Anda di halaman 1dari 12

Berbagai metode imunoserologi telah dikembangkan, sehingga antibodi yang telah diketahui

identitasnya dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen.


Beberapa metode imunoserologi yang sering digunakan adalah :
1. Reaksi presipitasi
Reaksi yang dilakukan untuk mengetahui kadar antibodi dalam serum. Presipitasi terjadi karena
reaksi antara antigen yang larut dengan antibodi. Membentuk komplek berupa anyaman.
2. Reaksi aglutinasi
Berbeda dengan reaksi presipitasi, reaksi aglutinasi ini dilakukan untuk antigen yang tidak larut,
berbentuk partikel atau antigen yang larut tapi terikat dengan partikel atau sel. Antigen tersebut
bereaksi dengan antibodi membentuk suatu agregat yang dpat dilihat yang disebut aglutinasi.
3. Reaksi netralisasi
Reaksi antara antigen dan antibodi untuk mencegah adanya efek yang berbahaya antara lain
adanya eksotoksin bakteri atau virus. Senyawa yang dapat menetralkan toksin disebut dengan
antitoksin, merupakan antibodi spesifik yang diproduksi oleh sel hospes.
Reaksi antara antitoksin yang dapat menetralkan toksin bakteri disebut dengan reaksi netralisasi.
4. Reaksi fiksasi komplemen
Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat
dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.
5. Reaksi imunofluoresensi
Teknik ini merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga
menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet. Uji ini
merupakan cara yang cepat, sensitif dan sangat spesifik.
6. Radioimmuno assay (RIA)
Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur konsentrasi antigen maupun
antibodi yang berkadar rendah, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan
tubuh secara dini.
Terdapat dua cara untuk melakukan pemeriksaan dengan teknik RIA ini, pertama dengan
penentuan berdasarkan reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase radio immuno assay)
dan yang kedua adalah berdasarkan reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase radio immuno
assay).
7. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
ELISA merupakan teknik yang paling luas digunakan dari kelompok enzyme immunoassay
(EIA). Terdapat dua cara ELISA yaitu yang ecara langsung mendeteksi antigen dan secara tidak
langsung untuk mendeteksi antibodi.
Teknik ELISA cukup sederhana sehingga interpretasi terhadap hasil pemeriksaan sangat jelas
baik untuk menentukan hasil positif maupun negatif.
.

