Anda di halaman 1dari 20

LAPORAN KIMIA ANALISA OBAT II

SPEKTROFOTOMETRI DAN KLT

Disusun Oleh :
Nama

: Deviannistia Suyonoputri

NPM

: 1143050105

Spektrofotometri
1

2.1

PENGERTIAN
Spektrofotometri merupakan salah satu jenis teknik dari spektroskopi yang

mempelajari tentang absorpsi dan emisi radiasi dari suatu senyawa. Radiasi tersebut
didasarkan atas gelombang elektromagnetik dengan kecepatan

m/detik (Sudarmadji,

1996; Holme & Peck, 1998). Gelombang elektromagnetik tersebut dapat diketahui panjang
gelombangnya dari spektrum sinar yang dibiaskan. Spektrum-spektrum tersebut dibagi
menjadi dua yakni cahaya tampak dan cahaya tak tampak. Dengan adanya spektrum inilah,
maka dapat digunakan untuk menganalisa suatu senyawa atau mikrobia dalam dalam
sejumlah penelitian. Alat yang betindak untuk spektrofotometri disebut spektrofotometer
(Christian, 1994).
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan
cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau
kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan
dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalam kuvet.

2.2

JENIS JENIS SPEKTROFOTOMETRI


Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan.

Diantaranya adalah sebagai berikut:


1.

Spektrofotometer Vis (Visible)

2.

Spektrofotometer UV (Ultra Violet)

3.

Spektrofotometer UV-Vis

4.

Spektrofotometer IR (Infra Red)

1. Spektrofotometer Visible (Spektro Vis)


Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya
tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap
oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga
semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama
ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan
simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C)
dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilkii warna. Hal ini
menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk
sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan
reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus
betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk
senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein).
Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat
berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan
peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat
dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru
menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar
konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometer UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometer visible, pada spektrofotometer UV berdasarkan
interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.
Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy
hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan
daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen
hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa
3

Yunani, deuteros, yang berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap
sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa
preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau
centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut
sempurna.
Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein
terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu
dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample
dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada
panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample
(Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar. Spektrofotometri UV
memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian
preparasi sample.
Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari
senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini
berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
3. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya
visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar
sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk
sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk
sample tak berwarna.

4. Spektrofotometer IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometer ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah
dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan
pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada spektro IR meskipun
bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif.
Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa,
terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan
adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap
panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal
standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni.
Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva
yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry
(NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan
baku yang bersifat rutin dan cepat.

2.3

BAGIAN ATAU KOMPONEN SPEKTROFOTOMETER


Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :
a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang

stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut
terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah
panjang gelombang (l ) adalah 350 2200 nanometer (nm).

b. Monokromator
5

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis


menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda
(terdispersi).
c. Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau
cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic
dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di
daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat
dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk
pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya
akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan
konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan
mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya
sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam
persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.

2.4

PRINSIP KERJA SPEKTROFOTOMETER


Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur jumlah relatif cahaya dari panjang

gelombang yang berbeda yang diabsorbsi dan ditransmisikan oleh suatu senyawa. Gambar 1
menjelaskan mekanisme kerja spektrofotometer yang mana cahaya putih dibiaskan oleh
prisma menjadi sejumlah cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Cahaya tersebut
akan melewati sampel dan kemudian melewati tabung/kuvet yang mengubah energi cahaya
menjadi energi listrik yang digunakan untuk mengukur densitas sampel tersebut (Campbell et
al., 2011).

Gambar 1. Prinsip kerja spektrofotometer (Campbell et al., 2011).


Teknik spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisi baik secara kuantitatif maupun
secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan adanya pola spektrum yang
mengenali suatu senyawa dan secara kuantitatif berdasarkan hukum Lambert-Beer. Hukum
Lambert-Beer mengatakan bahwa intensitas suatu cahaya yang diserap berbanding lurus
dengan konsentrasi senyawa. Semakin besar suatu konsentrasi, maka semakin besar nilai
absorbasinya. Dengan adanya Hukum ini, maka dapat dirumuskan nilai absorbansi dengan
persamaan:

A=bc

A = Absorban
= koefisien ekstingsi molar
b = tebal larutan (kuvet)
c = konsentrasi larutan

Tipe-tipe SpektrofotometerPada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer,


yaitu
1. Single-beam instrument
Single-beam instrument
dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukurabsorbansi pada panjang gelombang
tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapakeuntungan yaitu sederhana, harganya
murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakankeuntungan yang nyata. Beberapa
instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan

sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190sampai 210 nm dan paling tinggi
adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).
2. D o u b l e - b e a m i n s t r u m e n t
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.
Double-beaminstrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan
cerminyang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan
blangko dansinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang
keluarmenjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh
alat pembaca (Skoog, DA, 1996).

