Anda di halaman 1dari 11

Vektor-vektor Kloning Untuk Escheria coli

AMIRAH AMATULLAH
1206262071, Teknologi Bioproses,
Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik Universitas Indonesia

ABSTRAK
Dalam melakukan kloning terhadap suatu sel organisme dibutuhkan vektor. Vektor adalah
molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu
fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan
ekspresi DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot seperti
E. coli (selain plasmid) adalah bakteriofage dan kosmid.
Kata Kunci
vektor, kloning, BAC, bakteriofage, kosmid, sisipan, restriksi, lisogenik, genom
1. PENDAHULUAN
Sejauh ini, penggunaan plasmid kecil
sebagai vektor kloning untuk E. coli telah
dipertimbangkan. Namun, plasmid kecil
bukanlah satu-satunya molekul yang dapat
bereplikasi dalam sel bakteri. Contohnya, E.
coli faktor F (fertilitas) adalah plasmid besar
yang dapat bereplikasi secara independen
terhadap kromosom bakteri, seperti plasmid
lain. F faktor digunakan sebagai dasar
vektor bakteri kromosom buatan (BAC),
untuk kloning potongan yang sangat besar
dari DNA. Virus bakteriofage juga dapat
bereplikasi dalam sel bakteri, dan beberapa
dari mereka telah dikembangkan untuk
digunakan sebagai vektor kloning. Ini

termasuk fage M13, lamda, Miu dan P1.


Vektor M13 memiliki banyak kesamaan
dengan vektor pUC. Vektor-vektor tersebut
dapat digunakan untuk menghasilkan DNA
untai tunggal dan mereka sangat berguna
dalam penentuan urutan DNA, meskipun
sekarang mereka kurang banyak digunakan
untuk ini. Vektor lamda digunakan untuk
tujuan kloning yang lebih umum. Fage Miu
sering dimanfaatkan karena kemampuannya
untuk bertindak sebagai elemen genetik
yang dapat ditranspose, dan fage P1 sangat
berguna untuk memproduksi fage kromosom
buatan (PAC). Seperti BAC, fage ini dapat
dimanfaatkan untuk kloning potongan yang
sangat besar dari DNA. Ada juga pilihan

Tabel 1. Jenis-jenis vektor beserta jumlah DNA yang dapat disisipkan vektor

(Sumber: http://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/jbptitbpp-gdl-tinadewiro-31390-3-2008ts-2.pdf)

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

vektor yang merupakan


plasmid dan fage.

hibrida

antara

2. VEKTOR BAC
Vektor
BAC
(Bacterial
Artifical
Chromosome) didasarkan pada faktor F
(fertilitas) yang diidentifikasi pada E. coli
sebagai katalisator pertukaran genetik antar
sel. Faktor F adalah plasmid yang dapat
mengarahkan transfernya sendiri ke dalam
sel yang belum mengandung plasmid. Sel
yang mengandung plasmid F kadang-

kadang disebut sebagai sel jantan. Transfer


ini dimediasi oleh filamen protein pilus seks.
Selain merupakan molekul yang terpisah,
faktor F dapat berintegrasi ke dalam
kromosom inang untuk membentuk strain
Hfr (rekombinasi frekuensi tinggi). Eksisi
menyimpang dari kromosom inang in-vivo
dapat menghasilkan bentuk plasmid F yang
mengandung potongan tambahan DNA
kromosom. Ini disebut plasmid F '. Karena
plasmid F mampu menampung urutan DNA
tambahan, yang bisa sangat besar, ia juga
dapat digunakan sebagai dasar vektor
kloning yang dapat menyebarkan sisipan

Gambar 1. Prosedur penggunaan vektor BAC


(Sumber: http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/)