Diagnosis Penyakit
2.1
Diagnosis
Penyakit
Infeksi
dengan
Uji
Serologi
2.1.1
Uji
Aglutinasi
Uji aglutinasi merupakan salah satu uji serologi yang digunakan untuk mendiagnosa suatu
penyakit. Uji aglutinasi ini dapat dilakukan dengan menambahkan antibodi yang homolog pada
antigen yang dapat berupa sel ataupun partikel lateks yang telah diserapi antigen yang dapat
larut. Penambahan antibodi pada pertikel lateks ini dapat menyebabkan terjadinya proses
aglutinasi atau penggumpalan, sehingga menyebabkan terbentuknya agregat sel-sel yang kasat
mata. Proses penggumpalan ini disebabkan karena antibodi berlaku sebagai jembatan untuk
membentuk jaringan kisi-kisi antibodi dan antigen partikulat sehingga membentuk gumpalan.
Uji aglutinasi ini tidak hanya dapat digunakan untuk diagnosis penyakit menular tertentu
yang reaksi aglutinasi antigen-antigennya yang telah diketahui oleh serum penderita, tetapi
juga dapat digunakan untuk mengetahui mikroorganisme atau bakteri yang belum diketahui. Hal
ini dapat diketahui karena kemampuan spesifik serum yang telah diketahui untuk
menggumpalkan suspensi sel-sel yang yang belum diketahui tersebut, sehingga mikroorganisme
atau
bakteri
yang
belum
diketahui
tersebut
dapat
diidentifikasi.
Uji aglutinasi terhadap bakteri dapat diklakukan dalam tabung-tabung reaksi kecil atau
sebuah kaca objek. Kebanyakan uji bakteri dilakukan dengan pengenceran antiserum secara
serial di dalam tabung yang kedalamnya ditambahkan antigen dalan jumlah yang konstan.
Setelah diinkubasi, pengamatan dapat dilakukan secara visual, kemudian ditentukan titernya.
Titer antiserum adalah suatu nilai nisbi dan berbanding terbalik dengan pengenceran tertinggi
yang memiliki gumpalan sel dan antibodi. Titer yang lebih tinggi menunjukkan adanya
konsentrasi antibodi yang lebih tinggi pula. Beberapa contoh uji aglutinasi adalah sebagai
berikut:
*
Uji
Widal
Uji Widal adalah prosedur uji serologi untuk mendeteksi bakteri Salmonella enterica yang
mengakibatkan penyakit Thipoid. Uji ini akan memperlihatkan reaksi antibodi Salmonella
terhadap antigen O-somatik dan H-flagellar di dalam darah. Prinsip pemeriksaan adalah reaksi
aglutinasi yang terjadi bila serum penderita dicampur dengan suspense antigen Salmonella
typhosa. Pemeriksaan yang positif ialah bila terjadi reaksi aglutinasi antara antigen dan antibodi
(agglutinin). Antigen yang digunakan pada tes widal ini berasal dari suspense salmonella yang
sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan mengencerkan serum, maka kadar
anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi
menunjukkan
titer
antibodi
dalam
serum.
*
Uji
Weil-Felix
Uji Weil-Felix merupakan uji yang dilakukan terhadap infeksi oleh riketsia. Uji ini
melibatkan antigen heterofil, beberapa riketsia memiliki antiten yang sama seperti yang terdapat
pada galur-galur Proteus spp. Artinya serum dari pasien yang menderita infeksi oleh riketsia
akan mengaglutinasikan suspensi bakteri Proteus spp.Reaksi Weil-Felix ini bersifat diferensial,
atau diagnostik terhadap penyakit-penyakit tertentu yang disebabkan oleh riketsia karena
terjadinya
aglutinasi
galur-galur
ini
secara
selektif.
Uji Aglutinasi biasanya digunakan dalam penentuan golongan darah ABO dan penentuan tipe
Rh.
*
Penggolongan
Darah
ABO
Pada proses transfusi darah, pertimbangan utama ditunjukkan pada interaksi antara antibodi

resipien dan sel-sel donor. Transfusi yang inkompatibel (tidak serasi) akan mengakibatkan
terjadinya penggumpalan serta lisis sel yang ditransfusikan oleh isoantibodi dan komplemen
serum si donor. Hal ini dapat menyebabkan terganggunya fungsi ginjal pada donor.

Orang-orang dengan golongan darah O, yang memiliki agulitinin anti-A dan anti-B dalam
serum darahnya disebut sebagai donor universal, sedangkan golongan darah AB yang memiliki
aglutinogen
A
dan
B
disebut
sebagai
resipien
universal.
*

