Anda di halaman 1dari 18

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung
materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,
mitokondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya
adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi
sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan
tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu
DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas,
yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari
garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari
organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan
DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein
histon.
Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein
dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. isolasi DNA
dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:
preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk
sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada
setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan
hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya
senyawa
polifenol
dan
polisakarida
dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA Pada proses isolasi DNA ini, sel

eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui


cara mekanik dan enzimatis.

1.2 Tujuan
- Mengetahui Definisi Isolasi DNA
- Mengetahui metode dan tahapan dalan isolasi
DNA
- Mengetahui manfaat isolasi DNA
1.3 Manfaat
Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan
proses-proses yang berkaitan langsung untuk
melakukan isolasi DNA.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan
sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya.molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung
dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung
(Mader, 1993).
Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat
dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:
preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk
sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA
dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi
pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan
adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA
(Jamilah, 2005).
DNA isolation is the most important step in
molecular biology analysis. Several DNA isolation
techniques which are developed were expensive.
Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam
analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA
yang telah dikembangkan sangat mahal dan
memerplukan waktu yang lama.
(Listanto,1996)

2.2 Macam-macam Metode Isolasi DNA


1.Teknik Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD)
Teknik
pengujian
polimorfisme
DNA
berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen
DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang
sekuen
nukleotidanya
ditentukan
secara
acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10
basa.PCR dilakukan pada suhu anealing yang
rendah yang memungkinkan primer menempel pada
beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk
primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa
dengan persentase G+C 50-60%
(Istanti,1999)
2. Metode CTAB
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
merupakan metode yang umum digunakan dalam
ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak
mengandung polisakarida dansenyawa polifenol
(Ardiana,2009)
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal
dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida
karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh
fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan
diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh
berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA
tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

3. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi
DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik
phenol.
(Barnum 2005)
4. SaltingOut
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6
M), untuk medenaturisasi protein menggunakan
Proteinase K untuk denaturasi protein.
(Barnum 2005).
5. Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode
sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis
dinding sel , Memerlukan chloroform untuk
denaturasi protein.
(Barnum 2005).
6. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan
perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat,
tetapi recovery DNA kurang
(Barnum 2005).
7. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Merupakan
suatu
teknik
perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida.Primer yang digunakan sebagai
pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA
untai tunggal yang urutannya komplemen dengan
DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan
proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat
semi konservatif
(Giri, 2004)

2.3 Tahapan Isolasi DNA


Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah
terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik
secara fisik kimia atau dengan mempergunakan
enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik
misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu
merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra
tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup
fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang
efektif untuk memecah sek eukaryote.
Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah
dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini
dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya
dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah.
Senyawa lain yang sering digunakan untuk
memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl
Trimetyl Ammonium Bromide).
Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi
dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu
fragmen DNA
tertentu, DNA genom kemudian
dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease
restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong
molekul DNA di bagian tertentu. Hasil potongan
dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujungujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong
oleh enzim.
Selain dengan menggunkan enzin endonuclease
restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong
secara mekanis, misalnya menggunakan alat
sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis
adalah molekul DNA yang ujungnya tidak beraturan.
(Yuwono,2006)

2.4 Manfaat Isolasi DNA


Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan
secara enzimatik melaluiteknik Hibridisasi
Southern
Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan
pustaka genomik.
Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur
rutin peminakan DNA.
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan
(template) dalam prosedur perbanyakan DNA
secara in vitro melalui teknik PCR.
(Arumingtyas, 2012)

BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan Fungsi
3.1.1 Alat yang digunakan :
Mortar
:menghaluskan bahan
Pistil
:alat untuk menghaluskan bahan
Tips
: Ujung dari mikropipet, mendetialkan
pengambilan
dan
pengeluaran
sampel
Gelas ukur : mengukur bahan cairan buffer yang
akan digunakan
Tubes 1,5 ml: wadah/tabung unutk pengamatan
Tissue
: pembersih alat dan pengelap
Gunting
: menggunting bahan (penisah bahan
dari tulang daun)
Spatula
: memindahkan bahan dari mortar
Mikro pipet : untuk mengambil bahan cair
Erlenmeyer : wadah dari bahan cair
Microwave : memanaskan bahan
Mesin PCR : untuk replikasi
Oven
: memanaskan bahan dan
mengeringkannya
Vortex
: untuk menghomogenkan campuran
Timbangan analitik : mengukur berat bahan
Stirrer
: mengaduk bahan dengan cairan
pH meter
: mengukur ph
Mesin elektroforesis : untuk mengelektroforesis
bahan
Centrifuge : untuk menghomogenkan larutan
Autoclafe
: untuk menyeterilkan bahan
Lemari es
: untuk menginkubasi bahan
pengamatan