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

DNA besar. Plasmid F biasanya tersedia


dalam jumlah salinan yang rendah, biasanya
satu atau dua molekul per sel. Jumlah
salinan yang rendah meningkatkan stabilitas
dari molekul, karena ada salinan lebih
sedikit untuk bertindak sebagai substrat
potensial untuk penghapusan rekombinasidimediasi. Hal ini bermanfaat ketika vektor
BAC
digunakan
untuk
mengkloning
potongan yang sangat besar dari DNA,
ketika
ketidakstabilan
dapat
menjadi
masalah.
Kerugiannya adalah yield DNA dari
ekstraksi sel rendah tetapi stabilitas yang
meningkat ketika kloning potongan besar
DNA biasanya menutupi hal ini. Vektor BAC
dapat dengan mudah digunakan untuk
menerima sisipan dari 100-300 kbp. Contoh
dari vektor BAC ditunjukkan pada Gambar
4.1. Urutan repE dan oriS diperlukan untuk
replikasi, dan urutan parA--C mengatur
jumlah salinan. Ada penanda yang dipilih,
untuk ketahanan terhadap kloramfenikol
(camR), dan urutan lacZ' mempunyai situs
kloning dan memungkinkan identifikasi
keberadaan sisipan. rekombinan vektor BAC
dapat dengan mudah dimasukkan ke E. coli
dengan elektroporasi.
3. VEKTOR BAKTERIOFAGE M13
3.1 Biologi Umum
Bakteriofage M13 sangat berguna
karena siklus hidupnya yang agak tidak
biasa, yang memberi kita cara untuk
mendapatkan DNA beruntai tunggal dari
dsDNA. Fage ini termasuk dalam
kelompok yang disebut fage 'kurus' atau
menyerupai filamen, dikarekan oleh
ukurannya. Salah satu contoh tipikal fage
yang menyerupai filamen, fd, memiliki
dimensi 850nm x 6nm x 6nm. Partikel
yang menginfeksi mengandung DNA
beruntai tunggal yang terkandung dalam
mantel protein terdiri dari sebuah subunit
dari spesies protein tunggal yang
merupakan produk dari gen VIII fage.
Ada juga beberapa molekul produk
gen III fage. Fage dapat masuk ke dalam
sel bakteri dengan menempe ke pilus
seks sebelum mengirimkan DNA-nya ke
dalam sel. Oleh karena itu, fage ini hanya
akan menginfeksi sel jantan (yang

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

membawa F atau faktor F ', atau Hfr


strain). Begitu berada di dalam sel,
molekul beruntai-tunggal (disebut sebagai
untai plus, ) diubah menjadi molekul
untai ganda yang disebut bentuk replikatif
(RF). Hal ini dilakukan dengan cara yang
mirip dengan proses replikasi normal E.
coli, menggunakan origin spesifik sintesis
DNA pada molekul untai tunggal untuk
sintesis untai minus komplementer. Untai
minus kemudian dapat ditranskripsi untuk
menghasilkan protein virus. DNA RF juga
dapat direplikasi dengan model replikasi
lingkaran bergulir.
Pada replikasi lingkaran bergulir,
produk gen II akan berikatan dengan
situs tertentu pada genom beruntai ganda
dan menciptakan torehan pada untai,
sehingga terdapat sebuah gugus 3'hidroksil
yang
bebas.
Untai
ini
diperpanjang oleh DNA polimerase,
menggusur untai asli. Setelah satu
ronde sintesis, untai yang telah
dipindahkan dapat dipisahkan dari untai
yang baru disintesis pada torehan lain
oleh protein gen II. Ini menghasilkan
untai terpisah, dan ditutup oleh protein
gen II untuk menghasilkan molekul
melingkar. Untai ini dapat lagi dikonversi
ke RF, yang dapat menumpuk sampai
100 atau lebih eksemplar per sel. Selagi
RF terakumulasi, begitu pula protein fage
lain, produk dari gen V. Hal ini
menghentikan tidak hanya sintesis
protein gen II (mengurangi sintesis untai
tunggal), tetapi juga konversi untai
menjadi
RF.
Untaian
tunggal
terenkapsidasi dalam protein mantel dan
meninggalkan
sel.
Tidak
seperti
kebanyakan
fage,
virion
dapat
disekresikan dari sel tanpa menyebabkan
lisis.
Sebuah fungsi yang berguna adalah
bahwa tidak ada kendala pada ukuran
molekul DNA yang dapat dikemas
dengan protein mantel. Jika biasanya
molekul DNA harus dikemas lebih lama,
maka lebih banyak protein mantel yang
menempel. Ini berbeda dengan fage
lamda, misalnya, yang memiliki kendala
yang jelas pada jumlah DNA fage yang
dapat dikemas ke dalam setiap partikel
fage. Yang paling penting, bakteriofage
M13 menawarkan kita cara menghasilkan
3