Penentuan
tipe
darah
Rh
Pada sistem Rh tidak dijumpai isoantibodi alamiah terhadap antigen Rh. Namun demikian,
seseorang dengan Rh negatif yang menerima sel-sel darah dengan Rh positif akan memberikan
respon dengan cara mensintesis antibodi terhadap faktor Rh. Untuk melakukan uji Rh dapat
dilakukan
dengan
menambahkan
antigen
D
pada
darah.
Penyakit yang dapat ditimbulkan apabila perkawinan terjadi antara rherus yang berbeda
adalah eritroblastosis fetalis bada bayi mereka. Hal ini dapat terjadi bila ayah rhesus positif
sedangkan ibunya rhesus negatif, rhesus positif lebih dominan terhadap rhesus negatif. . Anak
dari pasangan beda rhesus punya kemungkinan 50-100% berrhesus positif. Kemungkinan
berrhesus negatif hanya 0-50%. Artinya rhesus si anak lebih mungkin berbeda dengan si ibu.
Perbedaan rhesus antara calon bayi dengan ibu akan menimbulkan masalah. Melalui plasenta,
rhesus darah janin akan masuk ke peredaran darah si ibu. Selanjutnya ini akan menyebabkan
tubuh si ibu memproduksi antirhesus. Melalui plasenta juga, antirhesus ini akan melakukan
serangan balik ke dalam peredaran darah si calon bayi. Sel-sel darah merah si calon bayi akan
dihancurkan.Pada kehamilan pertama, antirhesus mungkin hanya akan menyebabkan si bayi lahir
kuning (karena proses pemecahan sel darah merah menghasilkan bilirubin yang menyebabkan
warna kuning pada kulit). Tapi pada kehamilan kedua, problemnya bisa menjadi fatal jika anak
kedua juga memiliki rhesus positif. Saat itu, kadar antirhesus ibu sedemikian tinggi, sehingga
daya rusaknya terhadap sel darah merah bayi juga hebat. Ini bisa menyebabkan janin mengalami
keguguran.
2.1.2
Uji
presipitin
Pada uji presipitin terjadi reaksi antara satu antigen yang dapat larut dengan antibodi
homolognya. Reaksi ini berlangsung dengan poembentukan presipitat (enndapan) kasat mata
pada batas permukaan reaktan-reaktan bersangkutan. Reaksi semacam itub biasanya dilakukan
dengan menggunakan antibodi (antiserum) dengan jumlah konstan dan antigenj dengan berbagai
pengenceran. Dengan mengingat bahwa konsentrasi antibodi itu konstan, maka dapat kita lihat
bahwa hanya terbentuk sejumlah kecil presipitat bila antibodinya berlebihan. Dengan
ditambahnya konsentrasi antigen, maka jumlah presipitat meningkat dan mencapai maksimum
bila perbandingan antara antigen dan antibodinya optimum. Sesudah zone ini, dengan
bertambahnya konsentrasi antigen, maka jumlah presipitat menurun lagi. Jadi ada tiga zone
reaksi antigen-antibodi pada uji presipitin : zone kelebihan antibodi, zone setara, dan zone
kelebihan
antigen.
Pada zone kelebihan antibodi, semua antigen telah bereaksi dengan antibodi dan telah
diendapkan (tidak ada antigen bebas di dalam supernatan). Sebaliknya di dalam zone kelebihan
antigen, semua antibodi telah bereaksi dengan antigen (tidak ada antibodi di dalam supernatan),

tetapi kompleks yang terbentuk tetap dapat larut karena banyaknya kelebihan antigen mengikat
antibodi menjadi kompleks yang berukuran kecil yang tidak terikat saling membentuk agregat
besar yang kasat mata.di dalam zone setara terjadi presipitasi antigendan antibodi secara
maksimum (tidak terdapat antigen bebas maupun antibodi bebas di dalam supernatan) karena
keduanya terdapat dalam proporsi optimum sehingga dapat membentuk kisi-kisi antigen dan
antibodi yang menjadi kasat mata dan tidak dapat larut. Karena alasan ini, maka uji presipitin
akan paling bermanfaat bila memungkinkan reaktan berdifusi sampai konsentrasi optimumnya
tercapai.
A.
Uji
Cincin
Uji cincin adalah uji presipitin yang paling sederhana. Kedalam sebuah tabung bermulut kecil
diletakkan larutan antigen diatas larutan serum yang mengandung antibodi. Kedua larutan
tersebut akan berdifusi sampai keduanya mencapai konsentrasi optimum untuk terjadinya
presipitasi, pada titik tersebut muncullah suatu zona rapat atau cincin endapan diantara kedua
larutan
tersebut.
B.
Metode
Difusi
Agar
Ketepatan yang lebih tinggi dan pemisahan komponen di dalam campuran antigen dan antibodi
dapat diperoleh dengan cara membiarkan reaktan-reaktan tersebut berdifusi bersama-sama dalam
di
dalam
suatu
gel
agar.
*
Metode
difusi
tunggal.
Dalam metode difusi tunggal yang dirancang Oudin, antigen ditaruh diatas gel agar yang
mengandung antiserum di dalam suatu tabung reaksi bermulut sempit. Setelah dibiarkan selama
beberapa jam atau beberapa hari, antigen itu merembes ke dalam gel membentuk pita-pita
endapan pada berbagai taraf, bergantung kepada jumlah dan macam antigen-antibodi yang ada.
Karena presipitasi terjadi ketika antigen menembus gel, maka cincin endapan mula-mula muncul
di dekat puncak gel dan nampaknya bergerak perlahan ke arah bawah. Efek semacam ini
mungkin sesungguhnya disebabkan karena adanya peningkatan jumlah antigen yang
menyebabkan endapan itu melarut (karena reaksi antigen-antibodi itu dapat balik). Presipitasi
terbentuk kembali pada posisi yang lebih kebawah dalam tabung tersebut, yaitu pada tempat
konsentrasi antigen yang optimum. Faktor-faktor yang menentukan taraf untuk terjadinya reaksi
ialah
ukuran
molekul
dan
konsentrasi
nisbi
reaktan.
*
Metode
difusi
ganda.
Oakley dan Fulthorpe memodifikasi teknik Oudin dalam metode difusi tunggal dengan cara
menaruh antiserum di dalam agar di dasar tabung reaksi dan melapisinya dengan gel agar lalu
diatasnya ditaruh larutan antigen. Kedua reaktan itu berdifusi kearah masing-masing di dalam
agar dan presipitasi terjadi pada titik terdapatnya konsentrasi optimum. Ini adalah difusi ganda
satu
dimensi.
Metode difusi ganda dua dimensi yang dirancang oleh Ouchterlony mempunyai keuntungan
dibandingkan dengan metode sebelumnya, bahwa berbagai antigen dan antiserum dapat
dibandingkan secara langsung. Dalam uji ini, reaktan merembes dari sumur-sumur yang berisi
antiserum dan antigen homolog dalam konsentrasi optimum. Bila pita endapan yang dibentuk
kedua antigen dan antibodi itu melebur pada titik pertemuannya, maka berarti kedua antigen itu
sama.
Bila
bersilangan,
artinya
kedua
antigen
itu
berbeda.
C.
Radioimunoasai
Radioimunoasai ialah suatu teknik mikro dengan kepekaan tinggi untuk meentukan jumlah
antigen yang amat sedikit. Teknik ini pada hakikatnya merupakan proses dua langkah. Langkah
yang pertama menyangkut kompetensi antara antigen uji (tidak berlabel atau tidak radio aktif)