Pipet

:mengambil bahan cair

3.1.2Bahan yang digunakan


Daun
- Belimbing : Bahan yang diamati
- bayam : Bahan yang diamati
- sawi hijau : Bahan yang diamati
CTAB
: melisis membran sel
HCl
: untuk mencuci DNA
EDTA
: sebagai penyangga
Merkaptho etanol : sebagai penyangga
Nitrogen cair : membantu proses penggerusan
PVP (polivinipirolidone) : memisahkan fase organic
& fenol
CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk
mengurangi kontaminasi protein
Buffer pencuci: untuk mencuci DNA
Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan
kontaminan polisakarida
Ethidium bromide : mengurangi kontaminan RNA
PROMEGA : sebagai penyangga
SRR
: sebagai penyangga
Isopropanol dingin : untuk presipitasi

3.2 Langkah Kerja + dokumentasi

Timbang 0.1 gr sampel daun


Masukan dalam mortar dan tambahkan sedikit
PVPdan tambahkan nitrogen cair.
Gerus cepat sampai halus (jangan sampai mencair).
Campur buffer ekstraksi dengan karbon
(0.5 % w/v) dan mercaptoe ethanol 4 l
(kocok sebelum digunakan)
Masukan 1 ml kedalam tube ukuran
1.5 ml dan tutup kembali tube
Beri label
Tube berisi buffer reaksi
Segera vortex sampai homogen
Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit)
Kaluarkan tube dan dinginkan
Sentrifuge 10000 rpm (10 menit)
Ambil supernatan
Pindahkan ke tube baru
Tambah 500 l CHISAM
Vortex sampai homogeny
Centrifuge 10000 rpm (10 menit)
Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml

Tambah 500 l CHISAM


Centrifuge 10000 rpm (10 menit)
Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml
Tambah 300 l isopropanol dingin secara
perlahan
Bolak-balik tube perlahan
Inkubasi dalam freezer (30 menit)
Keluarkan tube
( biarkan hingga tidak terlalu dingin )

Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit


Buang supernatan dan tambahkan buffer pencuci
500 l pada pellet dalam tube kemudian vortex

Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit)


Buang supernatan
Kering anginkan pellet 20 menit
Tambahkan buffer TE 50-100 l dan larutka pellet
DNA dengan mengetukan tube perlahan
Tambah 1 l RNAse , inkubasi dalam oven (37oC
selama 30 menit)
ISOLAT DNA

Simpan dalam Freezer


Dokumentasikan
analisis
3.3 Analisis Perlakuan
Timbang 0.1 gr sampel daun kamudian daun
dimasukan dalam mortar dan tambahkan sedikit
PVPdan tambahkan nitrogen cair., hati-hati alam
proses pengambilan nitrogen cair. Kkemuudian
setelah nitrogen cair di letakan dalam mortar,
kakukan penggerusan secara cepat sampai halus
(jangan sampai mencair).
Lalu campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5
% w/v) dan mercaptoe ethanol 4 l (kocok sebelum
digunakan). Setelahnya masukan 1 ml kedalam tube
ukuran 1.5 ml dan tutup kembali tube dan jangan
lupa beri laleb pada tiap tube, (Tube berisi buffer
reaksi), pada tube yang telah berisi buffer reaksi,
masukan gerusan bahan daun yang telah halus
dengan menggunakan spatula, masukan secara
perlahan dan usahakan jangan sampai ad abahan
yang jatuh, kemudian setelah bahan masuk dan
bercampur dengan buffer reaksi segera vortex bahan
sampai homogen.
Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit).
Setelah itu keluarkan tube dan dinginkan, lalau
sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit).
Setelah disentrifuge ambil supernatan dari bagian
yang ada pada tube yang telah mengalami beberapa
pemisahan bagian. Lalu pindahkan ke tube baru