DNA
rekombinan
untai
tunggal.
Endonuklease restriksi akan bekerja
hanya pada molekul beruntai ganda, dan
plasmid yang ditemui sejauh ini juga
beruntai gada; cara terbaik untuk
mendapatkan kloning DNA untai tunggal
adalab mencairkan dua helai terpisah dan
menggunakan mereka sebelum mereka
menyatu kembali.
Namun, jika molekul beruntai ganda
dapat dibuat menggunakan M13 RF
sebagai vektor dan digunakan pada E.
coli melalui transformasi, maka mereka
akan berperilaku di sana seperti DNA RF
normal dan menghasilkan salinan untai
tunggal dari molekul yang sama, yang
akan dikemas dan dilepaskan dari sel.
Jadi M13 menawarkan cara mengubah
dsDNA menjadi DNA untai tunggal. Hal
ini biasanya jauh lebih mudah dan lebih
dapat diandalkan untuk menggunakan
M13 daripada untuk mempersiapkan
DNA untai tunggal dari plasmid untai
ganda dengan denaturasi mereka.
3.2 Desain Vektor M13
Prinsip-prinsip yang sama yang kita
lihat dalam Bab 3 diterapkan pada desain
vektor plasmid juga berlaku untuk desain
vektor M13. Kita membutuhkan origin
replikasi. Fage memiliki origin nya sendiri,
sehingga tidak menimbulkan kesulitan.
Tidak ada masalah juga selama penanda
dipilih, sebagai fage adalah penanda
yang telah dipilih sendiri. Sel yang
mengambil DNA fage akan menghasilkan
lebih banyak fage dan menjadi fokus
untuk infeksi sel-sel lain. Penadahan sel
dari transformasi akan, oleh karena itu,
menghasilkan rumput (lapisan seragam
sel) yang bertabur lubang (plak) yang
timbul dari sel yang terinfeksi yang telah
mengambil molekul DNA fage dan
menghasilkan lebih banyak fage, yang
telah menginfeksi sel-sel di sekitarnya.
Meskipun M13 tidak benar-benar melisis
sel yang terinfeksi, itu menghambat
pertumbuhan mereka; sehingga plak
yang terlihat bukan merupakan plak yang
sebenarnya (yang timbul dari lisis sel),
tetapi daerah pertumbuhan yang lambat.
Waktu pembelahan sel dari terinfeksi E.
coli meningkat dari 20 menit dalam

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

kondisi optimum untuk lebih dari 2 jam


setelah infeksi M13. Karena plak hasil
dari pertumbuhan yang lambat daripada
lisis asli, mereka kadang-kadang dikenal
sebagai pseudoplak. Kemampuan fage
menginfeksi sel, menghasilkan lebih
banyak
fage
dan,
akibatnya,
menghasilkan plak tergantung pada
masuknya DNA tanpa mempengaruhi
gen fage yang diperlukan untuk replikasi.
genom M13 dikemas cukup erat. Oleh
karena itu, ada lebih sedikit tempat yang
tersedia untuk memasukkan DNA. Salah
satu yang tersedia, situs dalam spacer
intergenik antara gen II dan IV. Minigen
lacZ' dan beberapa daerah kloning telah
dimasukkan di sini. Modifikasi ini
membawa serta semua keuntungan dari
beberapa
situs
kloning
(seperti
kemampuan untuk menerima berbagai
fragmen restriksi dan memaksa kloning
dalam
orientasi
tertentu)
serta
keuntungan tambahan dari skrining
warna langsung untuk keberadaan
sisipan yang dilakukan oleh sistem
kloning lacZ.
Agar sistem lacZ untuk bekerja, sisa
gen beta-galaktosidase harus hadir
dalam inang. Setelah transformasi, selsel inang dicampur dengan X-gal dan
IPTG sebelum plating dan inkubasi untuk
membentuk rumput. Sel yang telah
mengambil DNA fage akan menimbulkan
plak, dan jika urutan coding lacZ' dalam
fage tersebut utuh, maka plak akan
memiliki warna biru dibedakan dari
background putih gading. Gambar 4.4
menunjukkan organisasi dari beberapa
fage M13 yang digunakan untuk kloning.
Sama seperti dengan plasmid pUC, ada
serangkaian fage, yang ditunjuk sebagai
'mp'. Wilayah kloning M13mp18 identik
dengan yang di pUC18, dan sebagainya.
Persyaratan untuk inang M13 adalah
sama dengan yang digunakan untuk
plasmid pUC (memang strain yang sama
biasanya digunakan). Daerah lain untuk
penggabungan DNA, misal antara gen
VIII dan III, juga telah dimanfaatkan,
tetapi
vektor
ini
kurang
banyak
digunakan. Persyaratan lain untuk vektor
juga puas dengan M13; 7,3 kb, vektor
cukup kecil untuk ditangani dengan
mudah, dan RF memiliki sejumlah salinan
4