dengan konsentrasi yang tidak diketahui (beragam) dan suatu antigen indikator yang dikenal
(berlabel atau radioaktif) dengan konsentrasi yang sudah diketahui (daoat dihitung). Mereka
berkompetensi untuk bereaksi dengan antibodi yang dikenal dan jumlahnya terbatas, yang
spesifik bagi antigen yang diberi label radioisotop. Ketiga reaktan ini diinkubasikan selama
beberapa
jam
sehingga
dapat
terjadi
reaksi
pengikatan
antigen-antibodi.
Langkah kedua menyangkut ditambahkannya kedalam sistem itu antiserum (anti-antibodi)
yang spesisifik dan erhadapnya mampu mengikat komponen antibodi dari kompleks kekebalan
yang tebentuk selama inkubasi pada langkah yang pertama. Ini mengakibakan terjadinya
presipitasi kompleks antigen-antibodi.Radioaktivitas endapan tersebut ditetapkan di dalam
detektor
dan
penghitung
radioisotop.
Bila antigen uji pada langkah pertama telah bereaksi dengan antibodi, maka antigen indikator
radioaktif tidak dapat bereaksi dengan antibodi itu. Hitungan radioaktifnya akan redah karena
antigen indikator tidak terdapat dalam endapan. Namun demikian, bila antigen uji itu tidak
bereaksi dengan antibodi, maka antibodi itu tentunya bebas untuk mengikat antigen indikator
radioaktif. Maka hitungan radioaktifnya akan tinggi karena antigen indikator terikat dalam
endapan. Jadi identitas dan konsentrasi antigen uji dapat ditentukan oleh radioaktivitas endapan.
Teknik radioimunoasai ini penting untuk menentukan adanya antigen hepatitis B, yang
mungkin ada di dalam serum donor darah yang tidak memperlihatkan gejala (donor yang
membawa virus (antigen) tanpa memperlihatkan gejala). Substansi-substansi lain yang dapat
diukur dengan radioimunoasai meliputi insulin, testosteron, estradiol, igE manusia, serta bahanbahan lain yang biasanya ada dalam jumlah amat kecil di dalam darah atau air seni.
2.1.3
Uji
Fiksasi
Komplemen
Uji fiksasi (penambatan) komplemen didasarkan pada adanya antibodi penambatan
komplemen di dalam serum. Adanya komplemen menyebabkan antibodi ini melisis sel-sel.
Tujuan uji fiksasi komplemen adalah untuk menentukan ada atau tidaknya antibodi spesifik di
dalam
serum.
Uji
ini
terdiri
dari
dua
sistemyaitu
sebagai
berikut.
1.
Sistem
penambatan
komplemen
Dalam sistem ini serum, suspense bakteri (antigen lain), dan komplemen dicampurkan. Bila
antigen dan antibodi dari dalam serum itu bergabung, maka komplemen itu dinyatakan tertambat.
Karakteristika
Sistem
Komplemen
adalah
sebagai
berikut.
* Komplemen adalah nama yang diberikan terhadap suatu seri protein(plasma) yang terdiri dari
21
protein
* Mekanisme kerja sistem ini seperti proses pembekuan darah yang membentuk suatu sistem
enzim yang terstimulasi dalam plasma yang kebanyakan adalah proteinase-proteinase.
* Ciri spesifik sistem ini : menghasilkan suatu respon yang cepat dan bertingkat terhadap suatu
stimulus
yang
dapat
berupa
kompleks
imun.
* Protein plasma yang diberi simbol C diikuti dengan angka, menunjukkan nomor penemuan
komplemen
tersebut,
bukan
suatu
nomor
urutan
reaksi.
* Protein komplemen utama yaitu : C1 (q,r,s), C2, C3, C4 ,dst hingga C9, faktor B, faktor D,
faktor
H,
properdin,dll.
* Pada setiap tahap aktivasi selalu dihasilkan suatu aktivitas enzim baru yang juga komponen
komplemen.
* Produk reaksi pertama berlaku sebagai katalis enzimatik yang mengaktifkan komponenkomponen selanjutnya, demikian seterusnya hingga dihasilkan suatu respon bertingkat yang
menyerupai cascade. Kerja ini menyerupai air terjun yang terus berlangsung tanpa bisa

