Ttulo de la prctica: Inmovilizacin de enzimas

Burbano C.*; Constante B.*; Taco D.*; Vaca L.

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA AGROINDUSTRIAL II
Grupo 2
*Escuela Politcnica Nacional, Facultad de Ingeniera Qumica y Agroindustria
Quito, Ecuador
e-mail: crlsburb@hotmail.com, belencita_sb@hotmail.com, detj_27@yahoo.com, luisfvacab_1802@hotmail.com

Resumen: La presente prctica tiene como objetivos inmovilizar la tripsina en una columna cromatografa y determinar su
actividad enzimtica. La inmovilizacin de la enzima se llev a cabo mediante un mtodo fsico, para lo cual se prepar la
columna utilizando 100mL de DEAE Sepharosa CL-6B previamente lavada con agua destilada y con solucin tampn de fosfato
con el objetivo de regular el pH; posteriormente se prepar el extracto y se aliment a la columna 50mL del mismo con ayuda de
una bomba peristltica, una vez terminada su alimentacin, se aadi a la columna la solucin tampn, durante este proceso se
tomaron diferentes muestras cada 3 min, las muestras obtenidas se llevaron al espectrofotmetro a 280nm con el fin de
determinar en qu momento la presencia de protenas sera casi nula; finalmente se aliment a la columna el BApNA; tomando
muestras cada 3 minutos y analizndolas a 410nm se determin el grfico absorbancia vs tiempo, el mismo que evidenci que
parte de la enzima fue inmovilizada con xito.
Palabras clave: Inmovilizacin, sustrato, BAPNA, DEAE Sepharosa CL-6B, tripsina, absorbancia, espectrofotmetro, protena.
Abstract The aim of this practice is to immobilize trypsin in a chromatographic column and determine its enzymatic activity. The
enzyme immobilization was carried out by a physical method, for which the column was prepared using 100 mL of DEAE
Sepharose CL-6B previously washed with distilled water and phosphate buffer in order to adjust the pH; then 50mL the extract
were prepared and fed to the column, using a peristaltic pump, once it finished, buffer solution is added to the column, during
this process different samples were taken every 3 min, samples obtained they took the spectrophotometer at 280 nm in order to
determine when the presence of proteins would be negligible; finally fed to the column BApNA; every 3 minutes by sampling and
analyzing at 410 nm the graph, absorbance vs time was determined. This graph allows us to show that part of the enzyme was
immobilized successfully
Keywords: Inmobilization, substrate, BAPNA, DEAE Sepharose CL-6B, trypsin, absorbance, spectrophotometer, protein.

1. MATERIALES Y METODOLOGA
La ejecucin de sta prctica empez por la preparacin
de la columna cromatogrfica, para lo cual, se tom 100
mL de DEAE Sepharosa CL-6B y se excluy el etanol
que conservaba al gel empleando una bomba de vaco y
el filtro MILLIPORE, luego se suspendi y se agit el
gel en agua destilada durante 10 minutos; posterior a esto
se filtr por segunda ocasin el gel utilizando el filtro
MILLIPORE y se lav la Sepharosa por tres ocasiones
con agua destilada y con una solucin tampn fosfato 50
mM y pH 7,5, con lo cual se dej suspendido el gel en el
tampn .Se empac el gel hasta 5 cm del nivel superior
de la columna, evitando que sta se seque y se coloc el
segundo pistn.
Despus de la preparacin de la columna cromatogrfica,
se prepar la muestra, para lo cual se midi e igual la
conductividad del extracto enzimtico con la solucin
tampn.
Para terminar, se realiz la alimentacin de la muestra en
la columna, para lo cual, se emple 50 mL del extracto
enzimtico (25 mg/mL) y una bomba peristltica a
velocidad constante, posterior a esto, se midi la
absorbancia de varias fracciones del producto lavado con
la ayuda de la solucin tampn, se evacu por la
columna. Finalmente, se agreg en la columna la
solucin de sustrato BApNA equivalente a 15 mg/mL, se
recogi el producto en tubos cada tres minutos y se

midi la absorbancia a 410 nm con la ayuda de un

espectrofotmetro. Con los datos experimentales que se
obtuvieron se grafic la curva absorbancia en funcin del
tiempo.
2. TABLAS DE DATOS Y DIAGRAMAS
Tabla 2.1. Absorbancia a 280nm

N de Tubo

t (min)

Densidad
ptica (nm)

0,052

0,556

2,063

12

2,113

15

2,127

18

2,125

21

2,125

24

2,128

27

2,125

10

30

2,122

11

33

2,125

12

36

2,123

13

39

2,124

14

42

2,123

15

45

2,11

16

48

1,08

17

51

0,141

18

54

0,045

19

57

0,023

20

60

0,01

21

63

22

66

0,003

23

69

0,004

24

72

0,0008

25

75

0,0004

Solucin
de
sustrato
BApNA

275

En donde:
t : Tiempo (min)
# Fraccin: nmero de tubos que se han tomado en la
muestra

