilinas, Muro (2008) indica una sensibilidad de 100%
paralaoxitetraciclinayde63%paralaclortetraclina,loquedifieredelosresultadosobtenidosen
estetrabajo.
2.4TwinsensorBT
EnelCuadro16sepresentanlosresultadosdelestudiodelaCapacidaddeDeteccin(CC)del
mtodoTwinsensorBTparaalgunosantibiticosbetalactmicosytetraciclinasenlalechedecabra.
El mtodo TwinsensorBT presenta un valor de CC inferior al LMR para la amoxicilina,
ampicilina,cloxacilina,penicilinaG,cefalexina,cefalonium,cefapirinayceftiofur,mientrasqueelCC
paralacefoperazonafueigualalLMR.
Enelcasodelastetraciclinas,laoxitetraciclinaylatetraciclinapresentaronunCCigualqueel
LMR establecido para estas sustancias (100 g/Kg). Sin embargo, la clortetraciclina no pudo ser
detectadaaestaconcentracin.
Perme y col. (2010) realiz una evaluacin del mtodo TwinsensorBT con leche de vaca y
observ resultados similares a los encontrados en este estudio para todos los antibiticos
considerados,esdecir,valoresdeCCLMR,aexcepcindela clortetraciclina quefue detectadaa
unaconcentracinigualalLMR.
Con leche de oveja, Muro (2008) seala una sensibilidad muy elevada para todos los
betalactmicos estudiados con el mtodo TwinsensorBT, excepto para la cefalexina que presenta
valoresligeramentesuperioresal50%.
36
ResultadosyDiscusin
Cuadro16.CapacidaddeDeteccin(CC)delmtodoTWINSENSORBTparaantibiticosbetalactmicos
ytetraciclinasenlechedecabra
Grupo
Antimicrobiano
lactmicos
Tetraciclinas
Concentracin Negativas/
evaluada
muestras
(g/Kg)
totales
2
5/20
3
1/40
2
4/20
3
0/40
Resultados
CC
Positivos
(g/Kg)
(%)
75
3
97,5
80
3
100
Nombredel
Antibitico
LMR
(g/Kg)
Amoxicilina
Ampicilina
Cloxacilina
30
15
0/20
100
15
PenicilinaG
4
100
Cefalonium
Cefapirina
20
60
Cefoperazone
50
Ceftiofur
100
Clortetraciclina
100
Oxitetraciclina
100
Tetraciclina
100
1/20
3/20
0/40
0/20
0/20
4/20
6/40
0/60
0/20
16/20
37/40
58/60
0/20
11/20
0/40
95
85
100
100
100
80
85
100
100
20
7,5
33
100
45
100
Cefalexina
2
50
75
10
30
25
38
50
50
50
75
100
50
50
75
75
10
30
50
50
>100
50
75
3.
PROTEICOSENLECHEDECABRA
3.1. BetaStarCombo
LosresultadosdelestudiodelefectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoBetaStarCombo
se interpretaron de manera visual y mediante la utilizacin del lector AccuScan III (Neogen
Corporation)quegener2tiposdelecturas:unalecturaparaladeteccindebetalactmicosyuna
lectura T para la de tetraciclinas. Las lecturas visuales coincidieron con las proporcionadas por el
lector.
EnlaFigura13sepresentaelefectodelazidiolsobrelarespuestadelmtodoBetaStarenla
lechedecabrasinantibiticos.EnellaseobservaquetantolalecturacomolalecturaTdisminuyen
en las muestras de leche adicionadas de azidiol aunque esto no modifica la clasificacin de las
muestrasqueresultaronnegativasentodosloscasos.
37
ReesultadosyD
Discusin
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
CConAzidiol
5,000
SSinAzidiol
6,000
7,000
8,000
Lecctura
LecturaT
FFigura13.Effectodelazid
diolsobrela respuestadeelmtodoBe
etaStarCombboparalech
he
biticos
decabbrasinantib
Co
onrespectoalaslecturasobtenidas aladicionarantibiticosalasmuestrrasdelechedecabra
(4g/KggpenicilinaG
Gy100g/Kggoxitetracic lina),sepuedeobservar(Figura14)qquelosvalorresdelas
lecturas y T son superiores en las mueestras de lecche con con
nservante auunque en este caso,
oseveafecttadalainterp
pretacindeelosresultad
dosyaquee
el100%delaasmuestras deleche
tampoco
analizadasfueronclaasificadascomopositivass.
Laacomparaci
ndelosresultadosobteenidosenesteestudionohasidopoosibleyaquenoseha
encontraado ningn trabajo que
e evale el efecto del azidiol sobrre la respueesta de este
e tipo de
mtodossdecribado..