dihentikan di tengah-tengah reaksi. Fragmen enzim diberi nama a dan b misalnya C2a dan C2b.
*
Pusat
katalitik
sistem
ini
berada
pada
C3.
* Akhir dari aktivitas komplemen adalah : terbentuknya suatu pori fungsional pada membran sel
di mana komplemen tersebut melekat, kemudian terjadi perubahan konformasi fosfolipid sel
yang menyebabkan lisis dan berakhir dengan kematian sel. Hal ini disebut MAC (membrane
attack
complex).
Sistem
Komplemen
terdiri
dari
tiga
jalur
yaitu
sebagai
berikut.
* Jalur Klasik. Jalur ini diawali dengan stimulasi dari kompleks antigen-antibodi yang kemudian
mengaktivasi C1q, C1r, C1s, ketiga komponen ini menghasilkan komponen enzimatik yang
menstimulasi C4, C4 menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasiC2, komponen C2
ini kemudian menghasilkan komponen enzimatik dan menstimulasi C3 Convertase (pusat
katalitik
sistem
komplemen).
* Jalur MB-Lecitin. Jalur ini diawali oleh stimulasi dari kompleks manosa binding protein pada
permukaan patogen yang kemudian menstimulasi MBL, MASP-1, MASP-2. Ketiga komponen
ini kemudian mnghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasi C4, (seperti halnya pada
jalur klasik) C4, C4 menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasiC2, komponen C2 ini
kemudian menghasilkan komponen enzimatik dan menstimulasi C3 convertase (pusat katalitik
sistem
komplemen).
* Jalur Alternatif. Jalur ini diawali oleh stimulasi dari permukaan patogen yang mengandung
LPS (Lipopolisakarida) yang kemudian langsung menstimulasi C3, C3 menghasilkan komponen
enzimatik yang menstimulasi faktor B, faktor B menghasilkan komponen enzimatik yang
menstimulasi fakator D, faktor D kemudian menghasilkan komponen enzimatik yang akhirnya
mensimulasi
C3
convertase.
Setelah Ketiga jalur tersebut mengaktivasi C3 Convertase, C3 convertase ini kemudian
menghasilkan C3a, C5a dan C3b. C3a, C5a kemudian menstimulasi peptida mediator untuk
inflamasi dan menstimulasi rekrutmen sel fagositik. C3b kemudian berikatan dengan reseptor
komplemen pada sel fagositik dan kemudian menstimulasi opsonisasi dan penghilangan
kompleks imun. Selain itu, C3b juga menstimulasi komponen terminal komplemen yang
kemudian terjadi reaksi cascade : menstimulasi C5b, C6,C7,C8,C9 dan akhirnya membentuk
Membran
attack
complex
dan
menyebabkan
lisis
pada
patogen.
Persamaan
atara
ketiga
jalur
tersebut
adalah
sebagai
berikut.
o Ketiganya sama-sama akan mengaktivasi pusat katalitik sistem komplemen yaitu C3;
Ketiganya pada akhirnya akan menginduksi C9; dan ketiganya sama-sama membentuk membran
attack
complex.
Perbedaan
atara
ketiga
jalur
tersebut
adalah
sebagai
berikut.
o Stimulus yang menginduksi masing-masing jalur berbeda-beda. Jalur Lecitin distimulasi oleh
kompleks antigen antibodi, Jalur MB-Lecitin distimulasi oleh kompleks manosa-binding Lecitin,
dan Jalur Alternatif distimulasi LPS (lipopolisakarida) dari permukaan patogen.
o Komponen yang distimulasi oleh stimulus masing-masing jalur berbeda. Jalur Lecitin
selanjutnya mengaktivasi C1q,C1r,C1s, C4 dan C2, jalur MB Lecitin selanjutnya mengaktivasi
MBL, MASP-1, MASP-2, C4 dan C2, dan jalur alternatif mengaktivasi C3, B,dan D.
2.