yang tinggi di dalam sel. Bila


menggunakan M13 untuk membuat DNA
untai tunggal, jumlah salinan intraseluler
kurang penting dibandingkan dengan
vektor plasmid, seperti kita biasanya
tertarik pada DNA untai tunggal dalam
fage yang dikeluarkan dari sel yang
terinfeksi. Sedangkan DNA plasmid
intraseluler dikumpulkan oleh lisis sel
(dan ini adalah pendekatan yang diambil
untuk mempersiapkan RF DNA untuk
tujuan kloning), DNA beruntai tunggal
harus dikumpulkan agak berbeda.
Sebuah kultur yang telah terinfeksi sudah
diatur dan setelah beberapa saat sel-sel
yang
dihapus
oleh
sentrifugasi,
meninggalkan fage di supernatan. Fage
tersebut kemudian diendapkan, misalnya
dengan penambahan polietilen glikol dan
sodium klorida (meskipun metode lain
juga
mungkin),
diikuti
dengan
sentrifugasi.Pelet fage disuspensikan dan
protein
dihilangkan
dengan
fenol,
meninggalkan DNA beruntai tunggal
dalam larutan. Kemudian dikumpulkan
kembali dengan presipitasi. Pada kondisi
standar, beberapa mikrogram DNA
beruntai tunggal dapat diperoleh dari
beberapa mL kultur sel yang terinfeksi.
3.3 Penggunaan Bakteriofage M13
Pengurutan DNA. Untuk waktu yang
lama aplikasi yang paling penting dari
kloning M13 adalah dalam penentuan
urutan DNA dengan metode Sanger,
disebut juga metode deoksi atau
terminasi rantai. Hal ini bergantung pada
sintesis DNA dengan adanya inhibitor
pemutus rantai, 2', 3' - dideoksinukleosida
trifosfat (ddNTP). Metode ini sekarang
menjadi alat yang sangat standar dalam
biologi molekuler dan tidak akan dibahas
secara rinci di sini. Seperti yang
dikembangkan pada awalnya, metode ini
mengandalkan DNA untai tunggal
sebagai template; Oleh karena itu,
bakteriofage M13 secara rutin digunakan
untuk waktu yang lama sebagai vektor
untuk memberikan seperti DNA untai
tunggal untuk pekerjaan sequencing.
Namun, dengan perbaikan teknologi,
urutan materi beruntai ganda sekarang
rutin, menghindari kebutuhan untuk

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

langkah tambahan kloning ke dalam


vektor M13.
Vektor
tampilan.
Penggunaan
penting dari fag berserabut dalam sistem
layar fag. Di sini, coding urutan
dimasukkan ke salah satu gen protein
mantel, sering gen III. Hasilnya adalah
bahwa fag dihasilkan dengan bentuk
hybrid dari protein ini, yang merupakan
perpaduan dari urutan protein normal dan
produk protein dari urutan dimasukkan
(dengan asumsi urutan dimasukkan
memiliki kerangka baca sama dengan
gen III). Fag yang disekresikan dari sel,
dengan bahan ini ekstra 'ditampilkan' di
luar. Fusions dengan VIII gen juga bisa
direkayasa, sehingga tampilan lebih
banyak salinan peptida ekstra daripada
dengan gen III, sebagai mantan hadir di
lebih eksemplar per fag partikel. Vektor
display ini memiliki banyak kegunaan,
misalnya dalam skrining perpustakaan
dengan panning dan untuk produksi
vaksin.
Aplikasi lain. Beberapa protokol
untuk situs-diarahkan mutagenesis juga
menggunakan untai tunggal DNA, yang
dapat
diperoleh
dengan
vektor
berdasarkan fag berserabut. DNA untai
tunggal juga penggunaan tertentu dalam
menghasilkan probe untuk analisis RNA.
Probe dapat dibuat yang khusus untuk
transkrip RNA dari salah untai DNA.
Aplikasi yang terakhir berada di luar
cakupan buku ini, tetapi informasi lebih
lanjut dapat diperoleh dari manual
laboratorium khusus.
3.4 Turunan M13
Persyaratan
untuk
molekul
dapat
direplikasi sebagai DNA beruntai tunggal
dan dikemas ke dalam mantel fag
sederhana. Semua yang diperlukan
adalah untuk molekul mengandung asal
sintesis DNA virus, asalkan fungsi lainnya
dapat disediakan oleh molekul DNA lain
dalam sel, bertindak di trans. Fakta ini
memungkinkan pembangunan vektor
hibrida M13_plasmid, kadang-kadang
disebut phagemid, phasmid atau plage
(meskipun phasmid Istilah ini sering
digunakan untuk derivatif fag lambda).
Plasmid yang membawa M13 replikasi
5