Figura
a14.Lecturassobtenidaseenelestudioodelazidioleenelmtodo
oBetaStarCoomboparaleechede
cabraconpe
c
enicilinaGyo
oxitetraciclin
na
3.2 CharmM
MRLBL/TET
Deespus de analizar
a
diferentes tiposs de muestrras de leche
e de cabra aadicionadas o no de
conservaante con el mtodo Charm MRL BLL/TET, se de
etermin qu
ue el azidiol no presenta ningn
efecto sobre la resp
puesta de esste mtodo rpido de control,
c
ya que
q todas laas muestras libres de
38
ReesultadosyD
Discusin
sustancias antibiticcas mostraro
on un resultaado negativo
o con independencia deel mtodo de lectura
doylasadiciionadasdea
antibitico(ppencicilinay oxitetraciclinaalLMR), fueroninterrpretadas
emplead
comopo
ositivastanto
ovisualcomo
oinstrumenttalmente.
EEn la Figuraa 15 se reprresenta grfficamente el efecto de la presenciaa de azidiol sobre la
interprettacindelossresultados.Enellaseoobservaque lapresencia
adeazidioliincrementallalectura
enlasm
muestrasde lecheadicionadasde4 g/Kgdepe
encicilinaGm
mientrasqueeenlasmue
estrasde
leche neegativas (sin
n antibitico
o) y en las aadicionadas de 100 g//Kg de oxiteetraciclina apenas se
observan
n diferenciaas debidas a
a la presen cia del conservante. En cualquier caso, la desviacin
estndarr observadaa para cada uno de loss tipos de leche disminuye considderablementte en las
muestrasdelechead
dicionadasd
deantibiticoo.
3
3000
2
2000
1
1000
ConAzidio
ol
SinAzidiol
1
1000
2
2000
3
3000
Negativas
Penicili naG(4g/Kg)
Oxitetraciclin
na(100g/Kg)
Figura
a15.Efectod
delazidiolso
obrelarespuuestadelmttodoCharmMRLBL/TET
Tparaleched
decabra
A
Actualmentee no se ha
a encontraddo ningn estudio
e
que
e haya evalluado el effecto del
conservaante sobre la respuestta de este tipo de m
todos anallticos por llo no es posible la
comparaacindelosrresultadosobtenidosen elpresentetrabajo.
3.3 SNAPBeectalactam,SSNAPTetraccyclineySNA
APGentamiccin
NAP Betalacctam no se ve afectada por la
Laa interpretaccin de resultados del mtodo SN
presenciia de conservante en la
as muestras de leche adicionadas
a
o no de anttibitico (Figgura 16),
aunque hayquese
alarquelap
presenciadeelazidiolretaardalaaparicindelos puntosdele
ectura,lo
d 1.5 minutos respectoo al indicad
do por el
que incrrementa el tiempo de anlisis un promedio de
fabricantte. Adems,, tanto el punto
p
de m
muestra com
mo el punto control, prresentan una menor
intensidaadenlasmu
uestrasdeleccheadicionaadasdeconservante.
39
ReesultadosyD
Discusin
6
5
4
3
2
ConAzid iol
SinAzidiool
0
1
2
Neggativas
PenicilinaG(4g/Kg)
Figura116.EfectodeelazidiolsobrelarespuesstadelmtodoSNAPBettalactampar
aralechedeccabrasin
antibitiicosyconpenicilinaG
2,00
SSinAzidiol
1,00
0,00
1,00
Nega
ativas
Oxitetraciclina(100g/Kg)
Figura117.Efectodeelazidiolsobrrelarespuesstadelmtod
doSNAPTettracyclinepaaralechedeccabrasin
antibitiicosyconpenicilinaG
ReesultadosyD
Discusin
6
5
4
3
2
1
0
1
2
Negativas
Gentamicina(100g/Kgg)
ConnAzidiol
SinAzidiol
Figura118.EfectodeelazidiolsobrelarespuesstadelmtodoSNAPGentamicinparralechedeccabrasin
antibitiicosyconpenicilinaG
H
Hay que se
alar que tanto para loss mtodos SNAP
S
Betalacctam, SNAP Tetracycline
e y SNAP
Gentamiicina, no see han encon
ntrado datoos de estudios anteriorres que perrmitan comp
parar los
resultadosobtenidoss.
3.4 TwinsenssorBT
En
n la Figura 19 se repre
esenta grficcamente el efecto de la presenciaa de azidiol sobre la
interprettacindelossresultadosenelmtoddoTwinsenso
orBT.Altrata
arsedeunm
mtodocomb
binado,el
lectorgeener2tipossdelecturas:unalecturaa(betalactmicos)yun
nalecturaT((tetraciclinass).
