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TÉCNICAS DE PRE-SEPARACIÓN EN EXTRACTOS

METANOLICOS DE CONIFERAS
(PICEA ABIES)

Dr. Gloria Cosco Salguero S.G.S. del Perú S.A.C, coscosag@yahoo.com


Ing. Jorge Cosco Grimaney jcoscog@yahoo.es

Introducción
Las coniferas como el pino, (Picea abies (L) Karst) ha sido extendidamente estudiado desde
varios puntos de vista a fin de trazar una posible relación entre la calidad del ecosistema y
las propiedades específicas de estos árboles. La presencia de un gran número de otros
compuestos ha sido reportado in la literatura, pero su identificación con las condiciones
cromatográficas comunes representan un problema difícil a causa de la falta de
disponibilidad de estándares. El fin de este estudio es simplificar la composición
metanolica del extracto a través de una adecuada pre-separación cromatográfica. Han sido
estudiados 2 métodos con potencial para separar extractos a fracciones conteniendo
componentes de distinto tipo químico. Primero, cromatografía de ion exclusión, el cual
podría separar compuestos ionizados de neutrales. Segundo, cromatografía de interacciones
hidrofilicas que parece lograr un tipo de separación selectiva.
La parte experimental evaluara las cromatografías de exclusión e interacciones hidrofilicas
como potencial herramientas de pre-separación para el análisis de compuestos fenolicos.

Parte experimental

Separación basada en el principio de Ion Exclusión

El comportamiento de retención de ácidos fenolicos y compuestos neutrales fue estudiado en una


columna de fase reversa C-18, 7um, 150 x 3.2 mm con fases móviles consistentes de metanol: soluciones de
dodecilsulfato de sodio a diferentes concentraciones 0.01, 0.1, 5, 10, 20 y 30 mmol.L-1 in la relación 80:20.
Separación basada en el principio de interacciones hidrofilicas
El comportamiento de retención de ácidos fenolicos, fenoles, glicerol, etilenglicol y alcohol bencilico
y otros compuestos con grupos OH, fue estudiado en una columna de fase normal silica, 5um, 150 x 3.2mm
con fases móviles: 100%, 98%, 95%, 80% y 50% acetonitrilo acuoso.
Resultados y discusión de resultados

Evaluación de Cromatografía de Ion Exclusión

El mecanismo de ion exclusión fue aplicado para fraccionar ácidos fenolicos y compuestos neutrales
como p-hydroxyacetofenona y catechina. La figura A muestra la dependencia del tiempo de retención de
compuestos fenolicos seleccionados en las varias concentraciones de dodecilsulfato de sodio en el
componente acuoso de la fase mobil. Como es observado los ácidos son excluidos de los poros de la fase
estacionaria reversa solo cuando bajas concentraciones de dodecilsulfato de sodio están presentes in la fase
mobil metanol: agua 80:20. El volumen de retención de los ácidos fenolicos fue mas bajo que el volumen
muerto de la columna mientras que los compuestos neutrales fueron eluídos igual que el volumen muerto o
fueron retenidos en la columna de forma usual.

Fig. A
Retención de compuestos fenolicos bajos condiciones de ion exclusión.

3.5
A

3.0

2.5 C
c
D
2.0

1.5
0 1 2 3 4 5 6
1 1
-
c(SDS) , mmol L 2 2

p-hydroxyacetofenona (A), floroglucinol (B), catechina (C), acido p-hydroxybenzoico (D), acido p-cinámico
(E), acido vainillico (F), acido p-cumárico (G), acido protocatechuico (H), acido benzoico (I), acido ferulico
(J), acido m-cumárico (K). Columna 150 x 3.2 mm, fase reversa C18, 7 µm, fase mobil methanol-agua SDS, c
(SDS) = 0.1 a 30 mmol L-1, flujo 0.3 mL min-1 SDS = Dodecilsulfato de sodio
Este sistema fue aplicado a un extracto 80% metanolico de los árboles. El análisis
cromatográfico confirmó la presencia de acido p-hydroxybenzoico y acido vainillico y
también catechina y p-HAF. Experimentos adicionales son necesarios para optimizar la
recolección de las fracciones.

Evaluación de Cromatografía con interacciones hydrofilicas

La cromatografía de interacciones hydrofilicas en una columna de silica puede


separar ácidos fenolicos de compuestos sin grupos carboxilo cuando acetonitrilo es usado
como fase mobil (Tabla A). Para aplicar el método de pre-separación, la muestra debe ser
extraída con acetonitrilo (o solvente con propiedades similares) o transferir a este solvente
por evaporación del solvente original y reconstitución del residuo con acetonitrilo. Fue
probado que los ácidos fenolicos (protocatechuico, p-hydroxybenzoico, vanillico, p-
cumarico, ferulico) y catechina muestran buenas recuperaciones sobre 92% por
evaporación del solvente metanolico usando rotavapor hasta sequedad a 40°C.
Table A

Retención de compuestos fenolicos y alcoholes bajo condiciones de interacciones


hydrofilicas.
Compuestos Tiempo de retencióna, min
Acetonitrilo – Agua
50:50 80:20 95:5 98:2 100:0
Acido p-Hydroxybenzoico 1.27 1.58 2.81 8.59 >15
Acido p-Cumarico 1.22 1.53 3.01 9.57 >15
Acido p-Ferulico - - - 10.88 -
Acido Vainillico - - - 12.52 -
Acido Benzoic - - 8.4 9.94 >15
Quercetina >15 - >15 - >15
Rutina >15 - >15 - >15
Catechina 1.82 1.92 2.09 - >15
p-Hydroxyacetofenona 1.83 1.89 2.04 2.10 2.30
Fenol 1.88 - 1.98 - 2.05
Floroglucinol 1.86 - 2.05 - 2.23
Pirocatechol 2.03 - 2.17 - 2.35
Resorcinol 1.86 - 1.99 - 2.11
Hydroquinona 1.96 - 2.02 - 2.17
Glicerol 1.98 - - - -
Etilen glicol 1.94 - 3.66 - 7.58
Alcohol Benzilico 1.93 - 2.00 - 2.33
a
Columna fase normal Silica, 7 µm, 150 x 3.2 mm, fase mobil acetonitrilo-agua, 0.4 mL
min-1
Este método de pre-separación fue verificado en una mezcla modelo de acido ferulico (40µ
m) y acido protocatechuico (40µm) usando una microcolumna (extracción en fase sólida)
conteniendo 300 mg de silica. Después del cargado de la muestra en la microcolumna, esta
fue lavada con 10 mL del mismo solvente y los ácidos fueron recuperados con 2 – 10 mL
de la mezcla acetonitrilo:agua (80:20). El procedimiento aplicado a los extractos mostró
resultados similares a los obtenidos en la tabla A.
El protocolo propuesto es contenido en la tabla B.

Tabla B
Condiciones propuestas para el fraccionamiento de muestras disueltas en acetonitrilo
Extracción en fase sólida basada en el principio de interacciones hydrofilicas
Sorbente Silica
Acetonitrilo o solvente de similar polaridad (Después
Aplicación de la muestra de ser usado otro sorbente, la columna debe ser secada
haciendo pasar nitrógeno a través de la misma)
Lavado, remoción de
Acetonitrilo
impurezas
Elución Acetonitrilo:Agua (80:20)

Este método es sensible a la presencia de agua, la retención de los ácidos rápidamente


decrece con el incremento del contenido del agua.