asal selain asal konvensional dsDNA


sintesis dapat direplikasi baik sebagai
dsDNA dari yang terakhir atau sebagai
DNA untai tunggal dari asal M13.
Replikasi dari asal M13 membutuhkan
protein yang sesuai (seperti gen protein
II) yang akan diberikan dari fag pembantu
juga mereplikasi dalam sel. Replikasi
menghasilkan DNA untai tunggal yang
kemudian dapat dikemas ke dalam
mantel fag. Contoh phagemids adalah
vektor pUC118, 119 dan 120 Mereka
direplikasi sebagai plasmid sampai sel
yang berisi mereka adalah koinfeksi
dengan fag pembantu, seperti M13KO7,
yang menyediakan protein untuk sintesis
DNA beruntai tunggal dan kemasan.
M13KO7 adalah fag M13 yang telah
dimodifikasi, yang paling penting dengan
penggabungan asal replikasi plasmid.
Replikasi dari asal ini memungkinkan fag
penolong untuk hadir di sejumlah salinan
yang tinggi per sel dan, karena itu, untuk
memberikan jumlah yang lebih besar dari
protein yang diperlukan untuk mereplikasi
dan paket molekul phagemid. M13KO7
juga
mengandung
gen
resistensi
kanamisin untuk memungkinkan seleksi
untuk kehadiran fag pembantu. (Tentu

saja, adalah mungkin bahwa M13KO7


pembantu fag dapat dikemas juga, tetapi
dalam prakteknya molekul phagemid
yang dikemas ditemukan berada di
kelebihan 100 kali lipat selama fag
pembantu.) Contoh lain dari vektor ini
adalah
seri
pBluescript,
seperti
pBluescriptIIKS. Rangkaian plasmid
mengandung, selain fitur yang sudah
dijelaskan, promotor dari E. coli
bakteriofage T3 atau T7, yang berguna
untuk mengekspresikan urutan cloning.
Keuntungan utama dari sistem fagemid
adalah bahwa hal itu dapat digunakan
untuk menyediakan bahan tunggal atau
untai ganda tanpa kloning ulang.
4. BAKTERIOFAGE LAMDA
Di antara bermacam-macam virus, virus
lamda bakteriofage (untuk selanjutnya
disebut bakteriofage saja) merupakan jenis
virus yang berkembang biak di dalam sel
bakteri Eschericia coli dan kemudian
merusaknya (Muladno, 2010)
Bakteriofage (atau sederhananya fage),
yaitu virus yang menginfeksi bakteri,
ditemukan secara terpisah oleh Frederick W.
Twort di Inggris pada 1915 dan oleh felix

Gambar 2. Siklus lisogenik bakteriofage lamda


(Sumber: http://cronodon.com/images/Lambda_cycle.jpg)

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

dHerelle di Institut Pasteur di Paris pada


1917. Twort mengamati bahwa koloni-koloni
bakteri kadang-kadang mengalami lisis
(menjadi larut dan lenyap) dan bahwa efek
litik ini dapat ditularkan dari koloni ke koloni.
Bahkan bahan yang sangat encer dari suatu
koloni dapat menularkan efek litik. Namun,
bila filter tersebut dipanaskan maka sifat
litiknya rusak. Dari pengamatannya, Twort
dengan hati-hati mengusulkan bahwa
unsure litik itu mungkin virus. DHerelle
menemukan kembali fenomena ini pada
1917, karena itu disebut fenomena TwortdHerelle
dan
menciptakan
kata
Bakteriofage, yang berarti pemakan bakteri
(Pelczar dan Chan. 1986).
Virus yang menginfeksi bakteri disebut
bakteriofage atau fage saja. Walaupun
spectrum bakteri yang dapat diinfeksi satu
fage itu terbatas, banyaknya fage yang
dapat tak terhitung jumlahnya itu maka
sangat mungkin bahwa paling sedikit
terdapat satu fage untuk setiap tipe bakteri
(Volk dan Wheeler. 1988).
Beberapa kelompok bakteriofage yang
diteliti paling ekstensif ialah fage-koli,
dinamakan
demikian
karena
menginfeksi Eschericia coli. Mereka diberi
nama T1 sampai T7. Ada bakteriofage lain
untuk E. coli selain fage T, yaitu fage f2, fd,
fl dan lain lain (Pelczar dan Chan. 1986).
Karena virus bakteriofage ini berkembang
biak pada sel Eschericia coli (makhluk hidup
yang sangat sederhana pula), maka virus
bakteriofage merupakan virus pertama yang
dirancang oleh manusia untuk digunakan
sebagai biotranspor (Muladno, 2010).

vitro. Gambar 5.1 menunjukkan skema genkloning menggunakan kosmid a. Kemasan


rekombinan kosmid ke mantel fage
menekankan pilihan yang diinginkan pada
ukuran mereka. Dengan vektor kosmid dari
5 kb, penyisipan 32-47 kb DNA asing - lebih
dari yang dapat ditampung oleh vektor fage. Yang harus diperhatikan adalah, setelah
kemasan in-vitro, partikel digunakan untuk
menginfeksi inang yang cocok. DNA kosmid
rekombinan disuntikkan dan bersirkulasi
seperti DNA fag etetapi bereplikasi sebagai
plasmid normal tanpa ekspresi apapun
fungsi fage. Sel yang berubah dipilih
berdasarkan penanda vektor yang memiliki
resistensi terhadap obat.