EElconservan
nteazidiolno
otuvoningunnainfluenciaasobreelresultadodelm
mtodoTwin
nsensorBT
ya que todas las muestras
m
de leche de c abra sin antibiticos fu
ueron claram
mente negattivas con
onservante((Figura19).
independenciadelco
Figurra19.Lectura
asyTobteenidaseneleestudiodeazzidioldelmtodoTwinsen
ensorBTenlecchede
cabra
41
ResultadosyDiscusin
Respectoalasmuestrasdelecheadicionadasdeantibitico(4g/Kgdepenicilina Gy100
g/Kg) tampoco se encuentran diferencias en cuanto a la interpretacin de resultados aunque se
observaunincrementodelaslecturasenlasmuestrasadicionadasdeconservante.
Al igual que en los casos anteriores, no se han encontrado trabajos relacionados con este
estudioquepermitanlacomparacinderesultados.
42
Conclusiones
Conclusiones
V.CONCLUSIONES
Delosresultadosobtenidosenestetrabajo,sepuedenextraerlassiguientesconclusiones:
1.
Los mtodos de unin a receptores proteicos, con muestras individuales de leche de cabra,
presentaronunaespecificidadde100%,seguidosdeTwinsensor BT(99,7%)yBetaStarCombo(99%)
que tambin presentaron valores muy elevados, lo que indica que estos mtodos son altamente
especficos para el anlisis de muestras individuales de leche de cabra, es decir, que no presentan
interferenciasrelacionadasconestetipodeleche.
El SNAP Gentamicin tambin present una elevada especificidad (100%) con muestras
individualesdelechedecabra.
2.
antibiticosbetalactmicosytetraciclinasconrespectoalLMRenmuestrasindividualesdelechede
cabra, vara segn el mtodo y la sustancia antimicrobiana considerada. Para los antibiticos
betalactmicos,elSNAPBetalactamyelTwinsensorBTmostraronsercapacesdedetectartodoslos
antibiticosanalizadosanivelesinferioresoigualesalLMR,mientrasqueelCharmMRLBL/TETno
fuecapazdedetectarlacloxacilina,yelBetaStarCombo,nilacefalexinanielceftiofur.
Para el grupo de las tetraciclinas, el mtodo Charm MRL BL/TET present una Capacidad de
Deteccin(CC)paratodaslassustanciasanalizadasinferioralLMR,mientrasquelosmtodosSNAP
Tetracycline, BetaStar Combo y TwinsensorBT no fueron capaces de detectar la clortetraciclina a
nivelesdelLMR.
ElSNAPGentamicintambinpresentunaCapacidaddeDeteccininferioralLMRconmuestras
individualesdelechedecabraadicionadasdegentamicina.
3.
proteicos evaluados (Charm MRL BL/TET, BetaStar Combo, SNAP y TwinsensorBT) en muestras
individualesdelechedecabraconysinantibiticos.Sinembargo,enelmtodoSNAPBetalactamse
observ que al agregar azidiol a las muestras de leche, se retrasaba la aparicin de los puntos de
lectura lo que obliga a prolongar el tiempo de anlisis. Adems, la intensidad de dichos puntos es
menorenlasmuestrasadicionadasdeconservante.
De forma general, se puede concluir que los mtodos de unin a receptores proteicos
Conclusiones
losantibiticosanalizadosconrespectoalLMRestablecidoenlalegislacin,aexcepcindelmtodo
TwinsensorBT que present grandes interferencias a nivel de la lnea de betalactmicos, a pesar de
presentar una buena Capacidad de Deteccin (CC). Respecto a la deteccin de tetraciclinas todos
los mtodos fueron altamente especficos aunque la Capacidad de Deteccin (CC) para la
clortetraciclinasloresultadecuadaenelmtodoCharmMRLBL/TET,aunquehayqueindicarque
estatetraciclinaesmuypocoutilizadaenganadocaprino.
Por ltimo, hay que sealar que este trabajo se considera una aportacin a la limitada
Actualmente,seraconvenientemejorarlaespecificidaddealgunosdelosmtodosrpidosafin
deevitarlapresenciaderesultadosfalsospositivos,ascomodesarrollardiferentesmetodologas
quepermitanelanlisisdeotrosantimicrobianosdiferentesalosbetalactmicosylastetraciclinas
queseempleanhabitualmenteenelganadocaprinolecheroy,deestemodo,evitarlallegadaala
cadenaalimenticiadelechedecabraconresiduosdeantibiticosafindeprotegeralconsumidor.
45
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