N de Tubo
1

t (min)
3

Densidad
ptica (nm)
0

0,013

12

0,004

15

0,002

2.5

18

0,045

21

0,093

24

0,148

27

1,533

10

30

1,713

11

33

1,802

12

36

2,051

13

39

2,116

14

42

2,38

15

45

2,076

Absorbancia [nm]

4. RESULTADOS Y DISCUSION

1.5
1

Absorbancia a
280 nm

0.5

Absorbancia a
410 nm

-0.5

50

100

Tiempo [min]
Figura 4.1. Absorbancia en funcin del tiempo

Tabla 2.3. Cantidad de reactivos utilizados y algunas

propiedades.

DEAE
Sepharosa
CL-6B
Solucion
tampn
fosfato
Tripsina

slido

3. CLCULOS

Tabla 2.2. Absorbancia a 410 nm

Reactivo

15 mg/
mL

Punto
de
fusin
(C)

Densidad
relativa

Cantidad

Estado de
agregacin

100 mL

slido

260

1,81

50 mM

acuoso

50 mL

slido

En la figura 4.1 se observa el cromatograma

obtenido de la lectura de las fracciones proteicas
obtenidas por cada 3 minutos. El mtodo de
retencin usado fue un mtodo fsico (de
atrapamiento, filtracin en gel), especficamente se
realiz la inmovilizacin en el soporte Sepharosa
CL 6B, debido a la sencillez requerida para los
ensayos, as como la poca cantidad que se requiere
tener de enzima para obtener derivados activos,
adems de que la tripsina no sufre ninguna
alteracin en su estructura, ya que el mtodo usado
sirve para separar protenas en base a la
diferenciacin de tamao molecular (Arroyo, 1998,
p.3; GE Healthcare, 2007, p.2). La primera curva
que se observa corresponde a las muestras de
tripsina que han logrado filtrarse por el soporte;
estas muestras obtenidas son analizadas a una
longitud de onda de 280 nm, en la cual las

protenas presentan la mxima absorcin

(Plummer, 2008, p.8). Tericamente hablando la
tripsina debe retenerse en los poros del soporte, por
lo que la enzima ser retenida de mejor manera de
acuerdo al soporte utilizado; y una vez la enzima
haya ocupado una mayor cantidad de poros (se
hayan retenido la mayor cantidad de enzima en los
poros) de la columna, la enzima que ya no puede
retenerse contina por el flujo y se filtra; hasta la
muestra obtenida en el tubo 5 (tiempo de 15
minutos) se observa un aumento en la absorbancia,
lo que indica que conforme pas el tiempo haba
una mayor concentracin de enzima que no ha
logrado ser inmovilizada; desde el tubo 6 hasta el
tubo 15 (desde tiempo de 18 minutos a 45 minutos)
se observa que la absorbancia no aumenta; y desde
el tubo 16 hasta el tubo 25 (tiempo de 48 minutos a
75 minutos) se observa un descenso en la curva
hasta que la absorbancia medida aproximadamente
es cero, lo que implica que en el flujo de
alimentacin se ha filtrado toda la enzima que no
se ha retenido en los poros; cabe recalcar que en el
tubo 21 no se pudo evidenciar la absorbancia
debido a que en el tubo 20 hubo un exceso de
muestra, por lo que en el tubo 21 se recogi una
pequea cantidad de muestra que no se pudo
analizar. Debido a que la absorbancia de las
mediciones dan valores mayores a 2, se debi
realizar diluciones para obtener datos ms reales de
la absorbancia, ya que estos datos se encuentran
fuera del rango lineal (en base a la curva de
calibracin), y al no hacer diluciones entonces el
grfico de la absorbancia a la longitud de onda de
280 nm nicamente me puede indicar que si los
valores de absorbancia llegan a cero entonces toda
la enzima no inmovilizada ha logrado pasar por el
filtro y que en la columna se encuentra la enzima
inmovilizada, mas no me permite saber la cantidad
de protena que en realidad existe (Daz et al.,
2006, p.7).
Una vez que la tripsina no inmovilizada se separ,
en la columna qued la enzima inmovilizada, por
lo que para comprobar la presencia de la enzima, se
comprob la actividad de la misma, utilizando el
sustrato
BAPNA.
La
tripsina
reacciona
hidrolticamente entre los grupos carboxilo y
amino del sustrato, resultado de la hidrlisis una
molcula de p-nitroanilina, que provoca una
coloracin amarilla en la solucin; este cambio de
coloracin es la caracterstica que permite seguir la
actividad
enzimtica
mediante
la
espectrofotometra a una longitud de onda de 410
nm (Battaner, 2000, citado en Quinchuela, p.21;

Pichaikanu, 2005, citado en Mesn, 2013, p.61).