5. KOSMID

Bahkan dengan DNA yang ukurannya


asing, dalam prakteknya dapat dihasilkan
kloning kosmid yang mengandung fragmen
DNA
non-contiguous
terligasi
untuk
membentuk sisipan tunggal. Masalahnya
dapat diatasi dengan defosforilasi fragmen
DNA asing sehingga mencegah ligasi
mereka bersama-sama. Metode ini sangat
sensitif terhadap rasio sasaran terhadap
vektor DNA yang tepat (Collins & Bruning
1978) karena ligasi vektor--vektor dapat
terjadi. Selain itu, rekombinan dengan vektor
digandakan tidak stabil dan runtuh di dalam
inang
oleh
rekombinasi,
sehingga
penyebaran vektor kosmid non-rekombinan.
Kesulitan tersebut telah diatasi dalam
prosedur kosmid-kloning dirancang oleh Ish-

Sebagaimana
yang
telah
dilihat,
konkatemer satuan panjang molekul DNA
dapat dikemas dengan efisien jika situs cos,
substrat untuk pembelahan bergantung
kemasan, terpisah dengan jarak 37-52 kb
(75-105% ukuran + DNA). Bahkan, hanya
daerah kecil di dekat situs cos yang
diperlukan untuk pengenalan oleh sistem
kemasan (Hohn 1975). Plasmid telah dibuat
mengandung fragmen DNA termasuk situs
cos (Collins & Bruning 1978, Collins & Hohn
1979, Wahl et al. 1987, Evans et al. 1989).
Plasmid ini telah disebut kosmid dan dapat
digunakan sebagai vektor kloning gen dalam
hubungannya dengan sistem kemasan in-

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

Kosmid merupakan wadah yang efisien


dalam mengkloning potongan besar DNA
asing. Karena kapasitas mereka untuk
fragmen besar DNA, kosmid adalah vektor
yang sangat menarik untuk membangun
perpustakaan fragmen genom eukariotik.
Pencernaan parsial dengan endonuklease
restriksi memberikan fragmen sesuai besar.
Namun, ada masalah potensial yang terkait
dengan penggunaan mencerna parsial
dengan cara ini. Hal ini disebabkan
kemungkinan dua atau lebih fragmen genom
bergabung bersama dalam reaksi ligasi,
sehingga menimbulkan kloning
yang
mengandung fragmen yang awalnya tidak
berdekatan dalam genom. Hal ini akan
memberikan
gambaran
yang
salah
organisasi kromosom mereka. Masalah ini
dapat diatasi dengan fraksinasi ukuran
pencernaan parsial.

Horowicz dan Burke (1981). Dengan


perawatan yang tepat dari pJB8 vektor
kosmid, kiri dan kanan vektor ujungnya
dimurnikan yang tidak mampu ligasi sendiri
tapi yang menerima DNA asing yag ter
defosforilasi. Dengan demikian metode
menghilangkan kebutuhan untuk ukuran
fragmen DNA asing dan mencegah
pembentukan klon yang mengandung DNA
asing pendek atau beberapa urutan vektor.

yang digunakan, efektif mencegah vektor diri


ligasi dalam reaksi ligasi. Kosmid modern
dari PWE dan SCOs seri (Wahl et al 1987,
Evans et al 1989) berisi fitur seperti: (Bates
& Swift 1983, Pirrotta et al 1983, Breter et al
1987) (i) beberapa situs kloning untuk
kloning sederhana menggunakan DNA nonsize yang dipilih; (ii) promotor fag mengapit
situs kloning; dan (iii) situs NotI, SacII atau
SFIL unik mengapit situs kloning untuk

Gambar 3. Pembentukan fage pentransduksi melalui kosmid


(Sumber: Schaums Outlines, 2006)

Sebuah solusi alternatif untuk masalah ini


telah dirancang oleh Bates dan Swift (1983)
yang telah membangun kosmid c2XB.
Kosmid ini membawa situs penyisipan
BamHI dan dua cos situs dipisahkan oleh
tumpul-end pembatasan situs. Penciptaan
ini ujung-ujung tumpul, yang ligasinya
sangat tidak efisien hanya di bawah kondisi

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

memungkinkan penghapusan insert dari


vektor sebagai fragmen tunggal. Modul
ekspresi koding penanda dominan yang
dipilih pada mamalia juga dapat disediakan,
untuk transfer gen ke sel mamalia jika
diperlukan.
6. BAKTERIOFAGE MU
8