Sistem
indikator
hemolitik
Antibody hemolitik (hemolisin)dibuat dengan cara mengimunisasi kelinci dengan sel-sel
darah merah biri-biri. Serum dari kelinci yang sudah diimunisasi dengan sel biri-biri ini
dicampur dengan sel-sel darah merah biri-biri. Bila komplemen tertambat digunakan di dalam

reaksi antibodi uji dan atigen maka tidak akan terjadi hemolisis. Oleh sebab itu, reaksi hemolitik
meninjukan uji negatif. Ini menunjukan bahwa semua reaktan didalam uji fiksasi komplemen
harus
disesuaikan
dengan
tepat.
Uji fiksasi komplemen terutama bermanfaat bila kombinasi antara antigen uji dan antibodi
tidak menimbulkan reaksi kasat mata seperti yang terjadi pada aglutinasi dan presipitasi. Uji
fiksasi komplemen ini banyak digunakan secara luas di dalam diagnosis laboratories penyakit
menular, termasuk penyakit yang disebutkan oleh bakteri, virus, protozoa, dan cendawan. Salah
satu penerapan yang diketahui paling baik dari uji ini adalah uji Wasserman untuk sifilis,
meskipun
uji
ini
telah
diganti
oleh
uji-uji
lain.
2.2
Diagnosis
Penyakit
Infeksi
dengan
Uji
Serologi
Khusus
2.2.1
Pengertian
Elisa
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam
suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi
tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen
yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan
pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat
dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh
enzim
menjadi
sinyal
yang
dapat
dideteksi.
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya
merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam
serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga
bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan
seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang
toksikologi
untuk
uji
pendugaan
cepat
pada
berbagai
kelas
obat.
2.2.2
a.

Macam

Macam

Teknik

Elisa

Indirect
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi
antibodi
dalam
serum
adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva
standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan
diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking,
karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk
antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik,
maka
konsentrasi
protein
total
harus
sama
dengan
antigen
standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan
dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,

bukan
pada
protein
serum
yang
lain
atau
protein
yang
terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap
ini
bisa
dilewati
jika
antibodi
pendeteksi
berkonjugasi
dengan
enzim.\
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/
elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia
lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang
tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari
metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap
protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit
yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada
permukaan
lubang.
b.