Segn la figura 4.1, en la segunda curva (curva de
absorbancia a longitud de onda de 410 nm) se
observa que desde el nuevo tubo 1 hasta el tubo 5
(tiempo de 3 minutos a 15 minutos) no existe una
lectura en la absorbancia o la lectura es mnima, lo
que indica que lo que se empez a leer fue
nicamente el tampn que se corri para movilizar
la solucin y que la enzima an no llegaba hasta el
otro extremo; desde el tubo 6 hacia adelante (desde
tiempo de 18 minutos) se observa un incremento en
la curva de absorbancia, debido a que la coloracin
de cada muestra fue mayor, lo que indica que en
cada muestra tomada la concentracin de enzima
era mayor por lo que reaccionaba ms con el
sustrato y produca una mayor cantidad de pnitroanilina; finalmente se observa que en la
muestra 15 (tiempo de 45 minutos) la absorbancia
disminuye, lo que significa que la mayor cantidad
de sustrato ya reaccion, y que en la columna
queda una menor cantidad de enzima; el descenso
tambin pudo ser causado por una falla en la
bomba peristltica, la cual se da por lo que la
enzima dej de correr en la columna y se obtuvo
una menor cantidad en la muestra final. Debido a
que la absorbancias de estas mediciones tambin
dieron valores elevados, se encontraban fuera del
rango lineal, por lo que las mediciones no fueron
confiables, por lo tanto la curva de absorbancia a
410 nm nicamente me puede indicar que si existi
enzima inmovilizada en la columna que actu con
el sustrato, que se pudo evidenciar por el aumento
de absorbancia y el cambio de color, pero no me
permite conocer la actividad proteoltica
propiamente dicha, ni los parmetros cinticos de
la enzima.
5. CONCLUSIONES
Se determin que parte de la enzima efectivamente se
inmovilizo al observar un cambio en la coloracin de la
columna (amarillo) al alimentar el sustrato, as como
tambin al observar un aumento en la absorbancia
medida a 410 nm.
No se pudo determinar la cantidad de tripsina no
inmovilizada, ya que los datos obtenidos a 280 nm no
se encontraban dentro de un rango lineal, por lo que no
se podan considerar como confiables.
La curva absorbancia vs tiempo a 280 nm se utiliz
nicamente para determinar el momento en el cual toda
la enzima no inmovilizada se filtr por la columna.

6. RECOMENDACIONES
Se debe tener cuidado al momento de lavar el sistema,
ya que si se seca se puede ocasionar que la Sepharosa se
agriete.
Se debe emplear una correcta longitud de onda al
momento de medir la absorbancia en el
espectrofotmetro, caso contrario se tendrn errores en
los resultados de las mediciones.
Se debe limpiar bien el lado de la celda espectrofotomtrica
por donde se pasa el haz luz para obtener datos correctos de
medicin.
Se debe realizar una dilucin de las muestras que se
encuentren demasiado concentradas para obtener un dato de
absorbancia en el espectrofotmetro confiable.
Se deben rotular las muestras seguir un orden en las
mediciones de absorbancia para evitar confusiones en las
lecturas.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Arroyo, M. (1998). Inmobilized enzymes: Theory, methods of
study and applications. Ars Pharmaceutica, 39(2), 23-39.
Daz, N., Brcena, J., Fernndez, E., Galvn, A., Jorrn, J.,
Peinado, J., Melndez, F. y Tnez, I. (2006).
Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin
colorimtrica
de
biomolculas.
Recuperado
de:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
(Noviembre, 2014).
GE Healthcare. (2007). Protein and Peptide Purification:
Technique
Selection
Guide.
Recuperado
de:
https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Relate
d%20Content/Files/1314723116657/litdoc18112863_201311
19232859.pdf (Noviembre, 2014).
Mesn, E. (2013). Potenciacin de efecto txico de Bacillus
thuringiensis subs. israelensis contra la boca del caf
(Hypothenemus hampei Ferrari) con un inhibidor de sernproteasas purificado a partir de frijol de soya (Glycine max).
(Informe de tesis no publicado). Instituto Tecnolgico de
Costa Rica, Cartago, Costa Rica.

Plummer, D. (2008). Introduccin a la Bioqumica

prctica.
Recuperado
de
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plum
mer/Chp04.pdf (Noviembre, 2014)
Quinchuela, L. (2013). Inmovilizacin covalente de la
tripsina en sepharosa. (Proyecto previo a la obtencin del

ttulo de Ingeniera Qumica). Escuela Politcnica Nacional,

Quito, Ecuador.