Bakteriofage Mu, atau fage Mu, adalah


bakteriofage temperate (mempunyai siklus
hidup lisogenik), sejenis virus yang
menginfeksi bakteri. Ia termasuk keluarga
Myoviridae, dan terdiri dari kepala
ikosahedral, ekor kontraktil, dan enam serat
ekor.
Myoviridae Gambaran struktur dari fag
T4, dari keluarga yang sama (Myoviridae)
sebagai bakteriofage Mu.
Semua
fage
temperate
diketahui
menggunakan salah satu dari hanya tiga
sistem yang berbeda untuk siklus lisogenik
mereka: integrasi / eksisi mirip lamda,
transposisi mirip Mu, atau partisi fage N15
seperti pada plasmid.
Bakteriofage
Mu
menggunakan
transposisi
berbasis
DNA
untuk
mengintegrasikan genom ke dalam genom
sel inang yang menginfeksi. Kemudian
dapat menggunakan transposisi untuk
memulai replikasi virus DNA-nya. Setelah
DNA virus dimasukkan ke dalam bakteri,
protein/enzim transposase Mu dalam sel
mengenali situs rekombinasi di ujung DNA
virus (gix-L dan situs gix-R) dan mengikat
mereka, yang memungkinkan proses
replikasi DNA virus atau embedding ke
dalam genom inang. Unsur transposabel
(TE) adalah urutan DNA yang dapat
mengubah posisi relatif (self-transpose)
dalam genom dari sel tunggal. Mekanisme
transposisi dapat berupa "copy dan paste"
atau
"memotong
dan
menyisipkan."
Transposisi dapat membuat mutasi fenotip
signifikan dan mengubah ukuran genom sel.
Transposisi Fage Mu adalah contoh
terbaik dari transposisi replikatif. Mekanisme
transposisi
Its
agak
mirip
dengan
rekombinasi homolog. Transposisi replikatif
adalah mekanisme transposisi dalam biologi
molekuler, diusulkan oleh James A. Shapiro
pada tahun 1979, di mana elemen
transposabel diduplikasi selama reaksi,
sehingga entitas transposing adalah salinan
dari elemen asli. Dalam mekanisme ini,
urutan donor dan reseptor DNA membentuk
konfigurasi karakteristik intermediet theta
yang terkadang disebut intermediet Shapiro.
Transposisi replikatif adalah karakteristik
untuk retrotransposon dan terjadi dari waktu
ke waktu pada transposon kelas II.
7. BAKTERIOFAGE P1

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

Bakteriofage P1 atau fage P1 diisolasi


pada tahun 1951 oleh Giuseppe Bertani dari
Escherichia coli strain Lisbonne dan
Carrere. P1 telah banyak digunakan untuk
membangun strain bakteri baru dan
digunakan secara luas untuk memetakan
kromosom Escherichia Coli. P1 telah
digunakan sebagai model organisme untuk
aspek yang berbeda dari fage dan biologi
seperti
pembatasan modifikasi DNA,
rekombinasi spesifik terhadap situs, replikasi
plasmid,
partisi,
ketidakcocokan
dan
kecanduan.
Fage P1 menunjukkan morfologi klasik
bakteriofage dengan kepala ikosahedral,
ekor infleksibel sepanjang 220nm lengkap
dengan tabung yang dikelilingi oleh
selubung kontraktil, baseplate dan enam
serat ekor tertekuk. Kepala ikosahedral
berisi genom fage. Bagian variabel
(dikodekan oleh segmen P1 DNA yang
dapat diinvers) dari serat ekor (dengan
ketebalan 1-2nm) menentukan kekhususan
adsorpsi P1 pada inang yang berbeda-beda.
Ujung glukosa pada inti lipopolisakarida
dari membran luar bakteri bertindak sebagai
reseptor P1. Serat ekor fage P1
mempromosikan identifikasi bakteri inang.
Setidaknya tiga dari enam serat ekor
dengan molekul reseptor spesifik cukup
untuk
memicu
mekanisme
injeksi.
Mekanisme yang tepat dari mekanisme
penetrasi tidak diketahui tetapi model
menunjukkan bahwa kontrak ekor fage,
tabung ekor didorong melalui baseplate
menusuk membran sel luar bersama dengan
dinding sel bakteri. Sebuah proses lisis
transglikosilase memfasilitasi penusukan
dinding sel bakteri. Isi kepala fage kemudian
disuntikkan ke dalam periplasma sel inang
yang dimediasi oleh pori-pori. Mekanisme
lain
yang
menarik
adalah
sistem
pengecualian superinfeksi sim. Sim dengan
cepat diekspresikan segera setelah infeksi
pada
membran
dalam
atau
ruang
periplasma dari sel inang yang terinfeksi.
Hipotesis yang diajukan adalah bahwa Sim
protein perangkap superinfecting genom P1
di periplasma, sehingga tidak mengganggu
siklus infeksi P1 yang sedang berlangsung.
Karena genom P1 adalah linear, perlu cepat
diedarkan setelah memasuki sitoplasma
tuan rumah sebelum degradaded oleh
nucleases seluler. Mekanisme ini masih
9