2.5

KALIBRASI ALAT SPEKTROFOTOMETER


Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelum

digunakan untuk analisis. Secara umum sbb:


1. Nyalakan alat spektrofotometer
2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)
3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi.
4. ->keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur
saat kuvet dalam keadaan terisi larutan.
5. Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer
6. lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam
bentuk teks)

Contoh tabel pengamatan absorbansi sebagai fungsi gelombang

Hal-hal yang harus diperhatikan :


8

Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna


Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka
larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila
diukur dengan menggunakan lampu UV.
Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai
absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya
juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap
satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang
maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat
terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat kesalahannya akan kecil sekali.

Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban


Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan
cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb
oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung
pada senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang
dan absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

Prosedur Kerja
1.
Pembuatan Kurva Standar

10

2. Penentuan Kadar Vitamin C

3. Data dan perhitungan

11

Kromatografi Lapis Tipis


Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang
ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi
juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik
seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi
senyawa murni skala kecil.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang
dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan
pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT
adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat
dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai
jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh
pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0
A. Fungsi Kromatografi Lapis Tipis
12

Digunakan untuk tujuan analitik

Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau


pemadaman fluoresensi, radiasi UV

Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending) atau menurun (descending) atau
dengan cara elusi 2 dimensi

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan
merupakan noda yang tidak bergerak

Identitas komponen dijabarkan dalam harga Rf (retardation factor) yang dalam


penentuan kualitatif dibandingkan dengan standar

Untuk tujuan kuantitatif digunakan KLT preparatif (dikerok lalu senyawa diisolasi
dalam pelarutnya)

B. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis


Prinsip
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel
dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat
silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau
campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel
dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Visualisasi
Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini
sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat
karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai
adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)
adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila
pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu.
Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.
Nilai Rf
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu
perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama
walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini
digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat
retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi.
Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :
13

Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut


Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di
bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang
polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf
memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang
sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan
merupakan senyawa yang berbeda.
a. Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh
atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom
silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H
selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah aluminaaluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang
kita

sebutkan

tentang

jel

silika

kemudian

digunakan

serupa

untuk

alumina.

b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram


Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawasenyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung
pada:
Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul
senyawa dengan pelarut.
Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar
atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat
dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang
lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya.
Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam
14

pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa
dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini
akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari
permukaan silika.
Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan
yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali
pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses
penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat
senyawa

dijerap,

semakin

kurang

jarak

yang

ditempuh

ke

atas

lempengan.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik


ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu
dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
C. Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau
alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga
mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak
merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam
pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan
isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning
a. Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang
merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.

15

Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis:


Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis
di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan
tinta,

pewarna

dari

tinta

akan

bergerak

selayaknya

kromatogram

dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa

batas

pelarut

berada

di

bawah

garis

dimana

posisi

bercak

berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh
dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari
campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai
perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini
akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk
kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
b. Perhitungan nilai Rf
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari
lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini
berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna
masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas
kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Nilai

Rf

untuk

setiap

warna

dihitung

dengan

rumus

sebagai

berikut:

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut
16

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah
menjadi:
nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf
untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi
pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah.
c. mengidentifikasi senyawa-senyawa
Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya. Caranya :
Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil
yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan
yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang
sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam
amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas
dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang
terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan
bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui
posisi dan warnanya.
D. Kromatografi Lapis Tipis pada Substansi Tak Berwarna
a. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercakbercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan
sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

17

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-posisi dari bercakbercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda
mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
b. Menggunakan bercak secara kimia
Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat
kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan
dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino
menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan

1.Penjerap/Fase diam

18

Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke
fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis
yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin
penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral.
Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan
penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur
kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat,
mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah
antara 11-12 % b/b.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik
dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak.
Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.
2. Fase Gerak pada KLT
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencobacoba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah
dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut
ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknikyang sensitive

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara
0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf
Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non
polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai
fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu.
Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing - masing akan mening-katkan elusi
solut-solut yang bersifat basa dan asam.

3. Aplikasi (Penotolan) sampel


19

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana
dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan
menurunkan resolusi.

20