Direct
Prinsip elisa langsung tidak ajuh berbeda dengan elisa tidak langsung. Pada elisa langsung,
antigen secara langsung diadsorpsikan ke substrat padat. Permukaan substrat dicuci dan antibodi
akan ditempeli enzim yang digunakan untuk menunjukkan adanya antigen. Hasilnya akan terlihat
jika ditambahkan subtrat. Pada konfigurasi ini diperlukan antiserum yang spesifik untuk antigen
tersebut.
Antiserum
ini
harus
dikonjugasikan
dengan
enzim.
Perbandingan elisa langsung dan tidak langsung dapat dilihat pada gambar berikut.
c.

ELISA
Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang
diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen
yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct,
hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer
spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini
cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan
antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA
sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi
sekunder
seringkali
disebut
sebagai
antibodi
deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi
keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat
kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi
terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi
dengan
kedua
antibodi.
Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi
penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang
microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak
menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara

antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas
untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap. Lalu, kedalam
lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada lubang
microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor.
Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi
dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang
dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telah
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal
yang
dapat
dideteksi.
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas
dari
hasil
pengujian,
antara
lain:
* Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter
* Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen
Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada
tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun
demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat
diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis
antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya
harus
berbeda).

d.

ELISA
Avidin-Biotin
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai
teknik ELISA penangkap antibodi, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich,
hanya saja yang digunakan pada teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor
(antigen bertaut enzim signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut
dengan
enzim
signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang
tertaut dengan suatu antibodi avidin dengan mengubah antibodi avidin menjadi antibodi
streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin
(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat
akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

e.

ELISPOT
ELISPOT adalah metode umum untuk memantau respon imun pada manusia maupun hewan.
Metode ini dikembangkan oleh Cecil Czerkinsky pada tahun 1983. Uji ELISPOT merupakan
versi modifikasi yang dikembangkan dari ELISA sebelumnya. Tes ELISPOT pada awalnya
dikembangkan untuk menghitung sel B yang mensekresi antigen-antibodi spesifik, dan kemudian
telah diadaptasi untuk berbagai tugas, khususnya identifikasi dan penghitungan sitokin sel yang
memproduksi pada tingkat sel tunggal. Secara sederhana, pada kondisi yang sesuai uji ELISPOT
memungkinkan visualisasi dari produk yang keluar dari sel diaktifkan atau menanggapi individu.
Setiap tempat yang berkembang di uji mewakili sebuah sel reaktif tunggal. Dengan demikian, uji

ELISPOT menyediakan baik informasi (jumlah menanggapi sel) kualitatif (jenis protein
kekebalan
tubuh)
dan
kuantitatif.
Berdasarkan sensitivitas dari tes ELISPOT, analisis frekuensi populasi sel langka (misalnya,
antigen-spesifik tanggapan) yang tidak mungkin sebelumnya, sekarang relatif mudah.
Sensitivitas yang luar biasa ini sebagian karena produk dapat dengan cepat ditangkap sekitar sel
mensekresi. Baik sebelum diencerkan dalam supernatan, ditangkap oleh reseptor sel yang
berdekatan, atau terdegradasi. Hal ini membuat tes ELISPOT jauh lebih sensitif dibandingkan
pengukuran ELISA konvensional. Batas deteksi adalah di bawah 1/100, 000 render dalam
menghitung sel aktif yang memproduksi. Hal ini memungkinkan banyak proses analisis yang
otomatis, dan memungkinkan tingkat akurasi yang lebih besar daripada apa yang dapat dicapai
dengan
menggunakan
pemeriksaan
manual.
Alat tes ELISPOT menggunakan teknik yang sangat mirip dengan sandwich ELISA. Adapun
teknik
penggunaan
ELISPOT
adalah
sebagai
berikut.
1. Antibodi monoklonal (lebih disukai untuk spesifisitas yang lebih besar) atau antibodi
poliklonal penangkapan yang dilapisi secara aseptik ke lempeng (fluoride polyvinylidene)didukung PVDF. Antibodi ini dipilih untuk kekhususan mereka untuk analit yang bersangkutan.
2. Sel dirangsang dengan tepat yang dipipet ke dalam plate dan lempeng ditempatkan menjadi 37