belum diketahui tetapi diusulkan bahwa itu


dimediasi oleh situs-spesifik Cre-tergantung
rekombinasi menggunakan kehadiran dua
situs asap-Cre dalam beberapa genom fag.
Daftar mekanisme uncharacterized yang
bisa invovled. Sebuah kertas baru-baru ini
yang direkayasa sel inang E.coli kecil telah
menunjukkan tiga konfigurasi: tahap ekor
diperpanjang dengan DNA pada kepala fag,
tahap ekor kontrak dengan DNA dan tahap
ekor dikontrak tanpa DNA. Mereka juga
telah menunjukkan bahwa ada penetrasi
seragam dari tabung ekor bagian dalam ke
periplasma E.coli dan pergerakan signifikan
baseplate dari membran luar selama ekor
kontraksi.
Replika P1 minimalnya memiliki kerangka
terbuka untuk replikasi protein RepA, diapit
oleh dua set 19 pasang basa urutan
berulang, incA dan incC bersama dengan
asal replikasi plasmid. Pengikatan RepA ke
iteron di incC diperlukan untuk inisiasi
sementara pengikatan RepA ke iteron incA
yang berfungsi untuk mengontrol jumlah
salinan plasmid. Faktor tuan rumah
berkontribusi pada inisiasi oriR dan empat

lokasi bendungan metilasi GATC dalam asal


itu sendiri perlu termetilasi. Leleh DNA
terjadi melalui tindakan bersama dari Repa
dan tuan rumah faktor: DnaA dan HU.
Promotor RepA terletak di incC dan
diekspresikan ketika RepA berikatan dengan
interon. Protein RepA ada sebagai dimer
ketika baru disintesis tapi perlu menjadi
monomer memiliki aktivitas DNA-mengikat.
DnaK, DnaJ dan GrepE pendamping yang
diperlukan untuk mengkonversi dimer
menjadi monomer aktif.
Pengemasan bakteriofage ke kapsid virus
terjadi melalui proses yang memilih
kromosom virus untuk enkapsidasi dari pool
DNA yang sebagian besar terdiri dari urutan
DNA inang. Sebuah fitur umum dari
kemasan DNA adalah rangka protein
kosong yang berinteraksi dengan DNA virus
yang dimediasi oleh identifikas DNA yang
dikoding oleh fage dan pengolahan protein.
'pac' adalah situs pada DNA virus yang
mengikat protein.

10. KESIMPULAN
Ada tiga macam vektor yang telah dikembangkan untuk kloning DNA dalam Escheria
coli, yaitu plasmid, fage, dan kosmid. Sebagian besar DNA fage tidak penting untuk infeksi
dan dapat diganti dengan DNA asing. Mutan-mutan fage yang dirancang untuk kloning DNA
telah dikonstruksi. Hampir semua partikel-partikel fage yang dibentuk akan mengandung
DNA asing yang disisipkan. Kelebihan penggunaan virion-virion ini sebagai vektor ialah
bahwa virion akan memasuki bakteri dengan frekuensi lebih tinggi dari plasmid. Molekulmolekul DNA rekombinan dapat dikemas in vitro untuk membawa virion-virion yang infektif.
Kosmid adalah vektor lain yang dikonstruksikan dari plasmid normal dan tempat cos (ujung
kohesif) dari fage .
REFERENSI
Anonim, 2011.
Phage P1. [online] http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Phage_P1
[diakses pada 5 Oktober 2014].
Anonim,
2012
Bacterial
Artificial
Chromosomes
(BAC).
[online]
.
http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artifi
cial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC) [diakses pada 3 Oktober
2014].
Anonim, 2012. Mu: A Double-Stranded Transposable DNA Bacteriophage. ). [online]
https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiologytextbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dnabacteriophage-635-52/ [diakses pada 5 Oktober 2014].

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

10

Howe, C. J. 1995. Gene Cloning and Manipulation, New York: Cambridge


Primrose, S.B and Twyman, R.M., 2006. Principles of Gene Manipulation and Genomics.
Seventh Edition. Blackwell Publishing.
Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al., 2008. Molecular Cell Biology. New York: W. H.
Freeman.
Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: IPB Press.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning:. A Laboratory Manual.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Susan L.Elrod.,Ph.D and William D.,Ph.D, 2006. Schaums Outlines GENETIKA, Edisi
Keempat. Erlangga:Jakarta
Yuwono, Triwibowo, 2007. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.

Vektor-vektor Untuk Escheria coli

11