dengan ukuran 1.5 ml dan Tambah 500 l CHISAM


kemudian Vortex lagi sampai homogeny. Centrifuge
lagi dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit).
Lalu pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml
dan tambah 500 l CHISAM lagi-lagi bahan di
Centrifuge 10000 rpm (10 menit).
Dan lagi-lagi dipindahkan supernatan ke tube
baru 1.5 ml dan tambah 300 l isopropanol dingin
secara perlahan-lahan. Bolak-balik tube secara
perlahan kmudian Inkubasi dalam freezer (30 menit),
setelahnya keluarkan tube ( biarkan hingga tidak
terlalu dingin ), lalu Sentrifuse (8000 rpm) selama 10
menit. Dan buang supernatan dan tambahkan buffer
pencuci 500 l pada pellet dalam tube kemudian
vortex.
Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit) kemudian
buang supernatan. Kering anginkan pellet 20 menit
Dan terakhir tambahkan buffer TE 50-100 l dan
larutka pellet DNA dengan mengetukan tube
perlahan Tambah 1 l RNAse , inkubasi dalam oven
(37oC selama 30 menit).
ISOLAT DNA pun di dapatkan jangan lupa
Simpan dalam Freezer, Dokumentasikan dan
laporan pun siap menunggu untuk dikerjakan dan
dikumpulkan
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil (Dokumentasi dan Keterangan)

No

Gambar

Keterangan

Sampel yang digunakan


adalah daun bayam
Hasilnya :
DNA tidak terlihat

Sampel yang digunakan


adalah daun belimbing
Hasilnya :
DNA terlihat

Sampel yang digunakan


adalah daun sawi hijau
Hasilnya :
DNA tidak terlihat

4.2 Pembahasan di banding dengan literature

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa


dari ketiga hasil yang didapat dapat dilihat bahwa
benang-benang yang terlihat jelas hanya di sampel
no dua (daun belimbing), hal ini dikarenakan untuk
sampel daun belimbing baru saja dipetik dan masih
muda. Sehingga memungkinkan untuk lebih terlihat
DNA nya Sedangkan pada kedua sampel lainya ,
DNA tidak terlihat, hal ini dikarenakan kedua sampel
lainya
merupakan
sampel
dari
kelompok
sebelumnya yang diambil lebih dahulu dibanding
sampel daun belimbing. Selain itu kegagalan isolat
lainnya
pada kedua sampel ialah pada saat
diletakkan pada freezer dan adanya human error.
Human error pun dapat disebabkan oleh adanya
kesalahan saat pengambilan supernatant atau saat
pemberian larutan lainnya.
Hal ini sesuai literatur yang didapat, menurut
Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA
dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi
pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat
menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena
adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzimenzim seperti polimerase, ligase, endonuklease
restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain
yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat
digunakan untuk aplikasi penelitian.Selain itu
disebabkan adanya faktor internal dan eksternal.
BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Dari hasil praktikum dapat di simpulkan bahwa
pada pengamatan bahwa DNA terlihat pada sampel
daun belimbing. Hal ini dikarenakan untuk
pengambilan sampel daun belimbing dipetiknya baru
mendekati saat pratikum dibandingkan pengambilan
sampel lainnya
5.2 Saran
Untuk praktikum
- Alat yang digunakan perlunya pembaharuan
mengenai jenis alat yang digunakan.
- Waktu untuk pratikum lebih diperhatikan lagi,
agar pratikan bisa mengikuti sampai tahapan
terakhir
Untuk assiten :
- Sudah baik, lebih ditingkatkan lagi penjelasannya
mbak , biar kita tidak bingung

DAFTAR PUSTAKA
Ardiana, Dwi Wahyuni.2009.Teknik Isolasi DNA Genom
Tanaman
Pepaya
dan
Jeruk
dengan
Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Teknisi

Litkayasa Nonkelas pada Balai Penelitian


Tanaman Buah Tropika, Sumatera Barat.B
uletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 1216.5hal
Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD.
Disampaikan pada Pelatihan
Giri, Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada
Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi
Bandung.
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi
FMIPA UM
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen,
Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas
(Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil
Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai
Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri
Malang
Listanto,

E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal


Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of
Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana
isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic
untuk polymerase chain reaction. Balai
penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Mader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: Lowa


Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman
jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas
Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.
(Tidak Dipublikasikan)
Barnum, 05 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an
Introduction, 2nd edition. USA : Thomson
Brooks/Cole.

Utami, Annisa.dkk .2012. Variasi metode isolasi DNA


daun temulawak (cucurma xanthorrhiza).
Prosiding seminar nasional kimia Unesa.
Surabaya
Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag
Mada University Press. Yogyakarta
Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan
DNA
Baru
pada
Bakteri
Radioresisten
Deinococcus
radiodurans.Prosiding
Seminar
Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni
2004.