C
dilembabkan
CO2
inkubator
untuk
jangka
waktu
tertentu.
3. Selama periode inkubasi, antibodi bergerak langsung di sekitar dari sel-sel mensekresi,
mengikat analit yang dilepaskan. Misalnya yang dieksresikan adalah sitonin.
4. Kemudian mencuci sel-sel dan zat terikat, sebuah antibodi spesifik terbiotinilasi poliklonal
(alkaline phospathase conjugated streptavidin) untuk analit dipilih akan ditambahkan ke plate.
Antibodi ini adalah reaktif dengan epitop yang berbeda dari sitokin target dan dengan demikian
digunakan
untuk
mendeteksi
sitokin
ditangkap.
5. Selanjutnya setelah mencuci untuk menghilangkan antibodi terikat terbiotinilasi, sitokin
terdeteksi kemudian divisualisasikan menggunakan avidin-HRP dan substrat pencetus (misalnya,
AEC,
BCIP
/
NBT).
6. Sebuah endapan berwarna biru-hitam terbentuk dan muncul sebagai bintik-bintik di lokasi
lokalisasi sitokin, dengan setiap titik individu yang mewakili sebuah sel yang mensekresi analit
individu. Bintik-bintik dapat dihitung dengan sistem otomatis pembaca ELISPOT atau manual,
menggunakan
sebuah
mikroskop
stereo.

f.

Elisa
Kompetitif
(Elisa
Pemblok)
Teknik ELISA kompetitif merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu. Prinsip
dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang microtiter.
Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun
antibodi.
*
Pada
pendekteksian
antigen
1. Microtiter diisi antibodi spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
maupun antigen spesifik tertaut enzim signal, sehingga antibodi spesifik tersebut dapat
menempel
pada
bagian
dinding-dinding
lubang
microtiter.
2. Microtiter dibilas untuk membuang antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding
lubang
microtiter.
3. Kemudian larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim
signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam

lubang-lubang microtiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik tertaut enzim signal
dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibodi spesifik.
4. Dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim
signal
atau
antigen
yang
tidak
berinteraksi
dengan
antibodi
spesifik.
5. Lalu, kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibodi spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan
signal
yang
dapat
dideteksi.
6. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibodi spesifik.
*
Pada
pendeteksian
antibody
1. Microtiter diisi antigen spesifik yang dapat berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan
maupun antibodi spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat
menempel
pada
bagian
dinding-dinding
lubang
microtiter.
2. Microtiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dindinglubang
microtiter.
3. Lalu larutan yang mengandung antibodi spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan
larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang
microtiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibodi spesifik tertaut enzim signal dengan
antibodi yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen spesifik.
4. Dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim
signal
atau
antibodi
yang
tidak
berinteraksi
dengan
antigen
spesifik.
5. Lalu kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antibodi spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan
antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan
signal
yang
dapat
dideteksi.
6. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti bahwa antibodi yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibodi spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal
yang dihasilkan. Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak
diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang
diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat
spesifisitas
dari
antibodi
dan
antigen.
2.2.3
Kelebihan
dan
Kekurangan
Teknik
ELISA
*
Kelebihan
1.
Teknik
pengerjaan
relatif
sederhana.
2. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja,sehingga menghemat
biaya
untuk
membeli
banyak
jenis
antibodi)
3.
Hasil
memiliki
tingkat
sensitivitas
yang
cukup
tinggi.
4. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut
sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antaraantibodi dan antigen yang bersifat sangat
spesifik)
5. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

*
Kekurangan
1. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA lebih banyak jenis
antibodi
monoklonal
(antibodi
yang
hanya
mengenali
satu
antigen
2. Harga antibody monoclonal relative lebih mahal daripada antibody poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relative cukup mahal.
3. Pada beberapa teknik ELISA dapat terjadi kesalahan pengujian akibat control negatif yang
menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking, sehingga
antibody sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibody bertaut enzim signal
dan
menimbulkan
signal.
4. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relative cepat sehingga pembacaan harus
dilakukan dengan cepat. (Pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan
larutan untuk menghentikan reaksi)